酶工程原理及应用酶的生物合成及发酵生产

酶工程原理及应用酶的生物合成及发酵生产第1页，共190页，2023年，2月20日，星期三第二章酶的生物合成及发酵生产一、酶的生物合成基本原理二、常见的酶生物合成体系三、酶发酵工艺控制第2页，共190页，2023年，2月20日，星期三酶的生产方法提取分离法(Extraction)生物合成(Biosynthesis)化学合成(chemicalsynthesis)SOD-bloodPapain-PapayaChymotrypsin-Pancrea……organ/tissue/cellAmylasefromBacillusProteasefromBacillusPhosphatasefromBacillusGlucoamylasefromAspergillus……PlantcellcultureAnimalcellcultureFewexample第3页，共190页，2023年，2月20日，星期三天然菌种大规模发酵基因克隆重组工程菌分子生物学重组体系构建发酵工艺选择优化发酵工艺选择优化自然界快速筛选第4页，共190页，2023年，2月20日，星期三一、酶的生物合成基本原理第5页，共190页，2023年，2月20日，星期三Reversetranscription1、中心法则-CentralDogma第6页，共190页，2023年，2月20日，星期三Replication复制：亲代DNA或RNA在一系列酶的作用下，生成与亲代相同的子代DNA或RNA的过程。Transcription转录：以DNA为模板，按照碱基配对原则将其所含的遗传信息传给RNA，形成一条与DNA链互补的RNA的过程。Translation翻译：亦叫转译，以mRNA为模板，将mRNA的密码解读成蛋白质的AA顺序的过程。Reversetranslation逆转录：以RNA为模板，在逆转录酶的作用下，生成DNA的过程。第7页，共190页，2023年，2月20日，星期三2、RNA的生物合成(转录)细胞内RNA的生物功能(1)在某些RNA病毒中，其所含的双链RNA作为遗传信息的载体。(2)在蛋白质的生物合成过程中，各种RNA起着重要的作用。其中，tRNA作为氨基酸载体，并由其上的反密码子识别mRNA分子上的密码子；mRNA作为蛋白质合成的模板，由其分子上的三联体密码控制蛋白质分子中氨基酸的排列顺序；rRNA与蛋白质一起组成核糖核蛋白体（核糖体），作为蛋白质生物合成的场所。(3)某些RNA具有生物催化活性，属于核酸类酶，在一定条件下，可以催化有关的生化反应。(4)各种小分子RNA在分子修饰和代谢调节等方面有重要作用。第8页，共190页，2023年，2月20日，星期三转录过程的特点1、转录的不对称性：在RNA的合成中，DNA的二条链中仅有一条链可作为转录的模板，称为转录的不对称性。反义链antisensestrand（无意义链，负链）：在RNA的转录中，用作模板的DNA链称为反义链。有义链codingstrand（编码链，正链）：在RNA的转录中，不作为模板的DNA链称为有义链。2、转录所需酶：依赖DNA的RNA聚合酶又称为转录酶，是以DNA为模板的一类RNA聚合酶。在原核生物和真核生物中，转录酶有所不同。原核生物的转录酶比较简单，由1种RNA聚合酶催化所有RNA的生物合成。而在真核生物中RNA聚合酶有3种，分别为RNA聚合酶Ⅰ、RNA聚合酶Ⅱ和RNA聚合酶Ⅲ，它们都属于寡聚酶，酶的亚基数目为4～10个，亚基种类有4～6种。第9页，共190页，2023年，2月20日，星期三转录过程起始位点的识别recognition转录起始initiation链的延伸elongation转录终止termination转录后加工modification第10页，共190页，2023年，2月20日，星期三TheE.coliRNApolymeraseholoenzymeconsistsofsixsubunits:a2bb’s.PossiblecatalyticsubunitsPromoterspecificityEnzymeassembly,promoterrecognition,activatorbindingRoleunknown(notneededinvitro)36.5kDa15115511kDa(32-90kDa)第11页，共190页，2023年，2月20日，星期三第12页，共190页，2023年，2月20日，星期三3、蛋白质的合成(翻译)翻译:以RNA中mRNA为模板,按照其核苷酸顺序所组成的密码指导蛋白质的合成的过程.mRNA蛋白质翻译

各种信息

各种蛋白质（核苷酸排列顺序）（氨基酸排列顺序）第13页，共190页，2023年，2月20日，星期三基因在原核和真核细胞中最终得到表达原核真核第14页，共190页，2023年，2月20日，星期三原料氨基酸，20种mRNA是合成蛋白质的“蓝图（或模板）”tRNA是原料氨基酸的“搬运工”rRNA与多种蛋白质结合成核糖体,作为合成多肽链的“装配机（操作台）”(1)蛋白质的翻译系统第15页，共190页，2023年，2月20日，星期三蛋白质翻译系统示意图第16页，共190页，2023年，2月20日，星期三mRNA是遗传信息的载体（载有遗传密码，geneticcode），是合成蛋白质的蓝图（模板），它以一系列三联体密码子（codon）的形式从DNA转录了遗传信息。每个密码子代表一个氨基酸。mRNA占细胞总RNA的5-10%，不稳定，寿命短。原核的mRNA是多顺反子;真核的mRNA是单顺反子。信使RNA(mRNA)第17页，共190页，2023年，2月20日，星期三第18页，共190页，2023年，2月20日，星期三遗传密码上世纪60年代，利用均聚核苷酸实验，破译了遗传密码。遗传密码为三联体（每三个碱基代表一个氨基酸），由5’到3’阅读，无间断。即使在少数重叠基因（如病毒）中，其开放阅读框架（openreadingframe,ORF）仍按此原则。起始密码为AUG,终止密码为UAA，UAG和UGA。

