最全的动物疫病实验室检测方法

.最全常见疫病实验室检测方法目录常见疫病实验室检测方法 1目录 1常见ELISA操作方法 2亚洲1型口蹄疫抗体液相阻断 ELISA检测试剂盒 2猪瘟抗原检测试剂盒 4猪瘟病毒抗体阻断 ELISA试验 10猪瘟单抗酶联免疫吸附试验 11口蹄疫结构蛋白检测方法（ 3ABC-I-ELISA） 12口蹄疫抗体液相阻断-酶联免疫吸附试验 14PRRS抗体间接酶联免疫吸附试验 17犬细小病毒抗体酶免测定试剂盒说明书 19犬瘟热病毒抗体酶免测定试剂盒说明书 20常见PCR操作方法 22猪伪狂犬病毒PCR诊断试剂剂盒 22猪圆环病毒PCR诊断试剂盒 24常见RT-PCR操作方法 26口蹄疫病毒分子检测诊断试剂盒 26H5亚型禽流感病毒RT-PCR检测试剂盒说明书(20次) 28新城疫病毒RT-PCR检测试剂盒 30猪瘟病毒RT-PCR诊断试剂盒 32凝集、血凝实验操作方法 34弓形虫间接血凝试验(lHA)试剂使用说明书 34伪狂犬病乳胶凝集试验试剂盒 35猪细小病毒病乳胶凝集试验〈 LAT〉诊断试剂盒使用说明书 36猪传染性萎缩性鼻炎乳胶凝集试验〈 LAT〉操作程序 37猪瘟正向间接血凝试验试剂使用说明书及实验操作程序 38口蹄疫正向间接血凝试验 40高致病性禽流感血凝（HA）和血凝抑制（HI）试验程序 41琼脂扩散试验 43鸡马立克氏病 43禽流感琼脂凝胶免疫扩散试验 45荧光抗体检测 46猪瘟荧光抗体试验操作程序 46对狂犬病疑似动物脑组织的直接免疫荧光 (dFA)检测 47血清学诊断检测常用试剂配方 48禽流感HA和HI试验用溶液的配制 48补充实验 50猪流感病毒H1亚型Hl试验抗原与阴、阳性血清说明书 501/60.猪流感病毒RT-PCR检测..............................................................................................................52猪瘟病毒RT-PCR诊断试剂盒猪繁殖与呼吸综合症（Nsp21594~1680变异株）RT-PCR检测实验................................................................................................................................................54一、布鲁氏菌病试管凝集试验抗原与阴、阳性血清56二、布鲁氏菌病虎红平板凝集试验............................................................................................57动物结核病诊断操作规程............................................................................................................57常见ELISA操作方法亚洲1型口蹄疫抗体液相阻断 ELISA 检测试剂盒一试剂盒内含物.说明书 亚洲1 型口蹄疫阳性对照血清 ( 己稀释浓度为 1:8).96 孔ELISA 板 亚洲1 型口蹄疫阴性对照血清.液体稀释槽 3% 双氧水.U型96孔抗原抗体反应板 25 ×PBST洗涤液(稀释时准确量取 ).封板膜 豚鼠抗血清稀释液.灭活亚洲Ⅰ型口蹄疾病毒抗原 (用冰决包裹 ) 终止液.亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒兔抗血清 包被缓冲液(碳酸盐)胶囊.亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒豚鼠抗血清 底物(柠檬酸-磷酸盐)缓冲液片剂.兔抗豚鼠血清 IgG-辣根过氧化物酶结合物 OPD 片剂二器材准备 ( 需用户自备 )1.移液器:5-50μl移液器、0.2—10μl移液器、50—200μl移液器、50—300μl12道移液器各一把。移液枪尖(若干)。抗原抗体反应板:微量血凝板(U型、V型均可)5块,本试剂盒配备两块,用于被检血清的稀释和抗原抗体反应。注:抗原抗体反应板可重复使用,实验后,用水冲洗干净,然后用无离子水沸水浴 30秒,晾干,待用。超纯水,无离子水或蒸馏水。三、试剂准备(需用户完成)包被缓冲液(PH9.6)将本试剂盒配备的碳酸盐缓冲液胶囊 1粒小心打开,将胶囊内粉末倒入 100ml无离子水中溶解即可。 4℃存放,1月内有效。2. 洗涤液(PBST)将本试剂盒配备的 25 倍浓缩PBST液(可能有结晶形成 ,用时微热溶化 )用无离子水或蒸馏水做 1:25稀释。(如果PH降低,务必用NaOH调至7.4)底物溶液取1片柠檬酸—磷酸盐片剂 (本试剂盒配备)溶于100mL无离子水中,溶化后,取50mL2/60.溶液, 再加1片邻苯二胺(OPD)片剂,充分溶解,分装（5mL/瓶或10Ml∕瓶), 避光之-2O℃保存。 用前避光溶化 ,临时每1mL上述溶液加 10μL本试剂盒配备的 3%的双氧水(H202)。务必加双氧水!四、操作步骤用包被缓冲液稀释亚洲1型口蹄疫病毒兔抗血清至工作浓度(1:1000),在ELISA板上每孔加 50μl, 振荡, 封板或置湿盒内，室温过夜。抗原抗体(阴阳性对照血清及待检血清)反应根据不同的需要,选择图1-2中的一种布局在抗原抗体反应板上操作。图196孔酶标板检测10份样品布局图S1SSSSSSSSS1+1:32-1:41:82345678901:161：641:81:321：1281:641：2561:1281：5121:2561:10241:5121:20481:l021:40964图1为抗体滴度测定(定量)检测10份样品布局图;图2为抗体滴度测定(定量)检测20份样品布局图。图296孔酶标板检测20份样品布局图S11:32S2S3S4S5S6S7S8S9S10+1:32-1:41:641:641:81:1281:1281:2561:256S111:32S12S13S14S15S16S17S18S19S201:5121:641:10241:1281:20481:2561:4096以图1 为例, 在U型血凝板上按 50 μl/孔量用PBST将待检 血清从1:4开始做2倍连续稀释至 1:512。同时,按图示稀释阴阳性对照血清 , 然后每孔加入 50μl 用PBST稀释到使用浓度的亚Ⅰ洲型口蹄疫病毒抗原 (1:4, 即1份病毒抗原、加 3份PBST),病毒抗原对照孔加100μl。振荡混匀,封板,4℃过夜。加入病毒抗原后血清的稀释度变为从1:8开始的2倍稀释。3/60.用洗涤液(1×PBST)洗ELISA板5次,在洗水纸上甩干,再将抗原抗体混合物从抗原抗体反应板上按次序转移至ELISA板上的相对应孔,每孔50μl封板,37℃温育1小时。同上洗板5次,甩干。用豚鼠抗血清稀释液稀释亚洲1型口蹄疫病毒豚鼠抗血清至工作浓度 (1:1000), 每孔加50μl,封板,37℃温育1小时。同上洗板5次,甩干。用l×PBST稀释兔抗豚鼠酶结合物至工作浓度(1:500), 每孔加50 μl封板,37 ℃温育1 小时。