实验1DNA提取纯化检测-jgh课件

实验一真核细胞染色体DNA的分离、纯化和检测

实验目的通过实验学习从血液中制备染色体DNA的方法。学习琼脂糖凝胶电泳，检测DNA的纯度、DNA的构型、含量以及分子量的大小。掌握DNA样品的纯化和定量检测方法。红细胞裂解液裂解红细胞细胞裂解液裂解白细胞用蛋白酶K水解蛋白质有机溶剂酚、氯仿抽提在高盐条件下，用乙醇沉淀DNA再用70%乙醇洗除沉淀中的盐分即可获得染色体DNA基因组提取实验原理纯净的DNAA260/A280=1.8，制备的DNA样品应该为1.7~1.8纯净的RNAA260/A280=2.0，制备的RNA样品应该大于2.0如果制备的DNA样品A260/A280<1.7，说明样品中含酶和蛋白质过高，应将样品用酚、氯仿、异戊醇抽提，再用乙醇沉淀DNA；A260/A280>2，说明样品中RNA过高，可用RNase消化后，用酚、氯仿、异戊醇抽提，再用乙醇沉淀DNA；如果样品A260/A280为1.8~2.0，说明样品中盐的含量过高，样品沉淀后应用70%乙醇多洗一遍。提取的RNA样品A260/A280应大于1.80。RNA样品含有蛋白质会使A260/A280比值下降。DNA浓度测定实验原理实验材料红细胞裂解液KHCO31g(10mM)NH4Cl8.3g(155mM)EDTA·Na237mg(0.1mM)

裂解缓冲液（lysisbuffer）10mMTris-Cl(pH8.0)0.1MEDTA(pH8.0)0.5%(m/v)SDSACD抗凝液柠檬酸0.48g柠檬酸钠1.32g右旋葡萄糖1.47g加水至100ml,使用时每6ml新鲜血液加1mlACD液组织细胞动物血液样品，将20ml新鲜血液与3.5mlACD抗凝液混匀，0℃下保存数天或-70℃下长期冻存，备用。酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）70%乙醇TEbufferRNAse琼脂糖TAE电泳缓冲液电泳设备紫外分光光度计凝胶成像系统实验材料染色体DNA的制备方法1.取800μl抗凝血液置于5ml离心管中。2.往管中加3ml红细胞裂解液，轻摇数次，置冰上5分钟，期间间歇摇动几次。3.4000rpm，室温离心5分钟，弃上清。4.往管中加入3ml红细胞裂解液，重悬沉淀，冰上5分钟，期间摇几次。5.4000rpm，离心5分钟，弃上清。6.重复步骤4、5四至五遍，至出现明显白色沉淀。将残余红细胞弃去，留下白色沉淀。7.用1×PBS3ml洗涤所得沉淀。8.4000rpm，离心5分钟，弃上清。9.每管中加入500μl白细胞裂解缓冲液（每小组配制1ml)，重悬细胞，加入20μlproteinaseK（20mg/ml），混匀后转移至1.5ml离心管，置55℃水浴1小时。琼脂糖凝胶电泳方法

1.选择合适的电泳仪和水平式电泳槽，调节电泳槽平面至水平，检查稳压电源与正负极的线路。2.将电泳板置于制胶器中或用玻璃胶带封好制胶板两端，防止浇板时出现渗漏。选择孔径大小适宜的点样梳，垂直架在电泳板负极的一端，使点样梳底部电泳板水平面的距离为0.5-1.0mm。3.制备琼脂糖凝胶：按照被分离DNA分子的大小，决定凝胶中琼脂糖的百分含量。称取琼脂糖，溶解在电泳缓冲液中，大电泳槽约160毫升，小电泳槽约35毫升凝胶液，置微波炉或水浴锅中加热，至琼脂糖全部溶化。4.待凝胶溶液冷至50℃左右时，在凝胶溶液中加入EB（终浓度0.5μg/ml），摇匀，轻轻倒入电泳板上，除去气泡。5．待凝胶冷却凝固后（约30分钟），在电泳槽内加入电泳缓冲液，大电泳槽约需1200ml，小电泳槽约180ml。从制胶器取出电泳板，放入电泳槽，然后小心取出点样梳，保持点样孔的完好，去除空内气泡。6．待测的DNA样品中，加五分之一体积的溴酚蓝指示剂点样缓冲液（6×loadingBuffer）。如果待测样品太小要用电泳缓冲液稀释，再加五分之一体积的溴酚蓝指示剂点样缓冲液。如点样体积10μl样品与2μl溴酚蓝指示剂点样缓冲液，混匀后小心地进行点样，记录点样顺序和点样量。7．打开电源，DNA的迁移速度与电压成正比，与琼脂糖含量有关。最高电压不超过5V/cm(大电泳槽不超过200V，小电泳槽不超过150V)。8．电泳时间看实验的具体要求而定，在电泳途中可用紫外灯直接观察，DNA各条条带分开后，可以结束电泳。一般20分钟~2小时，取电泳凝胶块直接用凝胶成像系统成像和分析。琼脂糖凝胶电泳方法DNA制备注意事项

1.如要11步中完整的DNA,在12步时，挑出DNA沉淀，用70%乙醇洗涤1-2次。2.步骤2、4、7中要颠倒摇动试管悬浮沉淀，不可用枪头（尤其是没剪去枪头尖端）吹打沉淀。3.步骤10中吸上清枪头使用前必须粗吸头（微量移液枪的枪头剪去尖端，并用火烧一下，使之圆钝），避免机械剪切力对DNA链的损伤。4.为了获得高分子量的DNA，操作中必须防止混匀、抽提及沉淀时剧烈机械震荡造成的DNA的断裂。5.如含有RNA,可用100ng/ml的RNase在37℃水解半小时。对于新血液，取ACD或EDTA抗凝，10ml全血中加3.3mlACD或1mlEDTA。电泳注意事项

1.琼脂糖的质量：琼脂糖（agarose）是以质量较好的琼脂作原料制成的。琼脂是由琼脂糖和琼脂胶组成的复合物。琼脂胶是一种含有硫酸根和羟基的多糖。它具有离子交换性质，这种性质将给电泳带来电渗作用的不良影响，因而必须去除干净。所谓琼脂糖的质量不过关就是琼脂糖内含有较高比例的琼脂胶。琼脂糖是一种直链多糖，它由D-半乳糖和3，6-脱水-L-半乳糖的残基交替排列组成的线性多聚糖。由于链状琼脂糖分子相互以氢键交联，因此与琼脂一样能形成凝胶。琼脂糖带有亲水性，不含有带电荷的基因，不引起DNA变性，又不吸附被分离的物质，因此它是一种很好的凝胶剂。2.DNA分子的迁移率：影响DNA分子在电泳中的迁移率的因素是多方面的，除了决定于DNA分子大小与构型外，还有琼脂糖的浓度、电压大小、缓冲液pH值和电泳时的温度等。为了精确测定其分子量的大小，采用一下措施：(1)每次测定时，要有已知分子量的DNA片段作为标准，进行对照。电泳。(2)选择最合适的电泳条件。(3)提高分子筛效应，降低电荷效应。电泳注意事项

DNA定量检测注意事项测定光吸收值时，用稀释DNA样品的溶液做对照。选择稀释要适当