5’AUG

CCA

UGC

ACC

CGG

GUU…………..CAA

UAG3’ProCysThrArgVal…………..Gln

密码有简并性（degeneracy），即一个氨基酸可由几个密码子表示；通用性，大多数生物使用同样的遗传密码，但也会有所偏爱。第19页，共190页，2023年，2月20日，星期三第20页，共190页，2023年，2月20日，星期三第21页，共190页，2023年，2月20日，星期三原核tRNA有30-40种，真核有50-60种，含70-90个核苷酸，并有多种稀有碱基。tRNA是最小的RNA，占细胞总RNA的15%左右，其功能是搬运氨基酸和解读密码子。tRNA具有“四环一臂”和“三叶草”形的典型结构。注意：3’端CCA氨基酸受位和反密码子环转运RNA(tRNA)第22页，共190页，2023年，2月20日，星期三tRNA的结构—“四环一臂”倒L形的三级结构第23页，共190页，2023年，2月20日，星期三酪5’5’3’AUGGUUUACACA酪氨酰-tRNA反密码mRNA密码(codon)与反密码(anticodon)的碱基配对tRNA的功能是解读mRNA上的密码子和搬运氨基酸。tRNA上至少有4个位点与多肽链合成有关：即3’CCA氨基酸接受位点、氨基酰-tRNA合成酶识别位点、核糖体识别位点和反密码子位点。每一个氨基酸有其相应的tRNA携带,氨基酸的羧基与tRNA的3’CCA-OH以酯键结合。而tRNA的反密码子可以与mRNA上相应的密码子互补结合,以使氨基酸正确“对号入座”（因为密码子的序列对应于多肽链上的氨基酸序列）。第24页，共190页，2023年，2月20日，星期三变偶性或摆动性——反密码子5’端的碱基与密码子的第三位配对不严格第25页，共190页，2023年，2月20日，星期三核糖体是rRNA与几十种蛋白质的复合体，有大、小两个亚基构成。含有合成蛋白质多肽链所必需的酶、起始因子（IF）、延伸因子（EF）、释放因子（RF）等。rRNA只有4-5种，但占细胞RNA的大部分。原核的核糖体（70S）=30S小亚基+50S大亚基30S小亚基:16SrRNA+21种蛋白质50S大亚基:23S，5SrRNA+34种蛋白质真核的核糖体（80S）=40S小亚基+60S大亚基40S小亚基:18SrRNA+33种蛋白质60S大亚基:28S，5.8S，5SrRNA+45种蛋白质核糖体（ribosome）与核糖体rRNA第26页，共190页，2023年，2月20日，星期三图为原核生物的两种RNA:16SrRNA和5SrRNA的结构第27页，共190页，2023年，2月20日，星期三核糖体的结构第28页，共190页，2023年，2月20日，星期三核糖体有4个基本功能1.容纳mRNA，并能沿着mRNA由5’-3’移动，由tRNA解读其密码；2.氨基酰位点（A位点），可结合氨基酰-tRNA（AA-tRNA）；3.肽酰基位点（P位点），可结合肽酰基-tRNA（肽-tRNA）；4.脱氨基酰tRNA的出口位(E位点);5.肽酰基转移酶中心，是形成肽键的位点等。第29页，共190页，2023年，2月20日，星期三肽链合成的起始initiation肽链合成的延伸elongation肽链合成的终止与释放terminationandrelease合成多肽的输送和加工transportandmodification蛋白质分子的折叠folding(2)蛋白质的生物合成过程第30页，共190页，2023年，2月20日，星期三氨基酸活化生成氨酰-tRNA第31页，共190页，2023年，2月20日，星期三翻译起始时，第一个氨基酸一般是甲硫氨酸，其氨基要甲酰化成为甲酰甲硫氨酸，予以保护。甲酰FH4甲酰基MettRNAfmetfMet-tRNA合成酶fMet-tRNA氨基酸与tRNA的连接方式第32页，共190页，2023年，2月20日，星期三原核生物肽链合成的起始阶段是在GTP和起始因子（InitiationFactor）的参与下，核糖体30S亚基，fMet-tRNAF，mRNA和50S亚基结合，组成起始复合物的过程。主要包括5个步骤：（1）30S亚基与起始因子IF3结合；（2）30S亚基与mRNA结合，形成30S-IF3-mRNA复合物；（3）fMet-tRNAF与起始因子IF2以及GTP结合，生成fMet-tRNAF-IF2-GTP；（4）在起始因子IF1的参与下，fMet-tRNAF-IF2-GTP与30S-IF3-mRNA结合生成30S起始复合物。在此30S起始复合物中，fMet-tRNAF上的反密码子正好与mRNA上的起始密码子AUG结合；（5）50S亚基与上述30S起始复合物结合，形成完整的70S核糖体。同时放出IF1，IF2，IF3，并使GTP水解生成GDP和Pi。在此70S核糖体形成时，fMet-tRNAF位于70S核糖体的“P”位（肽酰基位），而它的“A”位（氨酰基位）是空位。蛋白质合成起始第33页，共190页，2023年，2月20日，星期三