同上洗板5次,每孔加50μl底物溶液(务必加双氧水),37℃温育15分钟。每孔再加50μl终止液终止反应,立即在492nm波长下读取光吸收值(OD492nm值)。五结果判定试验认可标准每块板设4孔病毒抗原对照,病毒抗原对照不加任何血清,直接用PBST稀释至使用浓度,与血清/病毒抗原复合物同步加入ELISA板孔,50μl/孔,病毒抗原对照OD492nm值应在1.5±0.5范围内。阳性对照抗体效价应在1:1024±1滴度以内,阴性对照血清抗体效价应＜1:8。病毒抗原对照平均OD492nm值50%计算(临界值)抗原对照是4孔,弃去最高和最低 OD492nm值,计算剩余2孔的平均OD492nm值,再除以2,即50%对照值。该值即为临界值，表示阻断 50%反应的对照OD492nm值。结果判定以病毒抗原对照平均OD492nm值的50%为临界值,被检血清稀释孔OD492nm值大于临界值的孔为阴性孔,小于或等于临界值的孔为阳性孔,阳性孔的OD492nm值等于临界值时所对应的稀释度为该份血清的抗体滴度。例如病毒抗原对照平均 OD492nm值为1.2,则其50%为0.60。若某一待检血清在 1:128时OD492nm值为0.6,则该份待检血清的抗体滴度为1:128。若临界值处于两个滴度之间,如处于1：64与1：128之间，则抗体滴度取中间值为1:9O。定性检测中,两个重复孔只要有一孔为阳性孔,则抗体滴度判定为1:128,两孔均为阳性孔,则判定为抗体滴度＞1:128。ELISA抗体效价≥1:128,判定为亚洲 1 型口蹄疫抗体阳性。ELISA抗体效价与保护力的关系 :牛、羊:抗体效价≥1:128,99% 保护；效价≤1:16,不保护；效价在 1:22-90之间,50%保护。猪瘟抗原检测试剂盒Classical Swine Fever Virus Antigen Test kit(CSFVAg)概 述猪瘟病毒(CSFV)、牛病毒性腹泻病毒 (BVDV)、边界病病毒 (BDV)都是瘟病毒科黄病毒属的成员。猪瘟病毒自从成为一种重要的病原体以来， 给养猪业造成了巨大的经济损失， 并引起猪的严重死亡。感染高致病力猪瘟病毒后， 猪在出现临床症状前会排出大量的病毒。耐过急性4/60.或亚急性感染的动物会产生抗体并且不再散毒 。低致病力温和病毒会造成猪的隐性感染， 病猪将会持续或间歇排出病毒直至死亡。怀孕母猪与猪瘟病毒接触后可能通过胎盘感染胎儿。先天性感染可能导致流产，木乃伊胎儿，死产和 /或弱仔及畸形胎儿。先天性感染低毒力病毒的结果是产出持续性感染的仔猪，仔猪出现免疫耐受，不表现任何症状向外排毒。猪也有可能感染 BVDV或BDV。尽管这些感染通常呈温和经过并且是自限性的， 但将它们同猪瘟病毒有效区分是很重要的。原 理本ELISA检测试剂盒是用来检测外周血白细胞、全血、细胞培养物以及组织样本中的猪瘟病毒抗原。采用双抗体夹心ELISA，将CSFV单克隆抗血清包被微量反应板，可与样品中的CSEV抗原结合。猪瘟病毒的特异性单克隆抗体形成了夹心的上层。形成的单克隆抗体 +样品+单克隆抗体夹心可以用辣根过氧化物酶标记物检测。加入与辣根过氧化物酶反应的底物，在酶的作用下形成有色产物。通过酶标仪测定其吸光度。可以用 450nm单波长或450nm与620m双波长测定各孔吸光度。试 剂本试剂盒采用 96孔板，可以一次检测 92个样品(每个样品1孔，每个对照2孔)或46个样品(每个样品2孔，每个对照2孔)；或分6次使用，每次用2个板条，设2个对照，测定6个样品(每个样品2孔)。为了检测结果的准确性，最好每个样本都设重复。试 剂 数 量1、多克隆羊抗血清包被板条 8孔×12条(96孔)2、10倍浓缩样品稀释液 (10x) 55ml足以配制550mL直接使用的1x稀释液3、10倍浓缩洗涤液 (10x) 125ml足以配制1、25L直接使用的洗涤液工作浓度 (1x)4、CSFV单克隆抗体，含防腐剂 4ml5、阳性对照，含有防腐剂 1.5ml6、阴性对照，含有防腐剂 1.5ml7、100倍浓缩辣根过氧化物酶标记物 (100x)，辣根过氧化物酶标记抗鼠 IgG，含有防腐剂 200μl8、酶标抗体稀释液 15ml9、底物液，TMB/H2O2溶液 12ml10、终止液，1MHCI(小心，强酸) 12ml5/60.注意事项1、仔细阅读并遵守操作说明；2、试剂盒试剂于 2～7℃冷藏保存。建议将浓缩的洗涤液 (10x)保存在18～25℃室温，以免形成结晶。3、所有试剂在使用前必须恢复至室温。4、未使用的包被板应该密封保存在配备的塑料袋中，于 2～7℃冷藏保存。5、不要将不同批次的说明书以及试剂盒成分混合使用。6、注意防止真菌或细菌污染试剂盒成分。处理试剂时要小心。7、不要用超过保质期的检测试剂盒。8、进行样品或试剂操作时严禁吃东西、喝水或吸烟。9、每个样品都用单独的吸头。10、每一批次的试剂必须用其配备的阴阳对照。11、配制试剂时只能用超纯水。12、不要用嘴吸取液体。13、底物溶液和浓缩的样本稀释液对眼睛、呼吸系统和皮肤有剌激性，避免与皮肤和眼睛接触。14、终止液为1MHCl，HCI为强酸并且能造成灼伤，小心处理。15、本试剂盒只能用于体外诊断。兽医专用。试剂配制1、包被的反应板、猪瘟病毒特异性单克隆抗体、阳性对照、阴性对照、底物溶液、终止液为现用试剂。2、洗涤液10倍浓缩洗涤液必须用超纯水或双蒸水进行 10倍(1：10)稀释，稀释的洗涤液于 2～7℃冷藏保存，但不能超过 3天；或冰冻保存，至少可以保存一年。例如：配制 500ml稀释的洗涤液，将450ml超纯水或双蒸水加到 50ml浓缩液中，混匀。注意：如果浓缩液有结晶，在使用前必须溶解。可将瓶子放在温水中 30分钟以上。3、样品稀释液10倍浓缩样品稀释液必须用超纯水或双蒸水进行 10倍(1∶10)稀释，但如果检测全血样品时，将适量的 10倍浓缩液与等体积的超纯水混合，制成 5倍浓缩液(5X)即可。将制备的稀释液于2～7℃冷藏保存，但不能超过 3天；或者冰冻保存，可以保存一年以上。6/60.4、辣根过氧化物酶标记物 (100x)100倍(100X)浓缩标记物在使用前必须用标记物稀释液进行 1∶100倍稀释。如果只使用部分试剂，只要用稀释液按 100倍(1∶100)稀释足够本次使用的标记物浓缩液 (旋涡振荡混勾 )即可。稀释后的标记物溶液只能保存 24小时。例如：10ml的辣根过氧化物酶标记物工作液，只需取100μl浓缩标记物(100X)加到10ml标记物稀释液中，在旋涡振荡器上混匀即可。自备器材1、精密移液器， 5μ1至1000μ12、一次性移液吸头。3、双蒸水或超纯水。4、洗瓶或自动洗板机。5、湿盒或封板胶带。6、离心机，2000xg。7、酶标仪。8、离心管和小试管。9、微量离心机， 10，000xg。10、旋涡振荡器。11、剪刀和摄子。12、0.17MNH4CI溶液，制备白细胞用。样品制备注意：制备好的样品或组织可以在 2～7℃保存7天，或-20℃冷冻保存6个月以上。但这些样品在应用前应该再次以 1，500xg离心10分钟或10，000xg离心2～5分钟。外周血白细胞取10ml肝素或EDTA抗凝血样品，1，500xg离心15～20分钟。