实验一二三四-DNA重组技术课件

质粒提取限制性内切酶酶切琼脂糖凝胶电泳核酸的体外连接胶回收

碱裂解法小量制备质粒DNA

一．实验目的及背景

质粒是染色体外的DNA分子，大小可为1kb到200kb。大多数来自细菌的质粒是双链、共价闭合环状的分子，以超螺旋形式存在。它是细菌内的共生型遗传因子。其复制和遗传独立于细菌染色体，但复制和转录依赖于宿主编码的蛋白和酶。本实验目的本实验要求掌握最常用的质粒的提取方法。分离质粒DNA方法从大肠杆菌中分离质粒DNA方法众多，目前常用的碱变性法；煮沸法；SDS法；

各方法分离是依据宿主菌株类型、质粒分子大小、碱基组成及结构等特点加以选择的，其中碱变性法既经济且收得率较高,提取的质粒DNA可用于酶切,连接与转化。1.溶菌酶2.碱裂解：

SDS,NaOHpH12.0-12.53.中和：

pH4.8醋酸钠

溶菌，释放DNA蛋白质、DNA变性中和、质粒DNA复性碱变性法基本原理碱变性法基本原理在pH12.0-12.6碱性环境中，线性的大分子量细菌染色体DNA变性，而共价闭环质粒DNA仍为自然状态。将PH调至中性并有高盐浓度存在的条件下，染色体DNA之间交联形成不溶性网状结构，大部分DNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍为可溶状态，通过离心可除去大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质，质粒DNA尚在上清中，再进一步纯化质粒DNA。

７．加入700μl70%乙醇，１２000g离心1分钟。8.重复79.１２000g离心2分钟10．加入50μl洗脱液至吸附膜中央，１２000g离心1分钟。11．取10μlDNA溶解液加2μlLoadingbuffer于1%琼脂糖电泳。12．电泳凝胶在透射式紫外检测仪上观察。注意事项

1.菌浓度，OD值2.P1充分重悬菌体沉淀3.P2裂菌时间不超过5min，动作温和。4.洗涤后充分离心一．实验目的及背景

核酸限制性内切酶是一类能识别双链ＤＮＡ中特定碱基顺序的核酸水解酶，这些酶都是从原核生物中发现，它们的功能犹似高等功物的免疫系统，用于抗击外来ＤＮＡ的侵袭。限制性内切酶以内切方式水解核酸链中的磷酸二酯键，产生的ＤＮＡ片段５’端为Ｐ，３’端为ＯＨ。限制酶根据限制酶的识别切割特性，催化条件及是否具有修饰酶活性可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三大类。Ⅰ类和Ⅲ类限制性内切酶，在同一蛋白分子中兼有甲基化作用及依赖ATP的限制性内切酶活性。Ⅰ类限制性内切酶结合于特定识别位点，且没有特定的切割位点，酶对其识别位点进行随机切割，很难形成稳定的特异性切割末端。Ⅲ类限制性内切酶在识别位点上切割，然后从底物上解离下来。故Ⅰ类和Ⅲ类酶在基因工程中基本不用。Ⅱ型酶Ⅱ型酶就是通常指的ＤＮＡ限制性内切酶.它们能识别双链ＤＮＡ的特异顺序，并在这个顺序内进行切割，产生特异的ＤＮＡ片段；Ⅱ型酶分子量较小，仅需Mg2+作为催化反应的辅助因子，识别顺序一般为４～６个碱基对的反转重复顺序；Ⅱ型内切酶切割双链ＤＮＡ产生３种不同的切口－－５’端突出；３’端突出和平末端。正是得益于限制性的内切酶的发现和应用，才使得人们能在体外有目的地对遗传物质ＤＮＡ进行改造，从而极大地推动了分子生物学的兴旺和发展。２．ＤＮＡ：作为内切酶底物，ＤＮＡ应该具备一定的纯度，其溶液中不能含酚、氯仿、乙醚、SDS、EDTA、高盐浓度、酒精等，这些因素的存在均不同程度影响限制性内切酶的活力。这种抑制可通过：增加酶作用单位数（10~20U/ugDNA）、增大反应体积以稀释可能的抑制剂或延长反应时间加以克服。３．反应缓冲液：反应缓冲液主要由Tris·HCl、NaCl、Mg2+组成，其中Mg2+为内切酶辅基；Tris·HCl维持反应体系pH值在7.2-7.6之间；NaCl浓度不同形成３种级别的离子强度：低盐（10mMNaCl)中盐（50mMNaCl）高盐（100mMNaCl）不同的内切酶选择特定的反应缓冲液。４．酶解温度与时间：大多数限制酶反应温度为３７℃，如EcoRⅠ,HindⅢ,BamHⅠ,PstⅠ等，也有如BclⅠ需在５０℃下进行反应，反应时间根据酶的单位与ＤＮＡ用量之比来定。一般２小时即可充分酶解。

