基因操作中大分子的分离和分析-08级课件

第二章

基因操作中大分子的分离和分析一、DNA的分离、检测和纯化二、RNA的分离、检测和纯化一、DNA的分离、检测和纯化1、DNA的组成与结构2、DNA分子的重要特性3、染色体DNA的分离和纯化4、大肠杆菌质粒DNA的分离和纯化5、DNA的琼脂糖凝胶电泳1、DNA的组成和结构Watson---美国生物学家,曾获1962年诺贝尔生理学-医学奖

Crick---英国生物物理学家,曾获1962年诺贝尔生理学-医学奖1953年Watson和Crick建立了DNA分子的双螺旋模型.发表在《Nature》formconditionBaseturnRatpairHeightpairdiameterBrh92~95低Na+1036°3.38Ǻ19ǺArh75,高Na+RNA-DNA1132.7°2.56Ǻ23ǺZ富含G-C高K+1230°3.71Ǻ18Ǻ几种DNA构型比较DNA双螺旋结构模型变性(denaturation）:指在温度、pH等因素作用下，DNA分子的氢键受到破坏，双链分开的过程。复性（renaturation)：是变性的逆过程，DNA互补配对成为双链的过程。带电性：一般pH下，带负电荷，可电泳分离。水溶解性：DNA分子外形成水膜，可溶于水；但当电荷变化（如等电点）或水膜破坏时，就会沉淀，这是提取和分离DNA的依据。2、DNA分子的重要特性3、染色体DNA的分离和纯化真核、原核生物均有，103~106kb用于分离目的基因或基因表达调控因子（启动子（promoter））提供构建染色体载体和染色体基因整合平台细胞裂解：关系到能否提取到DNA以及影响DNA得率高低和质量的关键步骤

细胞裂解缓冲液

100mmol/LTris-HCl,pH8.0100mmol/LEDTA250mmol/LNaCl

防止和抑制内源DNase对DNA的降解

分离和抽提DNA：根据待提取的DNA的性质，使其与细胞内的其他组分分离。提取总DNA只须在细胞裂解液中加入适当的酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)或氯仿/异戊醇(24:1)等有机溶液，可使DNA与蛋白质分开。用乙醇或异丙醇处理含DNA的水相，使其沉淀，离心获得DNA碱裂解法提取E.coli质粒DNA的原理

由Birnboim和Doly设计并于1979年发表。

在碱性条件下(pH12.0~12.5)线状DNA发生变性，质粒DNA维持环状。在高盐条件下作复性处理，变性的染色体DNA会形成沉淀，从而将质粒DNA与染色体DNA分开。抽提/裂解缓冲液

溶液Ⅰ：灭菌后，4℃保存

50mmol/L葡萄糖

25mmol/LTris-Cl(pH8.0)10mmol/LEDTA(pH8.0)

溶液Ⅱ：现用现配，室温下使用(pH12.0~12.5)0.2mol/L

NaOH1%SDS

溶液Ⅲ：灭菌后，4℃保存，用时冰浴(pH4.6)5mol/L乙酸钾60ml

冰醋酸11.5ml

水28.5ml

溶液Ⅰ∶溶液Ⅱ∶溶液Ⅲ=1∶2∶1.5质粒DNA的纯化用苯酚/氯仿抽提去蛋白质杂质

一般先按1:1（V:V）用苯酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)对DNA粗制品进行抽提，然后用1:1（V:V）氯仿/异戊醇(24:1)再次抽提，以除去蛋白质

用无水乙醇沉淀浓缩DNA

按2:1用无水乙醇（V:V）或1:1用异丙醇（V:V）在酸性条件下（加1/10体积的3MNaAcpH5.2）沉淀DNA。

用RNase去除RNA

Bio-Rab电泳仪电源水平电泳槽和一些梳子DNA泳动方向溴化乙锭(EB)能掺入到双链DNA中，在紫外光下会发出橙红色的荧光。使用浓度：0.5μg/ml紫外线波长：254nm

302nm366nmDNA泳动方向是从负极向正极.一般使用的电压为5V/cm.琼脂糖凝胶Marker---DNA分子标尺DNA点样孔1000bp2500bp5000bp15000bp1000bp8000bp线性DNA分子开环DNA分子二、RNA的分离、检测和纯化

1、RNA的组成与结构特性2、RNA的抽提和纯化3、mRNA的纯化4、RNA的检测5、RNA的电泳检测1、RNA的组成与结构特性mRNA:1~5%rRNA:80~85%(28S、18S和5S)tRNA/microRNA:15~20%2、RNA的抽提和纯化溶液和用具的去RNA酶处理

RNA酶非常耐高温，即使高温灭菌也不可完全清除其活性。耐热的物品：高温干热灭菌效果最好。微量移液吸头和离心管：0.1%焦炭酸二乙酯(DEPC)处理过的水浸泡后在高温灭菌。电泳用具：专用！用3%H2O2和0.1%DEPC水浸泡，清洗干净。3、mRNA的纯化

真核生物mRNA的3′端有一个poly(A)尾，可用亲和层析的方法纯化。(oligo(dT)-纤维素)

作用：构建真核生物的cDNA文库。复习内容（P100~107）本章所讲的知识点在随后的实验课中均会涉及，希望同学们课后认真复习！1、试验中所使用各种试剂的作用2、从核酸中