用移液器小心吸出血沉棕黄层，加入500μl样品稀释液(1X)，在旋涡振荡器上混匀，室温下放置1小时，其间不时用旋涡器混合。然后直接进行步骤f操作；c)假如样品的棕黄层压积细胞体积非常少，那么就用整个细胞团(包括红细胞)。将细胞加进10ml的离心管，并加入5ml预冷(2～7℃，下同)的0.17MNH4CI(氯化铵)混匀，静置10分钟。用冷(2～7℃)超纯水或双蒸水加满离心管，轻轻上下颠倒混匀，1，500xg离心5分钟。弃去上清，向细胞团中加入500μl样品稀释液(1x)，用洁净的吸头悬起细胞，在旋涡振荡器上混匀，室温放置1小时。期间不时用旋涡器混合。7/60.1，500xg离心5分钟，取上清液按"操作步骤"进行检测。注意：处理好的样品可以在2～7℃冷藏保存7天，或-20℃冷冻保存6个月，但在使用前必须再次离心。外周血自细胞 (简化方法)a)取0.5～2ml肝素或EDTA抗凝血与等体积冷 (2-8℃)0.17MNH4CI加入离心管混合。室温放置10分钟。b)1，500xg离心10分钟(或10，000xg离心2－3分钟)，弃掉上清。c)用冷(2～7℃)超纯水或双蒸水加满离心管，轻轻上下颠倒混匀， 1，500xg离心5分钟。d)弃去上清，向细胞团中加入 500μl样本稀释液(1x)。旋涡振荡充分混匀，室温放置 1小时。期间不时用旋涡器混合。取 75μl按照"操作步骤"进行检测。全血(肝素或EDTA抗凝)a)取25μl10倍浓缩样品稀释液 (10X)和475μl全血加入微量离心管，在旋涡振荡器上混匀。室温下温育1小时，期间不时用旋涡器混合。此样品可以直接按照“操作步骤”进行检测。或：直接将75μl全血加入酶标板孔中，再加入 10μl5倍浓缩样品稀释液 (5X)。晃动酶标板/板条，使样品混合均匀。再按照“操作步骤”进行检测。细胞培养物移去细胞培养液，收集培养瓶中的细胞加入到离心管中。2，500xg离心5分钟，弃去上清。向细胞团中加入500μl样品稀释液(1x)。旋涡振荡充分混匀，室温放置1小时。期间不时用旋涡器混合。取此样品 75μl按照“操作步骤”进行检测。组织最好用新鲜的组织。如果有必要，组织可以在处理前于 2～8℃冷藏保存1个月。每只动物检测1～2种组织，最好选取扁桃体、脾、肠、肠系膜淋巴结或肺。a)取1～2g组织用剪刀剪成小碎块 (2～5mm大小)。将组织碎块加入10ml离心管，加入5ml样品稀释液(1x)，旋涡振荡混匀，室温下放置1～2小时，期间不时用旋涡器混合。1，500xg离心10分钟，取75μl上清液按照“操作步骤”进行检测。操作步骤注意：所有试剂在使用前应该恢复至室温18～25℃；使用前试剂应在室温条件下至少放8/60.置1小时。1、每孔加入25μlCSFV特异性单克隆抗体。此步骤可以用多道加样器(8～12道)操作。2、在相应孔中分别加入75μl阳性对照、阴性对照，各加2孔。注意更换吸头。3、在其余孔中分别加入75μl制备好的样品，注意更换吸头。轻轻拍打酶标板，使样品混合均匀。4、置湿盒中或用胶条密封后室温 (18～25℃)温育过夜。也可以放置室温温育 4个小时，但是这可降低检测灵敏度。5、甩掉孔中液体，用洗涤液 (1X)洗涤5次，每次洗涤都要将孔注满。将孔中的所有液体倒空，用力拍打酶标板，以使所有液体拍出。或者，每孔加入洗涤液 250～300μl用自动洗板机洗涤5次。注意：洗涤酶标板要仔细细心。6、每孔加入100μl稀释好的辣根过氧化物酶标记物 ，在湿盒或密封后置室温温育 1小时。7、重复操作步骤 5；每孔加入100μl底物液，在暗处室温温育 10分钟。第1孔加入底物液开始计时。8、每孔加入100μl终止液终止反应。加入终止液的顺序与上述加入底物的顺序一致。9、在酶标仪上测量样品与对照孔在 450m处的吸光值，或测量在 450nm和620nm双波长的吸光值(空气调零)。10、计算每个样品和阳性对照孔的矫正吸光值的平均值 (参见“计算方法” )。计算方法首先计算样品和对照孔的OD平均值，在判定结果之前，所有样品和阳性对照孔的OD平均值必须进行矫正，矫正的OD值等于样本或阳性对照值减去阴性对照值。矫正OD=样本OD－阴性对照OD注意：北京爱德士元亨生物科技有限公司奋进行平均值相 UN值计算并提供数据汇总的仪器和软件系统 (xChek)试验有效性判定阳性对照OD平均值应该大于 0.500，阴性对照OD平均值应小于 0.150，试验结果方能有效。否则，应仔细检查实验操作并进行重测。如果阴性对照的吸收值始终很高，将阴性对照液在微量离心机中 10，000xg离心3～5分钟，重新检测。结果判定被检样品的矫正吸光值大于或等于 0.30，则为阳性：被检样品的矫正吸光值小于 0.20，则为阴性；被检样品的矫正吸光值大于 0.20，小于0.30，则为可疑。9/60.建议根据外周血白细胞处理方案或细胞培养物处理方案进行全血样品的处理和检测。猪瘟病毒抗体阻断 ELISA试验本方法是用于检测猪血清或血浆中猪瘟病毒抗体的一种阻断 ELISA方法，通过待测抗体和单克隆抗体与猪瘟病毒抗原的竞争结合， 采用辣根过氧化物酶与底物的显色程度来进行判定。1 操作步骤在使用时，所有的试剂盒组分都必须恢复到室温 18～25℃。使用前应将各组分放置于室温至少 1小时。1.1 分别将50uL样品稀释液加入每个检测孔和对照孔中。1.2 分别将50uL的阳性对照和阴性对照加入相应的对照孔中，注意不同对照的吸头要更换，以防污染。1.3 分别将50uL的被检样品加入剩下的检测孔中，注意不同检样的吸头要分开，以防污染。1.4轻弹微量反应板或用振荡器振荡，使反应板中的溶液混匀。1.5将微量反应板用封条封闭置于湿箱中（18～25℃）孵育2小时，也可以将微量反应板用封条置于湿箱中孵育过夜。1.6吸出反应孔中的液体，并用稀释好的洗涤液洗涤3次，注意每次洗涤时都要将洗涤液加满反应孔。1.7 分别将100uL的抗CSFV酶标二抗（即取即用）加入反应孔中，用封条封闭反应板并于室温下或湿箱中孵育 30分钟。1.8 洗板（见1.6）后，分别将 100uL的底物溶液加入反应孔中，于避光、室温条件下放置10分钟。加完第一孔后即可计时。1.9 在每个反应孔中加入 100uL终止液终止反应。注意要按加酶标二抗的顺序加终止液。1.10 在450nm处测定样本以及对照的吸光值， 也可用双波长 (450nm和620nm)测定样本以及对照的吸光度值，空气调零。1.11 计算样本和对照的平均吸光度值。计算方法如下：计算被检样本的平均值 OD450（＝ODTEST）、阳性对照的平均值（＝ODPOS）、阴性对照的平均值（＝ODNEG）。根据以下公式计算被检样本和阳性对照的阻断率；ODNEG-ODTEST10/60.阻断率＝ ——————— ×100%ODNEG2试验有效性阴性对照的平均 OD450应大于0.50。阳性对照的阻断率应大于 50%。3 结果判定如果被检样本的阻断率大于或等于 40％，该样本被判定为阳性 （有CSFV抗体存在）。如果被检样本的阻断率小于或等于 30％，该样本被判定为阴性（无 CSFV抗体存在）。如果被检样本阻断率在 30～40％之间，应在数日后再对该动物进行重测。猪瘟单抗酶联免疫吸附试验（一）材料及试剂1．猪瘟单抗纯化抗原2．兔抗猪 IgG酶标抗体3．猪瘟阳性血清4．