２．将反应体系充分混匀，并于台式离心机上短暂离心。３．Eppendorf管于３７℃水管中反应２小时。４．反应结束后加入Loadingbuffer终止反应。５．取１5μl于１％琼脂糖凝胶上电泳。６．紫外透射仪上检查实验结果。琼脂糖凝胶电泳原理

1.DNA、RNA的多核苷酸链中的磷酸基团呈离子化状态，带负电.磷酸戊糖重复性决定了迁移速率取决于分子的大小和构型.2.不同浓度的琼脂糖凝胶介质分离分子量大小不同的DNA片断3.EB显色!!!琼脂糖凝胶电泳试剂1、

5×TBE（5倍体积的TBE贮存液）配1000ml5×TBE：Tris54g硼酸27.5g0.5mol/lEDTA20ml（pH8.0）2、

凝胶加样缓冲液（6×）溴酚蓝0.25%蔗糖40%3、

琼脂糖4、

溴化乙锭溶液（EB）0.5μg/ml注意事项合适的凝胶浓度正确的电泳方向琼脂糖凝胶电泳胶回收步骤1.切胶,称重2.溶胶3.过柱4.洗涤5.洗脱注意事项

大肠杆菌感受态细胞

的制备和转化

一．实验目的及背景

转化(Transformation)是将外源DNA分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段。所谓感受态，就是细菌吸收转化因子的生理状态。学习大肠杆菌感受态细胞的制备方法，并通过转化的方法导入DNA。

实验原理在进行基因克隆时，体外构建的DNA重组子必须导入合适的受体细胞，才可以复制，增殖和表达。载体与外源目的基因构成的重组载体可以通过转化直接导入受体细胞，从而实现基因在异源细胞的表达。进行转化时，要求细胞处于容易吸收外源DNA的状态，即感受态，重组分子才能进入细胞内。通过CaCl2

处理的大肠杆菌细胞就是一种感受态细胞。在0℃冷冻处理时，处于CaCl2低渗溶液中的大肠杆菌细胞膨胀成球形。DNA可吸附于其表面。在短暂的热冲击下，细胞吸收外源DNA，然后在丰富培养基内复原并增殖，表达外源基因。带有选择标记基因的外源载体在受体细胞内可表达时，受体细胞表现标记基因的表型，使转化子与非转化子在选择培养基上区分开来。材料、试剂及器具

1、

材料E.coliDH5α转化产物2、

试剂（1）0.1mol/LCaCl2（灭菌）。（2）LB液体培养基、固体培养基。（3）氨苄青霉素（Amp）：用无菌水配制成100mg/mL溶液，置-20℃冰箱保存。3、器具（1）超净工作台。（2）恒温水浴锅。（3）恒温摇床、培养箱。

操作步骤

感受态细胞的制备

从大肠杆菌DH5α的培养平板上挑取一个单菌落接于

2mLLB液体培养基的试管中，37℃振荡培养过夜。

↓

以1%的接种量将以上过夜培养物接种于液体培养基中

↓

37℃振荡培养2～3h

↓

将菌液转移到1.5mL离心管中，冰上放置10min

↓

4000rpm，离心10min回收细胞

↓

用冰冷的0.1mol/LCaCl21mL，悬浮沉淀

↓

立即放在冰上保温30min

↓

4℃，4000rpm，离心10min，回收细胞

↓

用冰冷的0.1mol/LCaCl20.1mL悬浮细胞（务必放冰上）

↓

分装细胞，每100μl一份。此细胞为感受态细胞质粒/连接产物的转化在100μl新鲜配制的感受态细胞中加入连接产物，↓冰上放置30min↓将管放到42℃循环水浴热冲击90s↓取出，迅速冰浴2min↓每管加400μlLB液体培养基，37℃慢摇复苏40min↓3000rpm，离心5min回收细胞

↓吸弃450μl上清后，轻轻重悬细胞，全部铺平板，待菌液干燥后倒置培养皿，于37℃培养过夜↓次日观察，并记录转化情况，计算转化率（