血脂脂蛋白及载脂蛋白测定课件

血脂、脂蛋白及载脂蛋白测定一、血脂测定血脂测定项目

TC、TG、HDL-C、LDL-C、Lp（a）、ApoAI、ApoB等。检测项目的合理选择

临床常规血脂测定：TC、TG、HDL-C及LDL-C这四项，有条件的实验室可测定ApoAⅠ、ApoB及Lp(a)。

特殊检查项目：如Apo（AⅡ、CⅠ、CⅡ、CⅢ和E）、FFA、CETP、LPL、LCAT测定等，多用于科研或临床特殊病例研究。血脂和脂蛋白检测前应注意的问题

分析前主要影响因素有：1.生物学因素如个体间、性别、年龄和种族等。2．行为因素如饮食、肥胖、吸烟、紧张、饮酒、饮咖啡和锻炼等。3．临床因素如①疾病继发；②药物诱导4．标本收集与处理（一）血清外观分析（血清冷置试验）

混浊（TG增高）下层浊（VLDL增高）Ⅴ型下层清（VLDL正常）Ⅰ型均匀混浊（VLDL↑）TC正常Ⅳ型上层奶油样（CM↑）TC增高Ⅱa型TC正常正常人清亮（TG正常）TC↑Ⅱb，Ⅲ型空腹血清

测TC

4℃过夜

测TC（二）血清总胆固醇测定

胆固醇是人体重要的脂类成分，具有重要的生理功能，如合成类固醇激素，维生素D3胆汁酸，并构成细胞膜成分，TC包括FC（1/3）和CE（2/3），胆固醇与动脉粥样硬化有密切关系，故胆固醇测定是最常用的实验室检测项目之一。TC测定方法很多，约200多种，分为化学测定法、酶法、气相色谱法、高效液相色谱法、核素稀释质谱法（决定性方法）。1、化学测定法主要有两类（1）Liberman-Burchard反应简称L-B反应，胆固醇经冰醋酸，浓硫酸脱水生成3.5-胆烷二烯阳离子，然后被醋酐，浓硫酸氧化生成绿色的胆烷六烯磺酸。呈色稳定性差。（2）Zak反应胆固醇经冰醋酸，浓硫酸脱水生成3.5-胆烷二烯阳离子，然后在Fe3+存在下氧化生成紫红色胆烷四烯阳离子，灵敏度较L-B反应高7倍，且呈色稳定性好，但试剂腐蚀性极大，不能用于自动化分析。

2、酶法胆固醇酯胆固醇＋脂肪酸胆固醇＋O2胆烷-4-烯-3酮＋H2O2H2O2＋4AAP＋酚红色亚胺醌＋H2OCEHChODPOD

试剂中除上述三种酶外，还有胆酸钠和表面活性剂及稳定剂，胆酸钠用于激活CEH，表面活性剂促进胆固醇从脂蛋白中释放。酶法操作简便，快速，试剂无腐蚀性，适合于自动化分析，但也存在有一些不足，CEH对胆固醇水解不完全，表面活性剂影响CEH活性，黄疸血清中过高的胆红素可还原H2O2使结果偏低。（三）血清甘油三脂测定

TG是有一分子甘油与三分子脂肪酸组成的化合物，主要存在于VLDL和CM中，临床化学中往往以测定甘油代表TG的含量。TG的测定方法很多，如气相色谱法、高效液相色谱法、红外分光光度法。但上述方法需特殊的仪器设备和技术，故一般只用于研究工作中。临床实验室主要用化学法和酶法。1、化学法

基本步骤可归纳为四步（1）提取：甘油三脂的提取采用合适的溶剂，使脂蛋白变性提取TG，同时去除干扰物质(磷脂、游离甘油、葡萄糖等),常用方法有：1）异丙醇抽提，沸石合剂（沸石、高岭土）吸附。2）异丙醇抽提，氧化铝吸附磷脂。3）正壬烷、异丙醇、稀硫酸分溶抽提，免去吸附磷脂的操作，后用价廉的正庚烷代替正壬烷。应用较广。

（4）显色：显色测定甲醛。常用方法有：1）甲醛与变色酸（4.5-二羟-2.7-萘二磺酸）在硫酸溶液中加热生成紫红色化合物。（570nm）2）甲醛与乙酰丙酮在氨的存在下缩合成黄色的3.5-二乙酰-1.4-二氢-2.6-二甲基吡啶。（420nm）2、酶法

常用的有：（1）磷酸甘油氧化酶法（GK-GPOD-POD法）

TG＋H2O甘油＋FA甘油＋ATP3-磷酸甘油＋ADP3-磷酸甘油＋O2磷酸二羟丙酮＋H2O2

H2O2＋4-AAP＋酚红色亚胺醌＋H2O

试剂较稳定，灵敏度高，线性范围宽，胆红素、维生素C可消耗H2O2使结果偏低。LPLGK

GPOD

POD

（2）乳酸脱氢酶法（GK-PK-LDH法）TG＋H2O甘油＋FA甘油＋ATP3-磷酸甘油＋ADPADP＋磷酸烯醇式丙酮酸ATP＋丙酮酸丙酮酸＋NADH＋H+乳酸＋NAD+