猪瘟阴性血清1～4均由指定的生物制品所购买。5．ELISA反应板6．包被液碳酸钠1.50g碳酸氢钠2.93gH2O加至1000mlpH值9.67．PBS液氯化钠8.90g、磷酸二氢钾0.20g、无水磷酸氢二钠2.13g、加双馏水1000ml8．PBS－吐温洗涤液、PBS液1000ml、犊牛血清5ml、混合即可9．底物溶液⑴0.1Mol/L柠檬酸液、柠檬酸21g、双蒸馏水加至1000ml⑵0.2Mol/LNa2HPO4液、Na2HPO4·12H2O71.6g、双蒸馏水加至1000ml⑶pH5.0磷酸盐－柠檬酸缓冲液取⑴液 24.30ml、⑵液 25.70ml混匀即可⑷邻苯二胺液取⑶液 50ml、双馏水 50ml、磷苯二胺 20mg、30%H2O20.15ml，待邻苯二胺溶化后再加H2O2，现用现配。10．终止液11/60.浓H2SO4(98%)22.2ml、H2O177.80ml（二）操作方法1．用包被液将猪瘟弱毒单抗纯化酶联抗原、猪瘟强毒单抗纯化酶联抗原各做100倍稀释，每孔包被 100μl，4℃湿盒过夜。2．次日取出，甩去孔内液体， 3×3′冲洗。3．将待检血清以 PBS液做400倍稀释，每孔加 100μl同时将猪瘟阳性血清、猪瘟阴性血清各做 100倍稀释，于对照孔中加 100μl。37℃温育1.5h～2h。4．重复第二步，取出，甩去孔内液体， 3×3′洗涤。5．将兔抗猪 IgG酶标抗体以 PBS液做100倍稀释，每孔加100μl，37℃温育1.5h～2h。6．重复第 4步。7．每孔加底物溶液 100μl，室温下观察显色反应。当阴性对照孔稍显色时，立即终止反应，并以阴性孔做空白对照。8．每孔加终止液 50μl立即于酶联免疫吸附检测仪测定 490nm波长的光密度。（三）结果判定在猪瘟弱毒酶联板上， OD≥0.2，为猪瘟弱毒抗体阳性； OD＜0.2，为猪瘟弱毒抗体阴性。在猪瘟强毒酶联板上， OD≥0.5，为猪瘟强毒抗体阳性； OD＜0.2，为猪瘟强毒抗体阴性。口蹄疫结构蛋白检测方法（ 3ABC-I-ELISA）简介口蹄疫(FMD)是一种高度接触性传染病，传播迅速，可形成世界性大流行，对养殖业和国际畜产品贸易具有严重的负面影响。控制和消灭 FMD策略包括疫苗免疫和屠宰可疑畜群。在采用疫苗的国家，大多数动物血清口蹄疫病毒 (FMDV)结构蛋白和病毒感染相关抗原(VIAA，即3D)抗体均为阳性，因此，一些基于结构蛋白和 VIAA的诊断方法很难确定口问疫病毒感染与否 。只有将感染动物和隐性带毒动物与疫苗免疫动物加以区分才能为FMD的控制和消灭提供科学的依据。日前的疫苗生产工艺，在病毒纯化过程中去除绝大部分非结构蛋白， 因此灭活疫苗免疫动物体内没有病毒非结构蛋白 3ABC抗体产生，而自然感染动物体内既有结构蛋白抗体 ，也有非结构蛋向 3ABC抗体。因此检测FMDV非结构蛋白3ABC抗体的ELISA方法不但可以检测隐性感染动物，而且可以区分感染动物和免疫动物。口蹄疫病毒非结构蛋白抗体检测试剂盒 (FMD3ABC-I-ELlSA)对感染牛的检出率很12/60.高，敏感性在 99%以上。对免疫牛的特异性在 96%以上。用途FMD3ABC-I-ELISA试剂盒检测FMDV非结构蛋白3ABC抗体。该试剂盒不受血清型影响，适用于活畜进出口调运、疫区净化检疫和群体无症状感染评价，区分感染和免疫动物。原理FMD3ABC-I-ELISA试剂盒采用间接 ELISA模式。用3ABC基因表达蛋白（ Ag）包被ELISA板，洗板封闭。检测时，加入待检血清样品，如果血清样品中有 3ABC抗体，与ELISA板上3ABC蛋白结合，形成抗原-抗体复合物，再与酶标二抗结合，加入底物后，就会出现颜色反应。如果待检样品为阴性，就不能形成抗原-抗体复合物，酶标二抗不会结合，因此就不显色。注意事项1．冰冻血清样品应充分融化，且应混和均匀。2．血清稀释液和底物应平衡至室温应用。底物A在4℃为结晶状态，需要在室温或37℃水浴化开后应用。3．最好在血清稀释板上稀释血清，以减小操作误差。4．应使用相同的加样器加样，以保证加样量的准确，减小试验误差。5．多道微量移液器所用的吸头应为同一规格和型号，避免加样误差。6．应使用自动或手动连续洗板系统洗板。7．加样先后次序应该一致，保证作用时间一样。8．底物作用时间到后，如果颜色较浅，可适当延长作用时间。9．本试剂盒只能检测一种动物的血清样本，应分别订购检测牛、猪或羊血清的试剂盒，以测定不同动物来源的血清。试剂准备l.洗涤液(PBST)将试剂盒配备的25倍浓缩PBST用无离子水或蒸馏水做l:25倍稀释即可。操作步骤1.待检血清样品和阳性、阴性对照血清用血清稀释液1:2l倍稀释(120μL血清稀释液加血清6μL)，每孔加入lOOμL，阴、阳性对照血清平行加两孔，用封口膜封口， 37℃结合30分钟。2. 取掉封口膜，每孔加满洗涤液，洗涤 5次，最后一次拍干。用血清稀释液按l:lOO比例稀释酶标二抗，每孔加入100μL，用封口膜封口，37℃结合30分钟。4. 取掉封口膜，每孔加满洗涤液，洗涤 5次，最后一次拍干。将底物A按1:50比例(体积比)稀释于底物B中(lmL底物B中加入2OμL底物A)，吹打混匀，每孔加入lOOμL，封口膜封口，37℃避光作用10～15分钟。每孔加入.100μL终止液。13/60.轻轻摇振混匀，测定波长450nm吸光值(OD450nm值)。阳性对照平均OD值应大于0.6；阴性对照平均OD值应小于0.2。结果计算:样品效价为:(OD样品-OD阴性)÷(OD阳性-OD阴性)。结果判定若效价<0.2，为阴性；效价在0.2～0.3之间为可疑；效价>0.3为阳性。可疑和阳性样品应进行复测，复测为可疑或者阳性时，应判为阳性。口蹄疫抗体液相阻断-酶联免疫吸附试验一试剂盒内含物.说明书 亚洲1 型口蹄疫阳性对照血清 ( 己稀释浓度为 1:8).96 孔ELISA 板 亚洲1 型口蹄疫阴性对照血清.液体稀释槽 3% 双氧水.U型96孔抗原抗体反应板 25 ×PBST洗涤液(稀释时准确量取 ).封板膜 豚鼠抗血清稀释液.灭活亚洲Ⅰ型口蹄疾病毒抗原 (用冰决包裹 ) 终止液.亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒兔抗血清 包被缓冲液(碳酸盐)胶囊.亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒豚鼠抗血清 底物(柠檬酸-磷酸盐)缓冲液片剂.兔抗豚鼠血清 IgG-辣根过氧化物酶结合物 OPD 片剂二器材准备 ( 需用户自备 )1.移液器:5-50μl移液器、0.2—10μl移液器、50—200μl移液器、50—300μl1214/60.道移液器各一把。移液枪尖(若干)。抗原抗体反应板:微量血凝板(U型、V型均可)5块,本试剂盒配备两块,用于被检血清的稀释和抗原抗体反应。注:抗原抗体反应板可重复使用,实验后,用水冲洗干净,然后用无离子水沸水浴 30秒,晾干,待用。超纯水,无离子水或蒸馏水。三、试剂准备(需用户完成)包被缓冲液(PH9.6)将本试剂盒配备的碳酸盐缓冲液胶囊 1粒小心打开,将胶囊内粉末倒入 100ml无离子水中溶解即可。 4℃存放,1月内有效。2. 