新的氨基酸-tRNA的进位依赖Tu-Ts因子和GTP的协助

氨酰基tRNA进入A位第34页，共190页，2023年，2月20日，星期三

肽键的形成由肽酰基转移酶催化（此酶具有核酶的活性）肽键的形成第35页，共190页，2023年，2月20日，星期三原核生物肽链的延长

核糖体沿着mRNA5’——3’方向移位，多肽链沿着N端向着C端延伸，须有EF-G因子和GTP参与，空载的tRNA从E位点离开第36页，共190页，2023年，2月20日，星期三进位转位成肽第37页，共190页，2023年，2月20日，星期三合成终止氨基酸进位，肽链形成和延伸，核糖体沿着mRNA的5’—3’方向移位，循环往复，新合成的肽链由N端向着C端不断延长，直至mRNA上出现终止密码，相应的肽链释放因子RF1（对应UAA、UAG），RF2（对应UAA、UGA）占据A位。肽链的合成终止，并从核糖体上释放。核糖体大、小亚基解聚，并进入下一轮合成。第38页，共190页，2023年，2月20日，星期三高效率的蛋白质合成体系多个核糖体结合在同一条mRNA上，由5’—3’进行翻译，形成多核糖体（polyribosome），以提高翻译的效率第39页，共190页，2023年，2月20日，星期三(3)多肽链的修饰和加工(1)N—端修饰原核生物修饰时是由肽甲酰基酶除去甲酰基，多数情况甲硫氨酸也被氨肽酶除去，真核生物中甲硫氨酸则全部被切除。(2)多肽链的水解切除水解切除其中多余的肽段，使之折叠成为有活性的酶或蛋白质。如酶原激活(3)氨基酸侧链的修饰氨基酸侧链的修饰包括羟化、羧化、甲基化及二硫链的形成等。(4)糖基化修饰糖蛋白是细胞蛋白质组成的重要成分。它是在翻译后的肽链上以共价键与单糖或寡聚糖连接而成。糖基化是在酶催化下进行的。第40页，共190页，2023年，2月20日，星期三分泌型蛋白质在翻译过程中通过信号肽协助转入内质网的机制信号肽（signalpeptide）是在新生的多肽链中，可被细胞识别系统识别的特征性氨基酸序列，在蛋白质翻译过程中或翻译后的定位发挥引导的作用。第41页，共190页，2023年，2月20日，星期三蛋白质的空间结构如何形成？功能与结构如何统一？体外、体内的结构如何变化？蛋白质分子设计及蛋白质工程的需要生物信息学技术的应用越来越多的基因工程产物需要复性复活,要求蛋白质折叠的理论及技术的指导。基因工程重组蛋白类产物必须要形成正确的折叠才能表现出功能和活性。蛋白质的折叠第42页，共190页，2023年，2月20日，星期三4、酶生物合成的调节(regulation)基因水平的表达控制酶含量的调节操纵子（operon）：是一组功能上相关，受同一调控区控制的基因组成的一个遗传单位。第43页，共190页，2023年，2月20日，星期三ABEX底物水平的调节酶水平的调节

酶活性的调节酶含量的调节酶的定位调节辅助因子调节生长发育的不同时期外界环境变化酶合成与分解速度的变化（基因表达调控）产物调节细胞内酶的调控模式第44页，共190页，2023年，2月20日，星期三酶在细胞内的含量取决于酶的合成速度和分解速度。细胞根据自身活动需要，严格控制细胞内各种酶的合理含量，从而对各种生物化学过程进行调控。酶浓度调节的化学本质是基因表达的调节。在细胞内，所合成的酶的种类及数量是由特殊的基因信息决定的。DNA所携带的酶蛋白遗传信息，需要通过转录和翻译而合成酶蛋白。在细胞内进行的转录或翻译过程都有特定的调节控制机制，其中转录的调控占主导地位。因此，基因表达的调控主要在转录水平上进行。第45页，共190页，2023年，2月20日，星期三酶合成诱导的现象—JacobandMonod的工作：已知分解利用乳糖的酶有：-半乳糖苷酶；-半乳糖苷透过酶；硫代半乳糖苷转乙酰酶。实验：

