PCR引物设计与Primer-Premier-使用介绍

PCR引物设计与Primer_Premier_使用介绍第一页，共42页。主要内容PCR介绍引物设计原理引物设计的优化原则PrimerPremier5.0介绍举例说明引物的设计第二页，共42页。PCR介绍1、什么是PCR2、PCR的组成3、如何提高PCR成功率（定量，对照）第三页，共42页。引物设计原理引物设计的目的是为了找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。引物设计总体上包含三个程序：序列下载，同源性比较，引物设计筛选。第四页，共42页。第五页，共42页。引物设计的原则1、引物长度大多数应用的最短引物长度为18个核苷酸。如果期待的产物长度等于或小于500bp，选用短的(16～18)的引物；若产物长5kb，则用24个核苷酸的引物。有人用20～23个核苷酸引物得到40kb的产物。第六页，共42页。引物设计的原则2、引物GC含量GC含量在40%－60%之间，以45-55％为宜。这可为有效退火提供足够热。第七页，共42页。引物设计的原则3、引物Tm引物所对应模板序列的Tm值最好72℃左右。至少要在55－80℃之间。Tm=2(A+T)+4(C+G)第八页，共42页。引物设计的原则4、引物3’端引物3’末端和模板的碱基完全配对防止一对引物内的同源性考虑末端5个碱基的ΔG引物3′端要避开密码子的第3位第九页，共42页。引物设计的原则5、引物序列与模板序列组成的相似性

可能的错误引发位点决定于引物序列组成与模板序列组成的相似性，相似性高则错误引发率高。第十页，共42页。引物设计的原则6、最好在模板cDNA的保守区内设计

DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列就是该基因的保守区。第十一页，共42页。引物设计的原则7、引物自身及引物之间不应存在互补序列

引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹结构（Hairpin）使引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。第十二页，共42页。引物设计的原则8、碱基要随机分布

引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错误引发（Falsepriming）。第十三页，共42页。引物设计的原则9、引物应具有特异性

引物设计完成以后，应对其进行检测。如果与其它基因不具有互补性，就可以进行下一步的实验了。第十四页，共42页。引物设计的原则10、ΔG值

ΔG值(自由能)反映了引物与模板结合的强弱程度。一般情况下，引物的ΔG值最好呈正弦曲线形状，即5’端和中间ΔG值较高，而3’端ΔG值相对较低，且不要超过9（ΔG值为负值，这里取绝对值），如此则有利于正确引发反应而可防止错误引发。第十五页，共42页。引物设计的原则11、引物的5′端

引物的5′端可以修饰，而3′端不可修饰，引物5′端修饰包括：加酶切位点、标记生物素、荧光、地高辛等；引入蛋白质结合DNA序列；引入点突变、插入突变、缺失突变序列；引入启动子序列等。第十六页，共42页。引物设计的原则12、在DNA测序和PCR中最好用5′末端稳定(如GC含量较多)，而3′末端不太稳定(如AT含量较多)的引物

第十七页，共42页。PrimerPremier5.0简介主要功能:1、即引物设计2、限制性内切酶位点分析3、DNA基元(motif)查找4、同源性分析第十八页，共42页。PrimerPremier5.0使用介绍PreimerPremier启动界面Loadsequence第十九页，共42页。基本信息SequencenameOriginalsequenceUsethesetwobuttontotranslatetheDNAseqtoaproteinseqoraproteinseqtoaDANseq8种密码子偏好Chooseafunction第二十页，共42页。引物设计界面FirstyoucandesigntheprimermanuallySensestrandoranti-sensestrandUsefulinformationoftheprimer第二十一页，共42页。引物搜索选项设定引物类型搜索模式5’引物位置范围3’引物位置范围产物大小范围引物长度第二十二页，共42页。搜索结果28对引物引物分值100分为满分每对引物的信息双击选中一对引物第二十三页，共42页。引物信息回到主窗口引物及产物信息是否出现hairpin,dimer,falseprimingandcrossdimer第二十四页，共42页。一对理想的引物应当不存在任何一种上述结构，因此最好的情况是最下面的分析栏没有But…第二十五页，共42页。引物编辑第二十六页，共42页。引物编辑EditprimerhereAnalysistheeditresultAccepttheeditresultReturntothemainwindow第二十七页，共42页。任务用绿色荧光蛋白(GFP)标记蛋白NR1举例说明第二十八页，共42页。SPBamHIpcDNA3.1NR1Plasmid1:Plasmid2GFP第二十九页，共42页。SPBamHI(GGATCC)pcDNA3.1NR1-1aGFP第三十页，共42页。121ggggctcctagagaacccgggggcgcttgaccgcgcgcgggcggcccgcgggtcgtacat181cgcgaggtcgtcgcactcgcgcaacccagagccaggcccgctgtgcccggagctcatgag241caccatgcacctgctgacattcgccctgcttttttcctgctccttcgcc

cgcgcggatcc301cgaccccaagatcgtcaacatcggcgcggtgctgagcacgcgcaagcatgaacagatgtt361ccgcgaggcagtaaaccaggccaataagcgacacggctcttggaagatacagctcaacgc421cacttctgtcacccacaagcccaacgccatacagatggccctgtcagtgtgtgaggacct481catctctagccaggtctacgctatcctagttagccacccgcctactcccaacgaccactt541cactcccacccctgtctcctacacagctggcttctacagaatccctgtcctgggactgac601tacccgaatgtccatctactctgacaagagtatccacctgagtttccttcgcacggtgcc661gccctactcccaccagtccagcgtctggtttgagatgatgcgagtctacaactggaacca721catcatcctgctggtcagcgacgaccacgagggacgggcagcgcagaagcgcttggagac781gttgctggaggaacgggagtccaaggcagagaaggtgctgcagtttgacccaggaaccaa

NR1的编码序列(~4000bp)红色为信号肽,蓝色为BamHI酶切位点,下划线标出酶切位点的阅读框第三十一页，共42页。ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCTTCGGCTACGGCCTGCAGTGCTTCGCCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCTACCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAAGFP序列(~700bp)第三十二页，共42页。引物要求PCR扩增GFPGFP两边添加BamHI酶切位点保证NR1的阅读框不改变第三十三页，共42页。5’ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC…………TCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA3’3’TACCACTCGTTCCCGCTCCTCG……………AGAGCCGTACCTGCTCGACATGTTCATT5’GFP序列5’ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC…………TCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA3’

3’TACCACTCGTTCCCGCTCCTCG……………CGTACCTGCTCGACATGTTCATT5’Primer1:5’ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC…………………..AGAGCCGTACCTGCTCGACATGTTCATT5’Primer2Primer1:5’ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC…………..Primer2:5’TTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAGA…….Primer1:5’ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC…………..Primer2:5’CTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAGA…….第一步：扩增GFP基本序列变性,引物复性第三十四页，共42页。第二步：GC比值；Tm值Primer1:5’ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA…………..Primer2:5’CTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAGA…….Primer1:5’ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA（GC:60%,Tm：64）Primer2:5’CTTGTACAGCTCGTCCATGCC（GC:57%,Tm：66）第三十五页，共42页。第三步：酶切位点Primer1:5’ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA（GC:60%,Tm：64）Primer2:5’CTTGTACAGCTCGTCCATGCC（GC:57%,Tm：66）BamHI:ggatccPrimer1:5’ggatccATGGTGAGCAAGGGCGAGGAPrimer2:5’ggatccCTTGTACAGCTCGTCCATGCC第三十六页，共42页。第四步：阅读框atgagcaccatgcacctgctgacattcgccctgcttttttcctgctccttcgcc

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