洗涤液(PBST)将本试剂盒配备的25倍浓缩PBST液(可能有结晶形成,用时微热溶化)用无离子水或蒸馏水做1:25稀释。(如果PH降低,务必用NaOH调至7.4)3.底物溶液取1片柠檬酸—磷酸盐片剂 (本试剂盒配备)溶于100mL无离子水中,溶化后,取50mL溶液, 再加1片邻苯二胺(OPD)片剂,充分溶解,分装（5mL/瓶或10Ml∕瓶), 避光之-2O℃保存。 用前避光溶化 ,临时每1mL上述溶液加 10μL本试剂盒配备的 3%的双氧水(H202) 。务必加双氧水。四、操作步骤用包被缓冲液稀释亚洲1型口蹄疫病毒兔抗血清至工作浓度(1:1000),在ELISA板上每孔加 50μl, 振荡, 封板或置湿盒内，室温过夜。抗原抗体(阴阳性对照血清及待检血清)反应根据不同的需要,选择图1-2中的一种布局在抗原抗体反应板上操作。图196孔酶标板检测10份样品布局图S1SSSSSSSSS1+1:32-1:41:82345678901:161：641:81:321：1281:641：25615/60.1:1281：5121:2561:10241:5121:20481:l021:40964图1为抗体滴度测定(定量)检测10份样品布局图;图2为抗体滴度测定(定量)检测20 份样品布局图。图296孔酶标板检测20份样品布局图S11:32S2S3S4S5S6S7S8S9S10+1:32-1:41:641:641:81:1281:1281:2561:256S111:32S12S13S14S15S16S17S18S19S201:5121:641:10241:1281:20481:2561:4096以图1 为例, 在U型血凝板上按 50 μl/孔量用PBST将待检 血清从1:4开始做2倍连续稀释至 1:512。同时,按图示稀释阴阳性对照血清 , 然后每孔加入 50μl 用PBST稀释到使用浓度的亚Ⅰ洲型口蹄疫病毒抗原 (1:4, 即1份病毒抗原、加 3份PBST),病毒抗原对照孔加 100μl。振荡混匀,封板,4℃过夜。加入病毒抗原后血清的稀释度变为从1:8开始的2倍稀释。用洗涤液(1×PBST)洗ELISA板5次,在洗水纸上甩干,再将抗原抗体混合物从抗原抗体反应板上按次序转移至ELISA板上的相对应孔,每孔50μl封板,37℃温育1小时。同上洗板5次,甩干。用豚鼠抗血清稀释液稀释亚洲1型口蹄疫病毒豚鼠抗血清至工作浓度 (1:1000), 每孔加50μl,封板,37℃温育1小时。同上洗板5次,甩干。用l×PBST稀释兔抗豚鼠酶结合物至工作浓度(1:500),每孔加50μl封板,37℃温育1小时。6.同上洗板5次,每孔加50μl底物溶液(务必加双氧水),37℃温育15分钟。每孔再16/60.加50μl终止液终止反应 ,立即在492nm波长下读取光吸收值 (OD492nm值)。五结果判定试验认可标准每块板设4孔病毒抗原对照,病毒抗原对照不加任何血清,直接用PBST稀释至使用浓度,与血清/病毒抗原复合物同步加入ELISA板孔,50μl/孔,病毒抗原对照OD492nm值应在1.5±0.5范围内。阳性对照抗体效价应在1:1024±1滴度以内,阴性对照血清抗体效价应＜1:8。病毒抗原对照平均OD492nm值50%计算(临界值)抗原对照是4孔,弃去最高和最低 OD492nm值,计算剩余2孔的平均OD492nm值,再除以2,即50%对照值。该值即为临界值，表示阻断 50%反应的对照OD492nm值。结果判定以病毒抗原对照平均OD492nm值的50%为临界值,被检血清稀释孔OD492nm值大于临界值的孔为阴性孔,小于或等于临界值的孔为阳性孔,阳性孔的OD492nm值等于临界值时所对应的稀释度为该份血清的抗体滴度。例如病毒抗原对照平均 OD492nm值为1.2,则其50%为0.60。若某一待检血清在 1:128时OD492nm值为0.6,则该份待检血清的抗体滴度为1:128。若临界值处于两个滴度之间,如处于1：64与1：128之间，则抗体滴度取中间值为1:9O。定性检测中,两个重复孔只要有一孔为阳性孔,则抗体滴度判定为1:128,两孔均为阳性孔,则判定为抗体滴度＞1:128。ELISA抗体效价≥1:128,判定为亚洲 1 型口蹄疫抗体阳性。ELISA抗体效价与保护力的关系 :牛、羊:抗体效价≥1:128,99% 保护；效价≤1:16,不保护；效价在 1:22-90之间,50%保护。PRRS抗体间接酶联免疫吸附试验1、试剂的准备所有的试剂在使用前，必须回温到室温。洗液（10x）：1份清洗液加入到 9份灭菌水或去离子水中， 7天内用完。清洗液使用前摇匀溶解。样本稀释液（3x）：1体积的样稀释液中加入 2体积的蒸馏水或去离子水， 2天内用完。2、样本的准备17/60.阳性对照，阴性对照不必稀释，样本用样本稀释液 200倍稀释，稀释方法：取 5μl的样本加入 95μl的样本稀释液，再取稀释了 20倍的液体5μl加入到ELISA反应孔中，再加入45μl的样本稀释液。3、操作步骤将样本和对照加入到板孔中。阳性对照和阴性对照必须是双份。1. 加入50μl阳性和阴性对照，及 200倍稀释的样品在反应板孔。盖上膜，在37℃作用60分钟。去膜，用300μl的洗液洗3遍，并在吸水纸上将平板弄干（颠倒，在纸上轻敲）在每个空中加入50μl的酶标抗体。盖上膜在37℃作用60分钟。去膜，用300μl的洗液洗3遍，弄干。加入50μl的底物，轻摇板2次。将平板放在黑暗中在20-25℃作用10分钟。加入50μl终止液，轻敲平板混匀。用柔软的东西轻拭平板上的赃物，在450nm下读数并记录结果。读数A．实验成立条件阳性对照的平均值 OD450>0.6，而且阳性对照平均值 /阴性对照平均值 >4.0.结果的稀释结果用IRPC表示，以下是计算公式(OD450样品-OD450阴性对照平均值)IRPC＝[————————————————]×100ODNEGIRPCPRRS抗体说明小于或者等于20.0阴性大于20.0阳性18/60.犬细小病毒抗体酶免测定试剂盒说明书原理：本试剂盒采用间接 ELISA方法检测犬血清中犬细小病毒 IgG抗体。在聚苯乙烯微孔酶标板上,包被纯化的犬细小病毒抗原。待检血清中的CPV抗体与包被抗原特异结合,再与HRP标记的兔抗犬IgG抗体结合,形成抗原－抗体－酶标抗体复合物,加TMB底物作用显色,在酶标仪上测定OD值判定结果。试剂盒的组成(96头份):1.CPV抗原反应板12*8孔2.20倍浓缩洗液30ml*1瓶3、样品稀释液15mI*1瓶4、CPV阴性对照300μL*1支5、CPV阳性对照300μL*1支6、50倍CPV酶结合物液300μL*l支7、酶结合物稀释液15ml*1瓶8、底物液A8ml*1瓶9.底物液B8ml*1瓶10、终止液8ml*1瓶11、封板膜2张12、自封袋1个13、说明书1张试剂准备:将20倍浓缩洗液用蒸馏水稀释20倍后备用(30ml浓缩洗液+570ml蒸馏水)。2.将50倍CPV酶结合物液用酶结合物稀释液稀释 50倍后备用(300u150倍CPV酶结合物液+15m1酶结合物稀释液),轻振混匀,当日用完。操作步骤:1.待检血清在板孔外用稀释后的洗涤液作l:16倍预稀释(150uL洗涤液+10uL待检血清)备用。阴、阳性对照不稀释。记下稀释样品的对应编号,每次试验设阳性对照、阴性对照、各2孔。