1.大肠杆菌生长在葡萄糖培养基上时，细胞内无上述三种酶合成；

2.大肠杆菌生长在唯一碳源乳糖培养基上时，细胞内有上述三种酶合成；当换成葡萄糖培养基时，三种酶基本消失；

3.表明菌体生物合成的经济原则：需要时才合成。

本世纪三十年代，H.Karstrom在对糖代谢过程中的某些酶的合成进行研究时提出：诱导酶与组成酶某些代谢物可以诱导某些酶的合成，是通过促进为该酶编码的基因的表达而进行的，这种现象叫做酶合成的诱导。能诱导酶合成的物质叫诱导物。被诱导合成的酶叫诱导酶。第46页，共190页，2023年，2月20日，星期三酶合成阻遏的现象—JacobandMonod的工作：实验：

1.大肠杆菌生长在无机盐和葡萄糖的培养基上时，检测到细胞内有色氨酸合成酶的存在；

2.在上述培养基中加入色氨酸，检测发现细胞内色氨酸合成酶的活性降低，直至消失。

3.表明色氨酸的存在阻止了色氨酸合成酶的合成，体现了菌生长的经济原则：不需要就不合成。某些代谢物可以阻止某些酶的合成，是通过阻止为该酶编码的基因的表达而进行的，这种现象叫做酶合成的阻遏。能阻遏酶合成的物质叫辅阻遏物。被辅阻遏物作用而停止合成的酶叫阻遏酶。第47页，共190页，2023年，2月20日，星期三乳糖操纵子的结构第48页，共190页，2023年，2月20日，星期三诱导机制第49页，共190页，2023年，2月20日，星期三调节基因操纵基因结构基因mRNA酶蛋白阻遏蛋白不能与操纵基因结合，结构基因表达调节基因操纵基因结构基因辅阻遏物trp代谢产物与阻遏蛋白结合，使之构象发生变化与操纵基因结合，结构基因不能表达色氨酸操纵子（酶的阻遏）

-阻遏物和操纵基因的调节第50页，共190页，2023年，2月20日，星期三第51页，共190页，2023年，2月20日，星期三色氨酸操纵子的其他调控模式细菌通过弱化作用辅助了阻遏作用的不足，因为阻遏作用只能使转录不起始，对于已经起始了的转录，则只能通过弱化作用使它中途停顿下来。阻遏作用的信号是细胞内色氨酸的多少，而弱化作用的信号则是细胞内载有色氨酸的tRNA，它通过前导肽的翻译来控制转录的进行。在细菌细胞内这两种方式的协同作用，体现了生物体内精密、高效的基因表达调控。（或者称为衰减子）第52页，共190页，2023年，2月20日，星期三（I）trpmRNA中能形成碱基配对四段序列，1-2配对，2-3配对和3-4配对。（II）当细胞中有色氨酸存在时，核糖体能够顺利地翻译出前导肽而在终止密码子UAG（+70）处停下来。这时核酸糖体占据了序列1和部分序列2，使序列2和序列3不能产生有效配对，因而序列3和序列4配对而产生终止子和发夹结构。（III）当出现Trp饥饿时，核糖体停顿在两个Trp密码子上，这时核糖体占据序列1，序列2与序列3配对。这样，当序列4转录出来后仍呈单链状态，不能形成终止的发夹结构，于是转录继续进行下去。

第53页，共190页，2023年，2月20日，星期三细菌演化出衰减子调控系统的生物学意义?除了Trp操纵子外，其他许多负责氨基酸的操纵子都受衰减子的调控，其生物学意义可能是：活性阻遏物和非活性阻遏物的转变可能较慢，而tRNA荷载与否可能更为灵敏；氨基酸的主要用途是合成蛋白质，因而以tRNA荷载情况为标准来进行控制可能更为恰当；为什么大多数操纵子又同时需要阻遏蛋白呢？因为衰减子系统需要先转录出前导肽mRNA，然后根据前导肽的翻译情况来决定mRNA是否继续转录，而当氨基酸含量丰富时，则无需转录而关闭mRNA的转录活性。也就是说，需要一个决定基础水平的控制系统，当细胞内氨基酸高于某一水平时，可通过阻遏蛋白，而只有低于这一水平时，才需要用衰减子进行精细调节。

第54页，共190页，2023年，2月20日，星期三细菌乳糖操纵子的作用机制(降解物阻遏)调节基因启动子操纵基因lacZlacYlacACAPcAMPCAP-cAMP复合物mRNA当葡萄糖作唯一碳源时，葡萄糖的降解物对腺苷酸环化酶有抑制作用，则cAMP的浓度降低，CAP-cAMP复合物减少，不能与启动子结合，故转录不得进行。+过去称葡萄糖效应第55页，共190页，2023年，2月20日，星期三二、常见的酶生物合成体系非重组体系重组体系无细胞蛋白合成体系第56页，共190页，2023年，2月20日，星期三对产酶微生物的基本要求

