重组DNA的构建、筛选及鉴定分析课件

第十章重组DNA的构建、筛选及鉴定分析1.重组DNA导入宿主细胞2.重组子的筛选3.阳性重组子的验证与分析一目的基因的获取mRNA差别显示技术在寻找新基因工作中起到积极的作用发育机理研究杂种优势机理研究二重组DNA的构建重组DNA的概念将目的基因（外源DNA分子）用DNA连接酶在体外连接到适当的载体上，即DNA分子的体外重组，这种重新组合的DNA称为重组DNA重组DNA的构建方法1．平末端分子的连接①连接效率还是很低；②连接常常破坏原有的限制性核酸内切酶识别序列，可能改变原有DNA的读码顺序；③由于平末端分子两个末端都是平的，因而在连接反应中外源DNA分子在载体中的插人方向有正反两种可能，增加了假阳性；④由于都是平末端分子，可能出现多个平末端分子串联后再插人到载体中的多片段“叠连”现象，增加了假阳性的概率2粘性末端分子的连接 相同的粘性末端，在进行连接时，这两个DNA片段在DNA连接酶作用下就可以共价地连接起来，形成重组DNA三重组DNA分子导入受体菌转化是感受态的大肠杆菌细胞捕获和表达DNA分子的基因转化方法

转导是指通过噬菌体将一个宿主的DNA转移到另一个宿主的细胞中而引起的基因重组现象显微注射技术是一种利用显微注射仪，通过机械方法把外源DNA直接注人细胞质或细胞核的基因转化方法

电转化法也称为电穿孔法在细胞上施加短暂、高压的电流脉冲，结果在质膜上形成纳米大小的微孔，DNA能直接通过这些微孔，或者在膜孔自行修复闭合时伴随膜组分的重新分布而进人细胞质中

基因枪法，又称微弹轰击法是利用高速运行的金属颗粒轰击细胞时能进人细胞内的现象，将包裹在金属颗粒表面的外源DNA分子随之带人细胞进行表达的基因转化方法。转化的目的一是大量产生重组DNA在完成连接反应后，重组DNA往往只有纳克级的量，不易操作和进一步分析二是对重组DNA进行纯化。在构建重组DNA过程中很难保证体系中不污染其他的DNA分子第二节重组子的筛选利用抗药性基因的筛选方法抗性标记直接筛选法载体DNA上携带有宿主细胞敏感的抗生素的抗性基因，pBR322质粒载体，它上面含有的氨卞青霉素抗性基因和四环素抗性基因抗性基因插入失活筛选法当用某种限制性核酸内切酶消化并在此位点插入外源目的DNA时，抗药性基因不再被表达，称为基因插入失活。因此，当此插人外源DNA的重组质粒载体转化宿主菌并在药物选择平板上培养时，根据对该药物由抗性转变为敏感这一特征，观察菌落生长状况便可筛选出阳性重组子质粒载体抗性标记筛选蓝-白筛选

β-半乳糖苷酶可被安慰诱导物IPTG（异丙基硫代半乳糖苷，与乳糖结构类似但不能被β-半乳糖苷酶降解）诱导的启动子调控之下

β-半乳糖苷酶能把培养基中无色的X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）底物分解成半乳糖和深蓝色的5-溴-4-氯-靛蓝营养缺陷互补营养缺陷型是指某菌株经突变后，丧失了合成某营养素(氨基酸，维生素，核酸等)的功能，若在培养基上培养必须添加相应的营养素才能生长如果外源基因能够实现其功能的表达,重组DNA转化到大肠杆菌宿主细胞之后，则它所表现出来的表型性状即可作为重组子筛选的标记二、快速裂解菌落鉴定重组DNA分子DNA分子由于外源目的基因片段插人到质粒载体上，所以重组质粒的相对分子量一定比非重组质粒要大核酸分子杂交检测法其基本原理是：具有一定同源性的两条核酸（DNA或RNA）单链，在一定的复性条件下，可按碱基互补原则退火形成双链分子杂交方法可分为固相液相杂交、液相分子杂交和原位杂交Northern印迹杂交该法主要针对RNA分子的检测由于RNA分子与硝酸纤维素膜结合能力相对较差一是防止单链RNA形成高级结构，故必须采用变性凝胶电泳；二是电泳过程中始终要有效抑制RNase的作用直接把菌落或噬菌斑印迹转移到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上，不必进行核酸分离纯化、限制性核酸内切酶酶切及凝胶电泳分离等操作，而是经溶菌和变性处理后使DNA暴露出来并与滤膜原位结合，再与特异性DNA或RNA探针杂交，筛选出阳性菌落或噬菌斑，即含有目的基因的重组子菌落（或噬菌斑）原位杂交菌落原位杂交技术DNA探针检测灵敏度高；标记方法简单；相对稳定，保存时间长；特异的理化性质如光就是一段与目的基因或DNA互补的特异核苷酸序列，它可以包括整个基因，也可以仅仅是基因的一部分探针的来源一种来自基因组中有关的基因本身，称为基因组探针；另一种是从相应的基因转录获得了mRNA，再通过逆转录得到的探针，称为cDNA探针。与基因组探针不同的是，cDNA探针不含有内含子序列。在体外人工合成碱基数不多的与基因序列互补的DNA片段，称为寡核苷酸探针。一般是通过分子克隆（molecularcloning）获得的。克隆是指用无性繁殖方法获得同一个体、细胞或分子的大量复制品。当制备基因组DNA探针进，应先制备基因组文库，即把基因组DNA打断，或用限制性酶作不完全水解，得到许多大小不等的随机片段，将这些片段体外重组到运载体（噬菌体、质粒等）中去，再将后者转染适当的宿主细胞如大肠肝菌，这时在固体培养基上可以得到许多携带有不同DNA片段的克隆噬菌斑，通过原位杂交，从中可筛出含有目的基因片段的克隆，然后通过细胞扩增，制备出大量的探针。

探针的制备cDNA探针，首先需分离纯化相应mRNA，在逆转录酶的作用下，就可以合成与之互补的DNA(即cDNA)，cDNA与待测基因的编码区有完全相同的碱基顺序，但内含子已在加工过程中切除寡核苷酸探针是人工合成的，与已知基因DNA互补的，长度可从十几到几十个核苷酸的片段。如仅知蛋白质的氨基酸顺序量，也可以按氨基酸的密码推导出核苷酸序列，并用化学方法合成核酸探针标记为了获得基因的杂交信号必须对目的基因进行标记。标记方法有荧光标记法、生物素标记法、同位素标记法等四免疫化学检测法噬菌斑转印到硝酸纤维膜上，各种cDNA表达并呈现在噬菌体表面的蛋白质便牢固地结合在膜上。然后将膜放入含有特异抗体的溶液中进行免疫结合反应，洗去未结合的抗体后，再与I标记的第二抗体结合,从而找出带有放射性示踪信号的斑点,进而找出对应噬菌斑,克隆扩增,提取DNA后经酶切可获目的基因。125五DNA-蛋白质筛选法

原理：外源DNA蛋白质翻译能与某一特定DNA序列结合作为探针与克隆群体杂交转译筛选法是通过体外转译的手段鉴定阳性克隆的方法，可分为杂交抑制转译和杂交选择转译两种方法转译筛选法杂交转译筛选法六亚克隆法系