试剂盒平衡至室温,在反应板各孔中加入100uL样品稀释液。再分别在相应孔中加入经预稀释的待检血清 1OuL,然后在对照孔中分别加入 10uL阴、阳性对照。充分混匀后 ,贴上封板膜,置37℃温育20分钟。4.小心揭掉封板膜 ,弃去各孔中液体、拍干。每孔加满洗涤液 ,静置约30秒,如此重复洗涤5次,最后一遍拍干。每孔加入经过稀释的酶结合物液100uL,贴上封板膜,置37℃温育20分钟。操作同步骤5。每孔加入底物液A50uL,再加入底物液B50uL,轻拍混匀,置37℃避光显色10分钟。19/60.每孔加入终止液50uL,轻轻振荡,置酶标仪450nm波长处测定OD值。要求:阳性对照OD值有效范围:≥0.60。阴性对照OD值有效范围:≤0.10(阴性对照若有一孔大于0.10应舍弃,如果两孔OD值都大于0.10,应重复试验)。结果判定:1.临界值(CutOff 值)的计算:CutOff 值=(阳性对照OD平均值一阴性对照 OD平均值)×0.1+阴性对照OD平均值待检样本OD值≥临界值(CutOff值)即判为CPV抗体具有保护效价:小于临界值(CutOff值)即判为CPV抗体未达到保护效价。注意事项:1.试剂盒从冷藏环境中取出时应置室温平衡后再打开密封袋 ,未用完的微孔反应板条用自封袋加干燥剂保存。各步加液均应使用加液器并经常校对其准确性,以减少实验误差。洗涤时各孔均需加满洗涤液,防止因洗涤不充分造成非特异性显色。封板膜只限一次使用,以避免交叉污染。结果判定必须以酶标仪读数为准,且终止反应后应在10分钟以内测定其OD值。所有样品、洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。不同批次试剂不能混用。请严格按说明书操作。犬瘟热病毒抗体酶免测定试剂盒说明书原理本试剂盒采用间接 ELISA方法检测犬血清中犬瘟热病毒 IgG抗体。在聚苯乙烯微孔酶标板上,包被纯化的犬瘟热病毒抗原。待检血清中的CDV抗体与包被抗原特异结合,再与HRP标记的兔抗犬IgG抗体结合,形成抗原－抗体－酶标抗体复合物,加TMB底物作用显色,在酶标仪上测定OD值判定结果。试剂盒的组成(96头份):1、CDV抗原反应板12*8孔2、20倍浓缩洗液30ml*1瓶3、样品稀释液15mI*1瓶4、CDV阴性对照300μL*1支5、CDVF阳性对照300μL*1支6、50倍CDV酶结合物液300μL*l支7、酶结合物稀释液 15ml*1 瓶8、底物液A 8ml*1 瓶9.底物液B 8ml*1 瓶20/60.10、终止液8ml*1瓶11、封板膜2张12、自封袋1个13、说明书1张试剂准备:将20倍浓缩洗液用蒸馏水稀释20倍后备用(30ml浓缩洗液+570ml蒸馏水)。2.将50倍CDV酶结合物液用酶结合物稀释液稀释 50倍后备用(300u150倍CDV酶结合物液+15m1酶结合物稀释液),轻振混匀,当日用完。操作步骤:1.待检血清在板孔外用稀释后的洗涤液作l:16倍预稀释(150uL洗涤液+10uL待检血清)备用。阴、阳性对照不稀释 。记下稀释样品的对应编号,每次试验设阳性对照、阴性对照、各2孔。试剂盒平衡至室温,在反应板各孔中加入100uL样品稀释液。再分别在相应孔中加入经预稀释的待检血清 1OuL,然后在对照孔中分别加入 10uL阴、阳性对照。充分混匀后 ,贴上封板膜,置37℃温育20分钟。4.小心揭掉封板膜 ,弃去各孔中液体、拍干。每孔加满洗涤液 ,静置约30秒,如此重复洗涤5次,最后一遍拍干。每孔加入经过稀释的酶结合物液100uL,贴上封板膜,置37℃温育20分钟。操作同步骤5。每孔加入底物液A50uL,再加入底物液B50uL,轻拍混匀,置37℃避光显色10分钟。每孔加入终止液50uL,轻轻振荡,置酶标仪450nm波长处测定OD值。要求:阳性对照OD值有效范围:≥0.60。阴性对照OD值有效范围:≤0.10(阴性对照若有一孔大于0.10应舍弃,如果两孔OD值都大于0.10,应重复试验)。结果判定:1.临界值(CutOff 值)的计算:CutOff 值=(阳性对照OD平均值一阴性对照 OD平均值)×0.1+阴性对照OD平均值待检样本OD值≥临界值(CutOff值)即判为CDV抗体具有保护效价:小于临界值(CutOff值)即判为CDV抗体未达到保护效价。注意事项:1.试剂盒从冷藏环境中取出时应置室温平衡后再打开密封袋 ,未用完的微孔反应板条用自封袋加干燥剂保存。各步加液均应使用加液器并经常校对其准确性,以减少实验误差。洗涤时各孔均需加满洗涤液,防止因洗涤不充分造成非特异性显色。封板膜只限一次使用,以避免交叉污染。结果判定必须以酶标仪读数为准,且终止反应后应在10分钟以内测定其OD值。21/60.所有样品、洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。不同批次试剂不能混用。请严格按说明书操作。保存2－8℃储存，有效期 6个月常见PCR操作方法猪伪狂犬病毒PCR诊断试剂剂盒用途猪伪狂犬病毒 (PRV)聚合酶链反应 (PCR)试验用于检测猪血清和组织中的 PRV,适用于PRV的检测、诊断和流行病学调查。原理提取病料DNA作为模板,高温使模板的一条双链 DNA变性后形成两条单链 ,低温使引物与互补的模板形成双链 ,中温时,在TaqDNA聚合酶作用下,以dNTP为原料,以引物为复制的起点,沿模板合成一条新链 。每个循环包括 :高温变性、低温退火、适温延伸三个过程 。每一次循环使扩增的DNA片段拷贝数放大一倍。经过35次循环,使扩增的DNA片段放大了数百万倍。将扩增产物进行电泳,经溴化乙锭染色后,在紫外灯照射下,肉眼可见到DNA片段的扩增带。试剂1.试剂组成名称数量阳性对照350μLA：消化液12mlB：蛋白酶K110μLC：酚/氯仿/异戊醇混合液7mlD：异丙醇6mlE：75%乙醇12mlF：灭菌去离子水650μLJ：RT-PCR反应液200μLK：TaqDNA聚合酶25μLL:矿物油300μLM:50倍TAE电泳缓冲液(50倍稀释后使用)20mlN：溴化乙锭溶液100μLO：上样缓冲液50μL2.试剂贮藏条件 :阳性对照、B、E、J、K液(塑料袋内)于一20℃保存,其它试剂4℃保22/60.存。器材试剂盒内配有0.2mL薄壁PCR管15个。其它需要自备的物品仪器:分析天平、台式冷冻高速离心机、真空干燥器、制冰机、PCR扩增仪、电泳仪、电泳槽、紫外凝胶成像仪(或紫外分析仪)、液氮或-70℃冰箱、微波炉、组织研磨器、-20℃冰箱、可调移液器。耗材:眼科剪、眼科镊、称量纸、2OmL一次性注射器、1.5mL灭菌离心管、琼脂糖、500mL量筒、500mL锥形瓶、吸头、灭菌双蒸水。使用注意事项1.所有接触PRV病料的物品均应合理处理 ,以免PRV污染实验室。2.PCR整个试验分 PCR反应液配制区－配液区、模板提取区、扩增区、电泳区。流程顺序为配液区→模板提取区→扩增区→电泳区。严禁器材和试剂倒流。3．所有试剂应在规定的温度储存 ,使用时拿到室温下 ,使用后立即放回。4．N液具有致癌性 ,小心操作。使用 A液之前将其室温溶解为澄清透明。5.注意防止试剂盒组分受污染．使用前将红盖管 5000rpm离心15s,使液体全部沉于管底。不要使用超过有效期限的试剂,试剂盒之间的成分不要混用。严格遵守操作说明可以获得最好的结果。操作过程中移液、定时等全部过程必须精确。本试剂盒为10头份CSFVRT－PCR诊断试剂盒,应在3次以内用完。样品制备1样品采集:病死或扑杀的动物取有明显病变脏器的病变部与健康部交界处组织 :待检活动物,用注射器取血5mL,4℃保存,送实验室检测。2样品处理:每份样品分别处理。2.l组织样品处理 :称取待检病料0.lg置组织研磨器中剪碎并研磨 ,加入1mLA液继续研磨。取己研磨好的待检病料上清