基本要求：不是致病菌发酵周期短,产酶量高不易变异退化最好是产生胞外酶的菌种,利于分离。对医药和食品用酶,还应考虑安全性：凡从可食部分或食品加工中传统使用的微生物生产的酶,安全!由非致病微生物制取的酶,需作短期毒性实验。非常见微生物制取的酶,需做广泛的毒性实验,包括慢性中毒实验。第57页，共190页，2023年，2月20日，星期三（1）非重组体系野生型或传统方法诱变筛选第58页，共190页，2023年，2月20日，星期三常用的产酶微生物EscherichiacoliPseudomonasBacillussubtilisMicrococcusStreptococcusStreptomycesAspergillusnigerAspergillusoryzaeMonascusPenicilliumTrichodermaRhizopusMucorAbsidiaSaccharomycescerevisiaeCandida第59页，共190页，2023年，2月20日，星期三1、样品的采集:从富含该酶作用底物的场所采集样品2、富集培养:投其所好，取其所抗3、分离获得微生物的纯培养（pureculture）。4、初筛：选出产酶菌种，以多为主。5、复筛：选出产酶水平相对较高的菌株，以质为主。产酶微生物的分离和筛选诱变育种原生质体融合育种基因工程育种产酶微生物的选育第60页，共190页，2023年，2月20日，星期三

-淀粉酶的筛选第61页，共190页，2023年，2月20日，星期三蛋白酶产生菌的获得方法应用含酪蛋白的培养基第62页，共190页，2023年，2月20日，星期三大肠埃希氏杆菌，简称为大肠杆菌，是最为著名的原核生物。形态：短杆或长杆状，0.5～1.0×1.0～3.0um，革兰氏阴性，运动(周毛)或不运动，无芽孢，一般无荚膜。菌落呈白色至黄白色，扩展，光滑，闪光。Escherich属菌株和大多数大肠杆菌是无害，但也有些大肠杆菌是致病的，会引起腹泻和尿路感染。大肠杆菌的名声主要因它易于在实验室操作、生长迅速，而且营养要求低。应用： 大肠杆菌能作为宿主， 最早用作基因工程的宿主菌 工业上生产谷氨酸脱羧酶、天冬酰胺酶和制备天冬氨酸、苏氨酸及缬氨酸等第63页，共190页，2023年，2月20日，星期三醋酸杆菌（Acetobacter）菌体从椭圆至杆状，单个、成对或成链，革兰氏阴性，运动（周毛）或不运动，不生芽孢。好气。含糖、乙醇和酵母膏的培养基上生长良好。应用：有机酸(食醋等）葡萄糖异构酶(高果糖浆)山梨糖(维C中间体）第64页，共190页，2023年，2月20日，星期三枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）直状、近直状的杆菌，周生或侧生鞭毛，革兰氏阳性，无荚膜，芽孢0.5×1.51.8m，中生或近中生。枯草芽孢杆菌是工业发酵的重要菌种之一。生产淀粉酶、蛋白酶、5’-核苷酸酶、某些氨基酸及核苷。BacillussubtilisASI.398BacillussubtilisBF7658生产蛋白酶生产α淀粉酶第65页，共190页，2023年，2月20日，星期三根霉(Rhizopus)分类学上属于藻状菌纲，毛霉目，根霉属。根霉因有假根（Rhizoid）而得名（假根的功能是在培养基上固着，并吸收营养）。分布于土壤、空气中，常见于淀粉食品上，可引起霉腐变质和水果、蔬菜的腐烂。代表种：米根霉（R.oryzae)黑根霉(R.nigrican)等。应用：根霉能产生一些酶类，如淀粉酶、果胶酶、脂肪酶等，是生产这些酶类的菌种。在酿酒工业上常用做糖化菌。有些根霉还能产生乳酸、延胡索酸等有机酸。第66页，共190页，2023年，2月20日，星期三曲霉(Aspergillus)分类：多数属于子囊菌亚门，少数属于半知菌亚门。分布：广泛分布于土壤、空气和谷物上，可引起食物、谷物和果蔬的霉腐变质，有的可产生致癌性的黄曲霉毒素。代表种：黑曲霉Asp.Niger、黄曲霉Asp.flavus应用：是制酱、酿酒、制醋的主要菌种。是生产酶制剂（蛋白酶、淀粉酶、果胶酶）的菌种。生产有机酸（如柠檬酸、葡萄糖酸等）。农业上用作生产糖化饲料的菌种。第67页，共190页，2023年，2月20日，星期三（2）重组体系原核表达体系真核表达体系第68页，共190页，2023年，2月20日，星期三第69页，共190页，2023年，2月20日，星期三当外源基因引入某宿主细胞表达时，应考虑以下各种因素：外源基因的启动子顺序能否在宿主细胞起作用（利用表达载体）对转录产物能否进行加工修饰（利用cDNA）3.转录产物的稳定性4.转录产物的核糖体识别顺序能否为宿主细胞的翻译系统所识别（利用表达载体的基因融合技术）5.密码子的使用频率（选用适当宿主细胞）6.翻译产物的后修饰选用适当宿主细胞翻译产物的稳定性外源基因产物对宿主是否有害外源基因产物产量（选用不同拷贝数的载体）外源基因的最终产物是否具有生物活性（选用适当宿主细胞）11.外源基因的稳定性（改变宿主细胞遗传特性，如将外源基因插入染色体）12.对于制备大量外源基因产物，还须考虑到表达产物与其它细胞成分的分离方法第70页，共190页，2023年，2月20日，星期三最佳的基因表达体系：⑴目的基因的表达产量高;⑵表达产物稳定;⑶生物活性高;⑷表达产物容易分离纯化。基因的表达系统与表达策略第71页，共190页，2023年，2月20日，星期三宿主细胞的选择适合目的基因表达的宿主细胞的要求:1、容易获得较高浓度的细胞；

