DNA片段扩增及DNA连接PCR讲解课件

一、PCR实验背景二、PCR基本原理三、PCR引物设计原则四、PCR反应注意事项五、常见问题与对策六、PCR的应用讲解内容

第二次实验课、DNA片段扩增及DNA连接一．实验背景

Thepolymerasechainreaction(PCR)isinventedbyK.Mullisin1985.ThistechniqueisusedtoamplifyaspecificsequenceofDNAinvitrobysimulatingthereplicationprocedureofnaturalDNAinvivo.PCRenableustounlimitedlyamplifyDNAfragments.TheNobelPrizeinChemistry1993体外扩增特异DNA片段二．PCR基本原理3’5’3’5’PCR3’5’5’3’5’5’targetsequence在模板、引物、4种dNTP和耐热DNA聚合酶存在的条件下，特异扩增位于两段已知序列之间的DNA区段的酶促合成反应。PCR仪设定的反应条件：94oC45SDNA变性55oC45SDNA复性72oC1min产物链延伸

25-30个循环后72oC10min

一般地，基因片段在500-1000bp左右时，可按下列条件进行PCR：介绍：PCR仪如果上盖加热的PCR仪，可以直接放入仪器中进行PCR；如果下面加热的PCR仪，加入2滴矿物油后，加入仪器中，不过这种仪器现在已经很少用到。PCR仪内发生的反应变性退火延伸551234522557294时间（min）温度（℃）PCR的基本原理适温延伸3高温变性1低温退火2重复1~3步25~30轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点95℃50℃引物1引物2DNA引物PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点50℃引物1引物2DNA引物72℃Taq酶Taq酶PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点95℃50℃72℃TaqTaqTaqTaqPCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72℃第2轮结束PCR产物的积累规律反应初期，目的DNA片段呈指数扩增。随着目的DNA产物逐渐积累，在引物、模板与DNA聚合酶达到一定比例时，酶的催化反应趋于饱和，此时扩增DNA片段的增加减慢进入相对稳定状态，即出现“停滞效应”，又称“平台期”。到达平台期所需PCR循环次数取决于样品中模板的拷贝数、PCR扩增效率等因素。PCR反应成功扩增的一个关键条件在于引物的正确设计。引物设计的总原则就是提高扩增的特异性，这取决于引物与模板的特异结合。PCR反应中有两条引物，即5′引物和3′引物。三、PCR引物的设计引物设计的基本原则引物的设计实例(＊)

PCR引物设计的基本原则2.引物最好在模板cDNA的保守区内设计。在NCBI上搜索该基因。通过序列同源性比较软件（比如DNAman）比对（Alignment），相同的序列就是其保守区。1.引物的方向永远是5→3引物长度一般在15~30核苷酸之间。

引物长度（primerlength）常用的是18-27bp。过短会使PCR的特异性降低；过长没有必要。引物3′端要避开密码子的第3位。因为密码子的第3位易发生不改变aa突变。3.引物3’端是DNA延伸的起点，因此一定要严格与模板DNA配对。尤其是引物3′末端连续8个碱基要求与模板严格互补。但引物的3′端最好没有连续3个G和C。否则会使引物在模板的G+C富集序列区错误配对。引物3′端最好选择T？引物3′端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异。当末位的碱基为A时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为T时，错配的引发效率大大降低，G、C错配的引发效率介于A、T之间，所以3′端最好选择T。引物3′端的从结合的角度讲最佳碱基选择是G和C。

6.引物自身及引物之间不应存在互补序列。引物内部不应存在互补序列。以避免折叠成发夹结构(Hairpin)。尤其在引物3’末端。按经验，不能有连续4(5)个碱基的互补。引物3’末端一般不达到3bp。引物间不应存在互补序列。尤其应避免3’端的互补，以免形成引物二聚体。引物二聚体及发夹结构如果不可避免的话，应尽量使其△G值不要过高（应小于4.5kcal/mol）PrimersThatFormHairpins•Aprimermaybeself-complementaryandbeabletofoldintoahairpin.•The3´endoftheprimerisbase-paired,preventingitannealingtothetargetDNA.5´-GTTGACTTGATAT3´-GAACTCTPrimersThatFormDimers•Primerpairsshouldbecheckedforcomplementarityatthe3'-end.Thisoftenleadstoprimer-dimerformationwithitselforwiththeotherprimer.•Primerdimerscanbeanexcellent,butunwanted,substratefortheTaqpolymerase.5´-ACCGGTAGCCACGAATTCGT-3´