100ul

加入1.5mL灭菌离心管中

,再加入500ulA液和10ulB液,混匀后,置55℃水浴中过夜。2.2全血样品处理 :待血凝后取血清放于离心管中 ,8000rpm离心5min,取血清100ul,加入500ulA液和lOulB液,混匀后,置55℃水浴中过夜。2.3阳性对照处理:混匀后取100ul,加入500ulA液和lOulB液,混匀后,置55℃水浴中过夜。2.4阴性对照处理 :取F液100ul,加入500ulA液和10ulB液,混匀后,置55℃水浴中过夜。操作步骤病毒模板DNA的提取1.1从水浴锅中取出己处理的样品,加60OulC液(用C液之前不要晃动,不要吸到C液上23/60.层保护液),用力颠倒10次混匀,1200Orpm离心lOmin。1.2取500ul上清置于灭菌离心管中 ,加入500ulD液,混匀,置液氮中3min或-70℃冰箱中3Omin。取出样品管,室温融化,1300Orpm离心15min。1.3弃上清,沿管壁缓缓滴入lmLE液,轻轻旋转一周后倒掉,将离心管倒扣于吸水纸上lmin,再将离心管50℃烘干或真空抽干 15min(以无乙醇味为准 )。1.4取出样品管,用30ulF液溶解沉淀,作为模板备用。2PCR扩增每份总体积20uL,取16uLJ液(用前混匀),2ul K液,2uL模板DNA(见1.4)。混匀,作好标记,加入L液20uL覆盖。扩增条件为94℃3min后,95℃30s,65℃30s,72℃30s循环35次,72℃延伸7min。结果1．电泳称4g琼脂糖放于500mL锥形瓶中,加入50倍稀释的M液200mL(取4mlM液用双蒸水稀释至200mL),于微波炉中熔解,再加入20uLN液混匀。在电泳槽内放好梳子,倒入琼脂糖凝胶,待凝固后将PCR扩增产物15uL混合3uLO液,点样于琼脂糖凝胶孔中,以5V/cm电压于50倍稀释的M液中电泳,紫外灯下观察结果。2结果判定PRV阳性对照出现 217bp扩增带、阴性对照无带出现 (引物带除外)时,实验结果成立。被检样品出现 217bp扩增带为PRV阳性,否则为阴性。猪圆环病毒PCR诊断试剂盒用途猪圆环病毒(PCV)的聚合酶链反应 (PCR)试验用于检测猪血清和组织中的 PCV,适用于PCV的检测、诊断和流行病学调查。原理提取病料DNA作为模板,高温使模板的一条双链DNA变性后形成两条单链,低温使引物与互补的模板形成双链 ,中温时,在TaqDNA聚合酶作用下,以dNTP为原料,以引物为复制的起点,沿模板合成一条新链。每个循环包括 :高温变性、低温返火、适温延伸三个过程。每一次循环使扩增的 DNA片段拷贝数放大一倍。经过 35次循环,使扩增的DNA片段放大了数百万倍。将扩增产物进行电泳 ,经溴化乙锭染色后 ,在紫外灯照射下 ,肉眼可见到DNA片段的扩增带。试剂1.试剂组成名称 数量A：消化液 12mlB：蛋白酶K 110μLC：酚/氯仿/异戊醇混合液 7ml24/60.D：异丙醇6mlE：75%乙醇12mlF：灭菌去离子水650μLJ：RT-PCR反应液200μLK：TaqDNA聚合酶25μLL:矿物油300μLM:50倍TAE电泳缓冲液(50倍稀释后使用)20mlN：溴化乙锭溶液100μLO：上样缓冲液50μLPCV-1阳性对照350ulPCV-2阳性对照350ul试剂贮藏条件:阳性对照、B、E、J、K液于一20℃保存,其它试剂4℃保存。器材试剂盒内配有0.2mL薄壁PCR管15个。其它需要自备的物品仪器:分析天平、台式冷冻高速离心机、真空干燥器、制冰机、PCR扩增仪、电泳仪、电泳槽、紫外凝胶成像仪(或紫外分析仪)、液氮或-70℃冰箱、微波炉、组织研磨器、-20℃冰箱、可调移液器。耗材:眼科剪、眼科镊、称量纸、2OmL一次性注射器、1.5mL经焦碳酸二乙醋(DEPC)水处理的灭菌离心管、琼脂糖、 500mL量筒、500mL锥形瓶、吸头、灭菌双蒸水。使用注意事项1．所有接触PCV病料的物品均应合理处理 ,以免PCV污染实验室。2.PCR整个试验分 PCR反应液配制区－配液区、模板提取区、扩增区、电泳区。流程顺序为配液区→模板提取区→扩增区→电泳区。严禁器材和试剂倒流。3．所有试剂应在规定的温度储存 ,使用时拿到室温下 ,使用后立即放回。4．N液具有致癌性 ,小心操作。使用 A液之前将其室温溶解为澄清透明。5．注意防止试剂盒组分受污染。使用前将红盖管 500Orpm离心15s,使液体全部沉于管底。不要使用超过有效期限的试剂,试剂盒之间的成分不要混用。严格遵守操作说明可以获得最好的结果。操作过程中移液、定时等全部过程必须精确。本试剂盒为10头份PCVPCR诊断试剂盒,应在3次以内用完。样品制备1样品采集:病死或扑杀的动物取有明显病变脏器的病变部与健康部交界处组织 :待检活动物,用注射器取血 5mL,4℃保存,送实验室检测。2样品处理:每份样品分别处理。2.l 组织样品处理 :称取待检病料 0.lg置组织研磨器中剪碎并研磨 ,加入lmLA液继续研磨。取已研磨好的待检病料上清 100uL加入1.5ML灭菌离心管中 ,再加入500uLA液和25/60.10uLB液,混匀后,置55℃水浴中过夜。2.2 全血样品处理 :待血凝后取血清放于离心管中 ,800Orpm离心5min,取血清100uL,加入500uLA液和10uLB液,混匀后,置55℃水浴中过夜。2.3 阳性对照处理 :混匀后取l00uL,加入500uLA液和10uLB液,混匀后,置55℃水浴中过夜。2.4 阴性对照处理 :取F液l00uL,加入500μLA液和10uLB液,混匀后,置55℃水浴中过夜。操作步骤病毒模板DNA的提取1.1从水浴锅中取出己处理的样品,加600uLC液(用C液之前不要晃动,不要吸到C液上层保护液),用力颠倒10次混匀,1200Orpm离心10min。1.2取500uL上清置于灭菌离心管中,加入50OuLD液,混匀,置液氮中3min或一70℃冰箱中30min。取出样品管,室温融化,13000rpm离心15min。1.3 弃上清,沿管壁缓缓滴入 lmLE液,轻轻旋转一周后倒掉 ,将离心管倒扣于吸水纸上lmin,再将离心管真空抽干或 50℃烘干15min(以无乙醇味为准 )。1.4 取出样品管,用3OuLF液溶解沉淀,作为模板备用。2PCR扩增每份总体积20uL,取16uLJ液(用前混匀),2uL K液,2uL模板DNA(见1.4)。混匀,作好标记,加入L液20uL覆盖。扩增条件为94℃3min后,94℃30s,62℃45s,72℃45s,循环35次,72℃延伸10min。结果1．电泳称2g琼脂糖放于 500mL锥形瓶中,加入50倍稀粹的M液200mL(取4mLM液用双蒸水稀释至200mL),于微波炉中熔解,再加入10uLN液混匀。