2、能利用易得廉价原料；

3、不致病、不产生内毒素；

4、发热量低、需氧低、适当的发酵温度和细胞形态；

5、容易进行代谢调控；

6、容易进行DNA重组技术操作；

7、产物的产量、产率高，

8、产物容易提取纯化。第72页，共190页，2023年，2月20日，星期三宿主细胞分为两大类：1、原核细胞：常用有大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、链霉菌等；大肠杆菌系统:融合表达和直接表达小于80AAs的多肽可用融合表达系统,分子量在100-300AAs且无过多半胱氨酸的多肽可用直接表达pET(plasmidforexpressionbyT7RNApolymerase),pTrcHis系列载体2、真核细胞：常用有酵母、丝状真菌、哺乳动物细胞等。酵母表达系统:酿酒酵母和巴氏毕赤酵母(Pichiapastoris)系统，直接表达和分泌表达；昆虫杆状病毒表达系统：直接表达和分泌表达哺乳动物细胞表达系统：瞬时表达和稳定表达:非微生物来源的大于500AAs的分泌蛋白质和表面受体蛋白第73页，共190页，2023年，2月20日，星期三原核生物基因的特点：1、原核生物染色体DNA是裸露的环形DNA，其转录和翻译是偶联的连续进行。2、原核生物形成多顺反子mRNA：mRNA在合成过程中和多个核糖体结合，翻译形成多条肽链。3、一般不含内含子（intron），没有转录及翻译后加工系统。4、原核生物中功能相关的基因串联在一起，形成操纵子。外源基因在原核表达系统中表达的必要条件：1、删除内含子和5’非编码区2、外源基因置于强启动子和SD顺序控制下3、维持正确开放阅读框架（ORF）4、mRNA稳定且可有效转译，形成的蛋白质不被降解。第74页，共190页，2023年，2月20日，星期三优越性：①对大肠杆菌的基础生物学、分子遗传学等背景知识和基因表达的调控机理已有了深刻了解。②有各类菌株和载体系列。③目前以实现多种基因的高效表达。表达基因产物形式多样:细胞内不溶性表达(包含体)、细胞内可溶性表达、细胞周质表达等。④易培养，成本低。缺点：①大肠杆菌中的表达不存在信号肽，产品多为胞内产物，提取困难。②因分泌能力不足，真核蛋白质常形成不溶性的包含体，表达产物需经变性复性才恢复活性。③蛋白质不能糖基化。产物蛋白质N端多余一个蛋氨酸残基。④其内毒素很难除去。

大肠杆菌目前仍是基因工程研究中采用最多的原核表达体系。第75页，共190页，2023年，2月20日，星期三大肠杆菌碱性磷酸酶AKP基因的克隆表达主要步骤培养基及试剂配制含pET-Blue质粒细菌的培养pET-Blue质粒的提取质粒DNA的琼脂糖电泳及紫外吸收分析大肠杆菌的培养大肠杆菌基因组DNA提取PCR扩增AKP基因琼脂糖凝胶电泳分析及PCR产物纯化质粒DNA与目的DNA的双酶切酶切产物的纯化质粒DNA与目的DNA的连接感受态细胞的制备重组质粒的转化重组子的筛选及鉴定重组子的发酵培养重组蛋白质的检测及分离纯化第76页，共190页，2023年，2月20日，星期三R－35－10SD编码序列OriTcrTT启动子起始密码子AUG、GUG、UUG终止密码子UAAU、UGA、UAG大肠杆菌基因表达系统的表达载体一般是质粒表达载体，含有大肠杆菌内源质粒复制起始位点和有关序列组成的能在大肠杆菌中有效复制的复制子。大肠杆菌表达载体的成份第77页，共190页，2023年，2月20日，星期三大肠杆菌表达载体的成份⑴启动子：要求是：①强启动子②是诱导性的，如热诱导和化学诱导。⑵转录终止子：使转录终止，增强mRNA的稳定性，提高蛋白质产物的表达水平。尤其是将两个终止子串联，转录终止功能更强。⑶核糖体结合位点：在转录起始位点下游的一段DNA序列（SD，5’AGGAGG3’）(4)筛选标记基因(5)密码子的选择第78页，共190页，2023年，2月20日，星期三第79页，共190页，2023年，2月20日，星期三第80页，共190页，2023年，2月20日，星期三第81页，共190页，2023年，2月20日，星期三第82页，共190页，2023年，2月20日，星期三常见的大肠杆菌表达系统①T7表达系统T7噬菌RNA聚合酶能选择性的激活T7噬菌体启动子的转录，其mRNA合成速率相当于大肠杆菌RNA聚合酶的5倍。②Lac表达系统是β-半乳糖苷酶编码基因LacZ的转录的调控序列，该启动子可以被IPTG诱导，所以在培养基中加入该安慰诱导物就可以诱导目的基因的表达。③Tac表达系统是一种由Lac和Trp启动子杂合而成的启动子，其强度得到了很大的提高，也可被IPTG诱导表达。④λPL表达系统是负责λDNA分子转录的启动子之一，是一种极强的启动子。第83页，共190页，2023年，2月20日，星期三影响克隆基因表达效率的因素一般而言，所用启动子的强度、DNA的转录起始序列、密码子的选择、mRNA的二级结构、转录的终止、基因的拷贝数等都会在一定程度上影响到转基因的表达。启动子的结构对表达效率的影响大多数大肠杆菌启动子都含有两种保守区,即-10区(位于转录其始位点上游5-10bp，故称为-10区，序列为5’--TATAAT)和-35区(位于转录起始位点上游25bp处，一般有10bp组成，5’--TTGACA故称为-35区，)。当然，实际的启动子中很少具备与上述序列完全一致的区域，但是研究表明，启动子的这两个区域与上述保守序列的相似程度越高，该启动子的表达能力也就越强。另外，这两个保守区间的距离也是影响启动子强度的重要因素，即这个间距越是接近于17bp，启动子的活性就越强。第84页，共190页，2023年，2月20日，星期三b.翻译起始序列对表达效率的影响mRNA的有效翻译依赖于核糖体和其的稳定结合，大肠杆菌的mRNA序列中，核糖体的结合位点是起始密码子AUG和其上游的SD序列。所谓SD序列就是由Shine-Dalgarno首先提出的一种位于位于起始密码子上游的一段保守序列，为细菌核糖体有效结合和翻译起始所必需。一般SD序列的长度约为3-9bp，位于起始密码子上游3-11碱基的位置，它与16S核糖体RNA的3‘端互补，控制了翻译的起始。５’--AGGAGGUXXXAUGmRNA３’AUUCCUCCACUAG