3´-TGCTTAAGCACCGATGGCCA-5´8.引物5′端和中间△G值应该相对较高，而3′端△G值较低。△G值是指DNA双链形成所需的自由能，它反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性，△G值越大，则双链越稳定。应当选用5′端和中间△G值相对较高，而3′端△G值较低（绝对值不超过9）的引物。引物3′端的△G值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。（不同位置的△G值可以用Oligo6软件进行分析）9.扩增产物的单链不能形成二级结构。某些引物无效的主要原因是扩增产物单链二级结构的影响，选择扩增片段时最好避开二级结构区域。引物设计完成以后，应对其进行BLAST检测。如果与其它基因不具有互补性，就可以进行下一步的实验了。10.引物的碱基序列不应与非扩增区域有同源性。与模板之间的特异性结合序列一般不少于15-18bp。值得一提的是，各种模板的引物设计难度不一。有的模板本身条件比较困难，例如GC含量偏高或偏低，导致找不到各种指标都十分合适的引物；用作克隆目的的PCR，因为产物序列相对固定，引物设计的选择自由度较低。在这种情况只能退而求其次，尽量去满足条件。引物的设计实例(＊)已知IFN-cDNA序列,你该如何设计引物？atgaaatatacaagttatatcttggcttttcagctctgcatcgttttgggttctcttggctgttactgccaggacccatatgtaaaagaagcagaaaaccttaagaaatattttaatgcaggtcattcagatgtagcggataatggaactcttttcttaggcattttgaagaattggaaagaggagagtgacagaaaaataatgcagagccaattgtctccttttacttcaaactttttaaaaactttaaagatgaccagagcatccaaaagagtgtggagaccatcaaggaagacatgaatgtcaagtttttcaatagcaacaaaaagaaacgagatgacttcgaaaagctgactaattattcggtaactgacttgaatgtccaacgcaaagcaatacatgaactcatccaagtgatggctgaactgtcgccagcagctaaaacagggaagcgaaaaaggagtcagatgctgtttcaaggtcgaagagcatcccagtaaatgaaatatacaagtgaagagcatcccagtaaatgaaatatacaagt3’5’3’5’上游(5’)引物的结合CTTCTCGTAGGGTCATT下游(3’)引物的结合设计引物时:

5′引物与位于待扩增片段5′上游的一小段DNA序列相同，以信息链的互补链为模板，引导信息链的合成;

3′引物与扩增片段3′端的一小段DNA序列互补，引导互补链的合成。PCR反应扩增的就是这一对引物之间的DNA片段。答：5’引物照抄，3’引物互补倒读；酶切位点加在引物的5’；调GC含量的碱机放在最前边；此外无发夹结构、与基因组其它区域的同源性较差。atgaaatatacaagtgaagagcatcccagtaaatgaaatatacaagt3’5’3’5’上游(5’)引物的结合CTTCTCGTAGGGTCATT下游(3’)引物的结合----:ForG+CcontentSenseprimer:5’－GCAGCGGATCCATG

AAATATACAAGT－3’15bpGC=11AT=15Anti-Senseprimer:5’－ATCGGAATTCTTA

CTGGGATGCTCTTC－3’17bpBamHIstartcodonGC=12AT=15EcoRIstopcodon引物的方向是5→3：特异性序列是否少了点?通常在引物的5‘-端设计适当的限制性酶切位点引物设计软件介绍：PrimerPremier5.0顾名思义，该软件就是用来进行引物设计的。可以简单地通过手动拖动鼠标以扩增出相应片段所需的引物，而在手动的任何时候，下面显示各种参数的改变和可能的二聚体、异二聚体、发夹结构等。也可以给定条件，让软件自动搜索引物，并将引物分析结果显示出来。而且进行这些操作非常简单Oligo6.57引物分析著名软件，主要应用于核酸序列引物分析设计软件，同时计算核酸序列的杂交温度（Tm）和理论预测序列二级结构。PrimerD'Signer1.1免费的引物设计辅助软件，专门用于pASK-IBA和pPR-IBA表达载体，简化引物设计工作。四．PCR反应注意事项OptimizationofPCRcondition