在电泳槽内放好梳子,倒入琼脂糖凝胶,待凝固后将PCR扩增产物15uL混合3ulO液,点样于琼脂糖凝胶孔中,以5V/cm电压于50倍稀释的M液中电泳,紫外灯下观察结果。结果判定PCV－I阳性对照出现652bp扩增带和PCV-Ⅱ阳性对照出现1154bp扩增带、阴性对照无带出现(引物带除外)时,实验结果成立。被检样品出现652bp扩增带为PCV-I阳性,出现1154bp扩增带为PCV-Ⅱ阳性,否则为阴性。常见RT-PCR操作方法口蹄疫病毒分子检测诊断试剂盒简介口蹄疫病(FMD)是口蹄疫病毒 (FMDV)引起的偶蹄动物的一种烈性传染病 ,被国际兽医组织列为消灭和控制的 A类疫病的首位。在全世界范围内曾几度广泛流行，严重破坏26/60.畜牧业生产和动物及其产品的国际贸易 ,造成巨大的经济损失和社会政治影响。严重影响着我国畜牧业的发展 ,因此,快速、准确的诊断对控制和消灭该病有着极其重要的作用。为了提高对FMD亚临床症状、肉品等的检测我们建立了三重 RT-PCR诊断方法,适用于动物淋巴结、扁桃体、肉品及 OP液等临床样品中 FMDV的检测,能同时在同一反应管中扩增出一条以上的目的 DNA片段,该方法具有高度敏感、特异和简便的特点。用途本试剂盒采用一步法完成 RT－PCR反应。试剂盒中含有提取病毒 RNAOneStepRT－PCR反应用的全部试剂 ,可以简便而有效的检测样品。适合多血清型 (包括A、O、AsiaⅠ型)FMDV的检测。适用于动物淋巴结、扁桃体、肉品 OP液等样品检测。原理一般PCR仅应用一对引物 ,通过PCR扩增产生一个核酸片段 ,多重PCR(multiplexPCR),又称多重引物 PCR或复合PCR,它是在同-PCR反应体系里加上二对以上引物 ,同时扩增出多个核酸片段的 PCR反应,其反应原理与一般 PCR相同。试剂盒组成溶液A(TRIzoL) 20ml溶液B(二氯甲炕) 20ml溶液C(异丙醇) 10mL溶液D(RNaseFreedH20) 20mL溶液E(OneStepRNAPCR混合液) 400ml溶液F(AMVReverseTranscriptaseXL,5u/ul) l0ml溶液G(RNaseInhibitor40u/ul) 10ul溶液H(AMV..optimizedTaq,5u/ul) 10ul溶液I(阳性对照) 200ul试剂盒包,装分为A和B两部分,A部分4℃保存,B部分-20℃保存。使用方法总RNA萃取1)取500μL组织样品研磨上清液置1.5mleppendorf管中,加等量(500ul)溶液B,快速振荡数秒,8000r/min,4℃,离心5min。细胞毒、水泡液、阳性样品不经此步处理。2)取主清液200μL置1.5mLeppendorf管中,加入lOOOul溶液A,反复混匀,冰上放置5min。取阳性对照样品(l00-200μL均可),同时提时RNA。3)加200ul溶液B,小心盖上帽盖,用力摇动eppendorf管15秒,室温放置5min。4)12000r/min,4℃,离心l5min,可见分为三层,上层水相含RNA5)转移水相至一新eppendorf管,加入等量溶液C(约500μL),混匀,室温放置5min6)12000r/min4 ℃,离心lOmin,离心后在eppendorf管边和底部可见有胶样 RNA沉淀。洗RNA:弃上清,加lOOOul75%乙醇(使用前用溶液D加无水乙醇配置而成,-20℃预冷)漂洗沉淀,漂洗二次,l000r/min,4 ℃,离心5min8):室温充分干燥 RNA沉淀。加lOul溶液D,即可用于PCR扩增。可以-20℃保存备用2.一步法RT-PCR27/60.反应总体积25ul向0.2ml扩增管中加入下列反应物 :l)OneStepRNAPCR混合液:l8.5ul2)AMVReverseTranscriptaseXL( 溶液F):0.5ul3)RNaseInhibitor( 溶液G):0.5ul4)AMV-OptimizedTaq( 溶液H):0.5ul5)RNA:5ul空白对照在:以RNaseFreeDH2O代替模板,同样条件下扩增。高速离心10秒后,将反应管放入扩增仪中 ,指令设定程序开始工作。反两条件:1)50℃,30min2)94 ℃,2min3)94 ℃，50S；58℃，50S；72℃，60S；35个循环。）72℃8min结果分析和判定1）1.5%琼脂糖凝胶板的制备 称取1.5g琼脂糖,加入100mll×TAE缓冲液中。加热融化后加5μL(lOmg∕ml) 溴乙锭,混匀后倒入放置在水平台面上的凝胶盘中 ,胶板厚5mm左右。依据样品数选用适宜的梳子 。待凝胶冷却凝固后拔出梳子 (胶中形成加样孔 ),放入电泳槽中 ,加l×TAE缓冲液淹没胶面。2）加样 取6-8uLPCR扩增产物和2μL加样缓冲液混匀后加入一个加样孔。每次电泳同时上样标准 DNAMarker和空白对照。3）电泳 电压80V-100V,或电流40mA-50mA。电泳30min－4Omin4）结果观察和判定 电泳结束后,取出凝胶板置于紫外透射仪上打开紫外灯观察。强阳性样品电泳结果应为三条大小不一的条带 ,分别为634bp、483bp和278bp。如某一件检样品扩增产物的 DNA布至少有一条与以上条带大小相符 ,同时空向对照无扩增条带 ,则该样品判定为阳性。H5亚型禽流感病毒 RT-PCR检测试剂盒说明书(20次)适用范围本试剂适用于检测禽组织、鸡胚尿囊液和分泌物、排泄物棉拭子中 H5亚型禽流感病毒核酸。试剂盒组成及保存RT-PCR体系22.5ul×22管阳性对照30ul×1管上样缓冲液100ul×1管-20℃存放,不要反复冻融。有效期3个月。3准备工作3.1 提取阳RNA(根据经验选择商品化试剂或者自行配制 )；28/60.3.2RT-PCR体系，用前要先溶化，瞬时离心将液体系甩至管底。操作步骤4.1 取25ulRNA转移到RT-PCR体系管中,加入2.5ul阳性对照或者无 RNA酶水作为阳性和阴性对照,总体系25ul。4.2 置子PCR仪中,循环参数为45℃逆转录45min，94℃预变性2min,94℃30s、52℃45S、68℃45S,35个循环,最后68℃延伸8min。4.3 取5ulPCR产物,混合lul上样缓冲液,1.0%的琼脂糖凝胶电泳分析 PCR产物。以DNA分子量Marker为参考。4.4结果判定,出现372bp大小条带定为H5亚型流感病毒检测阳性 ,否则判为阴性。如果条带极弱,建议作一次复核,再次出现372bp带判为阳性,否则定为阴性。附：病料的处理:现地采集的组织脏器病抖,先进行研磨,再按照每克重量加入1mlPBS,混匀,按10-1比例稀释后用于 RNA的提取。棉拭子病料直接加入 1mlPBS,混合后取溶液用于RNA的提取,不要稀释。2)RNA的提取:根据自己实验室经验选择商品化 RNA提取试剂或自行配置。TrizolLS 提取的RNA操作过程：样品 250ul, 加750ulTrizolLS 裂解液,混合震荡5分钟(尽量保证裂解后的液体透明 )加200u1氯仿,12000转,4℃离心15分钟,取上清,加500ul异丙醇,室温沉淀10-15分钟,12000转,4℃离心15分