16SrRNA3’末端第85页，共190页，2023年，2月20日，星期三c.启动子与克隆基因间的距离对基因表达的影响研究表明启动子和目的基因间的距离对基因的表达效率影响很大，所以在构建新的表达载体时要考虑到这一因素的影响。另外，在克隆基因的末端要就近插入有效的终止子序列，否则会导致细胞能量的大量消耗，或是形成不应有的二级结构，最终影响的目的基因的表达效率。PromoterSDAUGGeneTerminatorUAAmRNA第86页，共190页，2023年，2月20日，星期三表达类型：融合型表达载体：融合蛋白非融合型表达载体：--天然完整蛋白分泌型表达载体：产物可跨膜分泌至胞周间隙第87页，共190页，2023年，2月20日，星期三融合型表达载体PSDForeignDNA融合型表达载体融合基因第88页，共190页，2023年，2月20日，星期三非融合型表达载体PSDForeignDNA非融合型表达载体非融合基因第89页，共190页，2023年，2月20日，星期三蛋白质的融合表达融合表达一般是将基因引入某表达载体编码的高表达蛋白（担体蛋白）序列的3’末端。表达出来的融合蛋白的N末端含有由担体序列编码的片段。融合蛋白可以直接用作抗体，但通常是将N端的担体蛋白部分从C端的目的蛋白中裂解出来，有利于对目的蛋白进行生化研究及功能分析。方法主要有：化学裂解法和酶解法。第90页，共190页，2023年，2月20日，星期三蛋白质的分泌型表达将目的蛋白的基因置于原核蛋白信号肽序列的下游有可能实现分泌表达。实现蛋白质分泌表达有许多有利之处：1.在穿膜过程中信号肽被信号肽酶切除。生产的蛋白质和天然蛋白质是一致的。2.周质中蛋白酶活性低，分泌的蛋白稳定。3.周质中细菌的蛋白很少，使得重组蛋白易纯化。4.周质中提供了一个氧化环境，更有利于二硫键的正确形成。因此，对于许多难以纯化的蛋白质可以通过分泌表达来实现生产。第91页，共190页，2023年，2月20日，星期三蛋白质的包含体形式表达重组蛋白在大肠杆菌中高表达时，绝大多数是以包含体形式存在的。包含体就是表达的蛋白质在细胞内聚集成没有生物活性的固体颗粒。不可溶、无生物活性的包含体必需经过变性、复性才能获得天然结构及生物活性。减少包含体形成的策略：1.降低重组菌的生长温度。2.添加可促进重组蛋白质可溶性表达的生长添加剂。如高浓度的多醇类、蔗糖或非代谢糖。3.供给丰富的培养基，创造最佳培养条件，如供氧、pH值等。不过，包含体的形成有时也是有利的，不仅可以获得高表达、高纯度的蛋白质，还可避免细胞水解酶对重组蛋白的破坏。第92页，共190页，2023年，2月20日，星期三有效、理想的复性方法应具备以下几个特点：1.活性蛋白质的回收率高。2.正确复性的产物易于与错误折叠蛋白质分离。3.折叠复性后应得到浓度较高的蛋白质产品。4.折叠复性方法利用放大。5.复性过程耗时较少。第93页，共190页，2023年，2月20日，星期三真核基因表达的特点1、一条成熟的mRNA只能翻译成一条多肽，不存在象原核生物那样的多基因操纵子模式；2、基因转录调节区很大，而且往往远离启动子达几百个甚至上千个碱基，它们并不直接影响RNA聚合酶与启动子区的结合，而是通过改变基因5’上游区DNA的构型来影响RNA聚合酶与启动子区的结合；3、mRNA合成后穿过核膜进入细胞质中后才进行翻译工作，而且通常都有复杂的成熟和剪接过程；4、基因的启动子区和原核基因差异很大，而且有增强子序列存在。第94页，共190页，2023年，2月20日，星期三原核体系中表达真核基因的困难细菌的RNA聚合酶不识别真核基因的启动子；真核基因转录的mRNA在原核细胞中不能结合到核糖体上；真核基因一般含有内含子，而原核细胞没有象真核细胞那样的转录后加工系统，所以mRNA中的内含子部分不能被切除，不能形成成熟的RNA，也就不能表达出有功能的真核蛋白；表达的真核蛋白在原核细胞中很不稳定，容易被细菌蛋白酶降解破坏。