＊PCR方法操作简便，但影响因素颇多。去离子水（补足反应体系）39l模板2

l10PCRbuffer（含MgCl2）5ldNTPs(10mmol/L)1l5’引物(sense10mol/L)0.5~1

l3’引物(anti-sense10mol/L)0.5~1

lTaqDNApol.(2U/l)1l

轻弹管底混合（用离心机甩一下）（一）、PCR反应体系-----finalvolume

50l加各种成分最好在冰上进行。

1.模板DNA不是越多越好：2

l

1)在一定范围内PCR产量随模板浓度的升高而显著升高，2)但模板浓度过高会导致引物无法与模板结合，反应的非特异性增加。3)一般采用102105拷贝的待扩增片段作为模板:微克水平的基因组DNA、重组质粒DNA用ng水平的量。4)模板过多还能大量消耗镁离子。Theamountoftemplate—“moreisless”.Don’taddtoomuchtemplateTemplateDNA不能含有其提取时所用试剂：提取genomicDNA的基本过程：（1）裂解细胞，消化蛋白质，抑制DNaseactivityproteinaseK＋SDS＋EDTA（2）然后用酚－氯仿多次抽提，去除蛋白质（3）用RNase去除RNA（4）用乙醇沉淀DNA，airdry,无菌水溶解。2.引物：0.5lPrimer1:OD=5PCR反应引物浓度为0.1~0.5μmol/L,引物与模板的摩尔比至少为108：1。

如此过量的引物才能确保模板DNA一旦变性就与引物退火，而不能与其自身退火。但引物浓度太高，（1）会增大引物结合到不严格配对区域的机会，这样的错配会导致非特异性产物的扩增;（2）可增加引物之间形成二聚体的几率，降低扩增效率。但如果该比例太低，PCR效率也会降低。primers引物的配制Primer1:OD=5注意：冻干品，计算一管引物的总含量或克分子数先配成100mM的浓度作为储存液工作液:10mol/L,-20℃保存。50l反应体系中加：0.5～1l,

终浓度：0.1~0.5mol/L如果需要反复应用的引物，配制后一定要分装保存，一段时间后弃掉。切记：不要将合成回来的引物一次性配成工作液！primersRT的引物选择：

Oligo(dT)15-18Specificanti-senseprimerRandomprimer因为基因序列与mRNA序列是一致的。病毒RNA作为RT模板时，一定要知道病毒是属于哪一种病毒：正链RNA病毒？负链RNA病毒？正链RNA病毒：RT引物用anti-senseprimer；负链RNA病毒：RT引物用senseprimer。ThermostableDNApolymerase3.DNA聚合酶活性：5`--3`方向的聚合酶活性。在75~80℃具有最高的聚合酶活性。半衰期：95℃，40分钟缺乏3`--5`外切酶活性。因此没有校正功能。Fidelity（保真度）：PCR反应的错配率一般为1~2X10-4AnextraA（3.1）TaqDNA聚合酶(2U/l)1l保存:在-20℃至少6个月。抑制剂:乙醇、DMSO、DMF、甲酰胺、SDS等。内源DNA污染:制备过程中残留的原细菌DNA等。会在无模板对照管出现扩增带。在50μl反应体系中加Taq:一般为0.5~2U，

TooLowConc.:lowactivity，PCR产物的量减少TooHighConc.:non-specificamplification.加各种成分最好在冰上进行。操作时先加水，最后加酶（3.2）PfuDNA聚合酶此酶耐热性极好，在97.5℃半衰期>3小时，具有35外切酶活性，催化DNA合成的忠实性比TaqDNA聚合酶高12倍。3→5proofreadingexonucleaseactivity.

withgreateraccuracy.

noextraA.（3.3）Vent-TMDNA聚合酶半衰期：100℃，95分钟97.5℃

，130分钟其扩增产物的长度可达10~13kb。活性：具有35外切酶活性，具有校对功能，错误掺入率为1/31000。忠实性比TaqDNA聚合酶提高510倍。（3.4）TthDNA聚合酶半衰期：950C，20分钟

活性：具有逆转录酶活性，可简化RT-PCR。但不具35外切酶活性，没有校对功能，催化聚合反应的错误掺入率为1/500。缓冲液含50mmol/L的KCl可促进引物退火，大于此浓度将会抑制TaqDNA聚合酶的活性。4、10XPCRbuffer5lBuffer:10-50mmol/LTris-HCl(pH8.3-8.8,20℃)。5、Mg2+：20~25mmol/L3lForTaqpolymeraseactivity.

