DNA浓度测定课件

实验一质粒DNA的提取及浓度测定目的与要求通过质粒的一些特性、质粒DNA的提取、测定，学习用碱变性法提取质粒DNA，了解用分光光度计测定DNA含量的方法。2.相关知识及原理质粒(Plasmid)：独立于染色体外的，能自主复制且稳定遗传的遗传因子。是一种环状的双链DNA分子。存在于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中，在细菌细胞中最多。细菌质粒:细菌质粒是用的最多的质粒类群，其大小从1K-200Kb，它们复制时利用宿主细胞复制自身染色体的同一组酶系。

载体(Vector)：用于携带重组DNA，并且能够使外源DNA一起复制与表达的质粒(运载工具)。具备的条件：易于鉴定；在受体细胞中可以独立复制；易于筛选；易于导入受体细胞。质粒结构：抗性基因（Antibioticresistancegene,suchasAmpicillinresistancegene,Kanamycineresistancegene)启始复制子（ori,Originofreplication)；多克隆位点(MSC,Multiplecloningsiteorpolylinker)；标记基因(Markergene,suchasLacZgene)。SDS是一种阴离子表面活性剂，它既能使细菌细胞裂解，又能使一些蛋白质变性，所以SDS处理细菌细胞后，会导致细菌细胞壁的破裂，从而使质粒DNA以及基因组DNA从细胞中同时释放出来。释放出来的DNA遇到强碱性（NaOH）环境，就会变性。然后，用酸性乙酸钾来中和溶液，使溶液处于中性，质粒DNA将迅速复性，而染色体DNA，由于分子巨大，难以复性。离心后，质粒DNA将在上清中，而染色体DNA则与细胞碎片一起沉淀到离心管的底部。通过这种方法即可将质粒DNA从细菌中提取出来。细菌裂解的方法：

碱裂解法：0.2molNaOH+1%SDS煮沸裂解法:沸水煮沸40秒SDS裂解法：10%SDS,一般用于质粒大量提取。DNA浓度的测定：测定DNA浓度的方法有两种，即利用分光光度计法测定DNA的紫外光吸收值；另一种方法是测定样品中溴化乙锭发射的荧光的强度来计算核酸的含量。溴化乙锭荧光强度法：当DNA含量很低以及样品中杂质含量高时，会影响紫外光吸收值的测定，这时，可以采用测定嵌入DNA中溴化乙锭分子受紫外光激发而发射出的荧光强度，因为这种荧光的强度与DNA总质量数成正比。3.材料与试剂材料:含有质粒pCMV-Myc-T10的大肠杆菌DH5α。pCMV-Myc是一种哺乳细胞表达载体，它含有一个N端c-Myc尾，常用于免疫反应的检测和蛋白纯化以及作为诱饵蛋白检测酵母双杂交结果。Suitablehoststrains:DH5a,HB101,andothergeneralpurposestrains.Selectablemarker:plasmidconfersresistancetoampicillin(100mg/ml)toE.colihosts.E.colireplicationorigin:pUCCopynumber:~500

InsertEcoR1Xho11.9kbpCMV-Myc-T10溶液1－GET缓冲液：50mmol/L葡萄糖，10mmol/LEDTA，20mmol/L20mMTris-HClpH8.0，100g/mlRNasA4oC保存。溶液2－0.2mol/LNaOH,1%SDS溶液3－乙酸钾溶液(3M,pH=4.8)：60mL的5mol/LKAc,11.5ml冰醋酸，28.5mLH2OTE缓冲液:10mmol/L，Tris-HCl,1mmol/L，EDTA，pH8.0,100%乙醇，70％乙醇培养细菌：将带有质粒的大肠杆菌接种到液体培养基，37℃培养12～16小时;取液体培养液1.5-3ml于Eppendorf管中，10000r/min离心1min，去掉上清液，加入100l溶液1，充分混匀;加入200l新配制的0.2mol/LNaOH(内含1％SDS)，加盖颠倒6-7次使之混匀，冰上放置5min;质粒小量提取的方法：加入150l乙酸钾溶液(pH4.8)，加盖后颠倒6-7次混匀，冰上放置5－15min;用台式高速离心机，10000r/min离心7min，上清移入另一干净离心管，并加1ml100％乙醇混匀，12000r/min离心5min，弃去上清液;沉淀用70％乙醇清洗一次，小管倒置于吸水纸上，除尽乙醇，室温自然干燥;加入30-50l灭菌蒸馏水或TE缓冲液溶解提取物，室温放置15-30min，使DNA充分溶解(有时需要酚:氯仿抽提);将分离出的质粒DNA置于-20℃保存备用。

CellResuspensionSolution

50mMTris-HCl(pH7.5)10mMEDT100µg/mlRNaseACellLysisSolution

0.2MNaOH1%SDSNeutralizationSolution

1.32Mpotassiumacetate(pH4.8)ColumnWashSolution

80mMpotassiumacetate8.3mMTris-HCl(pH7.5)40µMEDTA55%ethanolTEbuffer(1X)10mMTris-HCl(pH7.5)1mMEDTA注意：用移液器（俗称“枪”）操作时，每一步都要格外小心，以免切碎DNA(包括质粒DNA和基因组DNA);加入溶液II和III后，一定不要剧烈振荡，避免导致基因组DNA的断裂而污染质粒DNA！！！CarefullyremovealloftheclearedlysatefromeachminiprepandtransferittothebarreloftheMinicolumn/syringeassemblycontainingtheresin.Nomixingisrequired.Carefullyinsertthesyringeplungerandgentlypushtheslurryintotheminicolumn.DetachthesyringefromtheMinicolumnandremovetheplungerfromthesyringebarrel.ReattachthesyringebarreltotheMinicolumn.Pipet2mlofColumnWashSolution(aftertheadditionofethanol)intothebarreloftheMinicolumn/syringeassembly.InserttheplungerintothesyringeandgentlypushtheColumnWashSolutionthroughtheMinicolumn.RemovethesyringeandtransfertheMinicolumntoa1.5mlmicrocentrifugetube.CentrifugetheMinicolumnat10,000×ginamicrocentrifugefor2minutestodrytheresin.TransfertheMinicolumntoanew1.5mlmicrocentrifugetube.Add50µlofnuclease-freewatertotheMinicolumnandwait1minute.Centrifugeat10,000×ginamicrocentrifugefor20secondstoelutetheDNA.TheDNAwillremainintactontheMinicolumnforupto30minutes;however,promptelutionwillminimizenickingofplasmidsintherangeof20kb.RemoveanddiscardtheMinicolumn.Followthesestoragerecommendations:DNAisstableinwaterwithoutadditionofabufferifstoredat–20°Corbelow.DNAisstableat4°CinTEbuffer.TostoretheDNAinTEbuffer,add5µlof10XTEbuffertothe50µlofelutedDNA.B.用分光光度计法定量DNA取2l提取的质粒DNA，加入98l蒸馏水对待测DNA样品做1:50(或更高倍数的稀释);蒸馏水作为空白,在波长260nm、280nm处调节紫外分光光度计读数至零。加入DNA稀释液，测定260nm

及280nm的吸收值。260nm

读数用于计算样品中核酸的浓度，OD260值为1相当于约50g/ml双链DNA，3