（3）甘油氧化酶法第一步消除血清中原有的甘油：

LPLGPOD

PKLDH

【参考范围】0.56～1.70mmol/L【临床意义】血清TG一般随年龄增长而升高，体重超标者往往偏高。1.病理性增高原发性高脂蛋白血症、肥胖症、糖尿病、肾病综合症、脂肪肝、妊娠后期。2.病理性降低甲亢、肾上腺皮质功能减退、严重肝功能损伤。

(四)血清（浆）脂蛋白测定1、血清脂蛋白电泳临床实验室常用的支持介质有醋酸纤维薄膜和琼脂糖凝胶。（1）血清脂蛋白醋酸纤维薄膜电泳以醋酸纤维薄膜为支持介质，血清脂蛋白经电泳分离，然后用臭氧氧化，使脂蛋白中的不饱和脂肪酸的双键断裂生成醛，再用亚硫酸品红染色，即生成紫红色区带。（2）血清脂蛋白预染琼脂糖电泳

血清脂蛋白经饱和苏丹黑B预染后，以琼脂糖凝胶为支持介质，进行电泳分离，即可得到清晰的兰色区带。凝胶浓度一般为0.5%，超过1%，β-Lp与preβ-Lp不易分开，＜0.5%，凝胶机械强度太低。血清：染料为9：1，染料过多稀释标本，而且染料中乙醇会引起蛋白质变性，影响分离效果。

2、血清高密度脂蛋白测定常以测定HDL-C含量代表HDL水平。测定步骤包括①HDL的分离；②测定HDL中胆固醇。HDL的分离方法有：超速离心法、凝胶过滤法、免疫化学法、电泳法、沉淀法。临床实验室常用沉淀法。沉淀剂一般为二价阴离子和多价阴离子。如：肝素-Mg2+、硫酸葡聚糖-Mg2+、磷钨酸-Mg2+、聚乙二醇（PEG）等。

如：磷钨酸-Mg2+选择性地沉淀血清中的LDL和VLDL，经离心上清液中保留HDL，然后用酶法测定上清液中的胆固醇含量，即代表HDL中的胆固醇。【参考范围】男1.28±0.33mmol/L女1.37±0.33mmol/L【临床意义】HDL-C与冠心病发病呈负相关，HDL-C低于0.9mmol/L是冠心病危险因素。3、血清高密度脂蛋白亚组分测定HDL有三个亚类（HDL1、HDL2、HDL3）最近的研究工作表明，HDL2亚类与冠心病危险度的相关程度比总HDL-C更密切。HDL2

d=1.063～1.125g/mlHDL3

d=1.125～1.210g/mlHDL2脂类60%蛋白质40%；HDL3脂类45%蛋白质55%【原理】用PEG做沉淀剂，以不同浓度的PEG在不同pH条件下分别将VLDL和LDL（沉淀剂Ⅰ95g/LPEG，pH6.5）HDL2（沉淀剂Ⅱ170g/LPEG，pH7.5）沉淀，上清液中只含有HDL（沉淀剂Ⅰ）和HDL3（沉淀剂Ⅱ），然后用酶法测定HDL-C和HDL3-C，并以HDL-C减去HDL3-C的差即为HDL2-C的含量。

【参考范围】HDL2-C男0.53±0.17mmol/L女0.62±0.22mmol/LHDL3-C男0.75±0.17mmol/L女0.75±0.16mmol/L4、低密度脂蛋白测定低密度脂蛋白水平通常以LDL-C含量表示。LDL-C测定方法很多，常用的有：（1）Friedewald公式法

LDL-C＝TC－HDL-C－或在一般情况下能得到可被临床接受的近似结果，但TG＞4.25mmol/L时不能应用此公式计算，否则结果偏差太大。TG2.2TG5mg/dlmmol/L【参考范围】120～180mg/L【临床意义】Lp（a）动脉粥样硬化、冠心病的独立危险因素，与动脉粥样硬化成正相关。血清Lp（a）浓度＞300mg/L时，其冠心病的发病率高于健康人的2～5倍。血清Lp（a）水平主要决定于遗传，个体间Lp（a）水平差异很大，但同一个体血浆Lp（a）水平的变化较小，环境、饮食、药物对它的影响不明显。（五）血清载脂蛋白AⅠ及B测定

脂蛋白中的蛋白质部分称为载脂蛋白（apolipoprotein，Apo），可分为A、B、C、D、E、F、G、H八类，其中ApoA，B，C还有亚类。

ApoAⅠ是HDL的主要蛋白质，占HDL蛋白质的85%左右，它的血清浓度可代表HDL水平，ApoB是LDL的主要蛋白质，占LDL蛋白质的97%左右，ApoB浓度主要反映LDL水平。

Apo的测定方法主要有三类：①层析分离，然后再按一般蛋白质定量；②电泳分离后经染色光密度扫描定量；③各种免疫分析法。层析法操作麻烦，一般只用于研究；电泳法简便灵敏，但各类Apo染色性能不一致，重复性不好；免疫法特异性好，灵敏度