镁离子浓度：1.5~2.0mmol/L

Concentration:tooLow:lowactivitytooHigh:non-specificamplificationTaqDNA聚合酶活性需要Mg2+。Mg2+浓度过低，会显著降低酶活性。Mg2+浓度过高又使酶催化非特异性扩增增强。当反应体系中含有高浓度的primers、dNTP、EDTA时:

•上述分子中的磷酸基团可与Mg2+结合而降低游离Mg2+浓度，从而影响TaqDNA聚合酶的活性。

•Vary[Mg2+]instepsof0.5mMWithin1.5~5.0mM;•Sometimesacompromisebetweenyieldandspecificity.dNTPs贮备液：浓度为10mmol/L。（注：dNTP具有较强的酸性，使用时应用1mol/LNaOH将pH值调至中性(7.0~7.5)。分装，－20℃存放，反复冻融会使dNTP降解。在PCR反应中，dNTPs浓度在20~200μmol/L。

dNTP浓度过高会增加非特异性配对碱机的错误掺入率。低浓度的dNTP会导致反应速度的下降，减少PCR产物量，但可提高反应的特异性及实验的精确性。4种dNTP浓度应相同:错误碱基的掺入率降至最低。1kbgene:1l;2kbgene:2l6、底物:dNTPs（脱氧核苷三磷酸）

(10mmol/L)1l（被稀释了50倍,即浓度：200mol/L）7、添加剂：DMSO（二甲基亚砜）2.5l

相当于将退火温度提高了5℃。

但>10％的DMSO会对聚合酶活性产生不良影响。加入适量二甲基亚砜（终浓度：5％）有利于引物、模板的解链，减少其二级结构，1）为什么有时候需要进行热启动？（二）、如何确定PCR的变性、退火和延伸温度和时间？热启动：TaqDNA聚合酶在DNA双链充分打开之后再加入PCR反应体系中，这样可保证模板DNA、引物变性充分，避免发夹结构或其它二级结构影响引物的退火，使引物能更加顺利地、特异性地结合到模板上。热启动结束后暂停PCR反应，在PCR仪上直接趁热加入DNApol。OptimizingthePCRReactionprogram

变性温度：一般选用94～

95

℃

。变性时间：可根据模板长短、G和C含量确定，一般采用30秒。

2）变性但过高或时间过长都会导致酶活性损失。HalflifeofTaqDNApolymerase：92.5oC2h，95oC40mins，97oC5mins.

30cycleswillneed15min

3）退火温度和时间PCR的基本流程：94oC,45sec55oC,1min72oC,2min退火温度的变化是根据引物的GC比例、引物的长度调整的。AnnealingFrom45oCto60oC.

Usuallyitisaround55℃

for1min.

退火

温度与引物序列关系非常密切，退火时间与引物长度和GC含量有关。引物长度一般在15-25bp之间。Tm=4(G+C)+2(A+T)(a)AnnealingtemperatureistoohighPrimersandtemplatesremaindissociated.(b)Annealingtemperatureistoolow.Mismatchedhybrid.(c)Correctannealingtemperature.Primingoccuresonlyatthedesiredtargetsites.Howtodecideannealingtemperature?(a)(b)(c)温度越高，特异性

(specificity)越高。温度：72℃，74℃，是Taq酶的最适工作温度。时间：根据待扩增基因片段的大小确定延伸时间。

过长会导致产物非特异性增加。酶的延伸效率：1000bp/1min。

小于500bp，一般采用1分钟即可；

500~2000bp:2min。

超过2000bp，一般可适当延长延伸时间，3分钟。

4）延伸温度和时间典型的PCR条件：94～95℃30S，55℃1min，72℃2min

25～30个cycles后72℃延伸10min。循环次数：

25～30cycles循环过多会增加碱基的错配几率。

4）循环次数总结：其他因素1）热启动：提高扩增的特异性2）添加剂：DMSO消除引物与模板的二级结构，降低DNA的解链温度，增进DNA复性时的特异配对。3）液体石蜡：防止反应液蒸发后反应成分的改变。HowbigisatargetDNA?•typicallyinthesizerange100-1500bp.•Longertargetsareamplifiable—>25kb.•Requiresmodifiedreactionbuffer,cocktailsofpolymerases,andlongerextensiontimes.五、常见问题与对策PCR常见问题之一无扩增产物---假阴性1.模板:①提取的模板核酸中含有杂蛋白质、酚、EDTA等抑制了Taq酶活性

②toomuchortoolittle

原因2.引物：①选一个好的引物合成单位。②引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，

两引物带的亮度应大体一致，如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。③引物发生降解:

引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放4℃导致引物变质降解失效。④引物设计不当:

引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。

Mg2+浓度：

浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量,甚至不出扩增条带。酶失活：①酶的失活，