第95页，共190页，2023年，2月20日，星期三⑴将真核基因克隆到一个强大的原核启动子和SD序列的下游，使得真核基因处于原核调控体系中。⑵采用真核基因的cDNA序列作为构建表达载体的目的基因，这样就解决了原核细胞没有RNA剪接功能的问题。⑶构建载体时，将真核基因插在几个原核密码子的后面，翻译后就得到了原核多肽和真核多肽的融合蛋白，这样就可以避免被原核蛋白酶的识别和降解，最后可以将融合多肽切除。构建表达载体的策略第96页，共190页，2023年，2月20日，星期三真核表达系统酵母丝状真菌昆虫哺乳动物细胞转基因动物植物反应器第97页，共190页，2023年，2月20日，星期三酵母菌是研究基因表达最有效的单细胞真核微生物。其基因组小，世代时间短，有单倍体双倍体两种形式，繁殖迅速，无毒性。能外分泌，产物可糖基化。已有不少真核基因成功表达。大肠杆菌表达系统的缺陷：1.缺失真核生物的蛋白质翻译后修饰和加工，如剪切、糖基化、形成二硫键等。2.表达的蛋白多以包含体形式存在，需要经过复杂的复性才能恢复构象和生物活性。因此，可以使用真核生物酵母作为表达菌。如酿酒酵母、甲醇酵母等。酵母菌是研究基因表达最有效的单细胞真核微生物。第98页，共190页，2023年，2月20日，星期三酵母表达系统的优缺点遗传背景清楚（基因组是大肠杆菌的3.5倍）增殖快（90min/代），培养容易，产量较高易于研究突变与基因功能，如构建酵母人工染色体等可以进行转录和翻译后修饰加工提纯工艺复杂，成本高，制品纯度达不到要求，制品免疫原性差，接种剂量大第99页，共190页，2023年，2月20日，星期三酵母载体的基本结构DNA复制起始区：2μ质粒和自主复制序列选择标记：营养缺陷型和显性选择（抗药）整合介导区：同源重组，决定整合位置和拷贝数有丝分裂稳定区：帮助载体平均分配表达盒转录启动子终止子分泌信号序列第100页，共190页，2023年，2月20日，星期三酵母表达系统中载体的种类按载体在酵母中的复制形式分为：YIp：酵母整合型载体YRp：酵母自主复制型载体YCp：酵母含着丝粒片段载体YEp：酵母附加体型载体YAC：酵母人工染色体第101页，共190页，2023年，2月20日，星期三微观的酵母细胞第102页，共190页，2023年，2月20日，星期三表10－2第103页，共190页，2023年，2月20日，星期三甲醇酵母表达系统甲醇酵母能利用甲醇为其唯一碳源。甲醇代谢的第一步是甲醇在乙醇氧化酶作用下氧化成甲醛，乙醇氧化酶对氧的亲和力很弱，因此甲醇酵母代偿性的大量产生这种酶。调控乙醇氧化酶的启动子是强启动子，可用来调控异源蛋白的表达。优点：1.具有强启动子，可严格调控目的蛋白的表达。2.可对表达的蛋白进行翻译后的加工和修饰，从而使表达出的蛋白具有生物活性。3.营养要求低，生长快，培养基廉价，便于工业化生产。4.可高密度发酵培养。第104页，共190页，2023年，2月20日，星期三影响目的基因在甲醇酵母中表达的因素1.目的基因的特性2.表达框的染色体整合位点与基因拷贝数3.宿主的甲醇利用表型4.分泌信号5.产物稳定性6.翻译后修饰第105页，共190页，2023年，2月20日，星期三5'AOX1启动子片段含有AOX1启动子，在甲醇的诱导下可启动外源蛋白的表达；

α-因子信号肽序列为约89个氨基酸的信号肽序列，能使外源蛋白分泌到发酵上清中，更利于外源蛋白的纯化；多克隆位点含多个酶切位点，为外源基因的插入提供位点；

TT序列提供有效的转录终止和polyA修饰信号；

HIS4为营养缺陷型筛选标志；

3'AOX1基因片段能够与基因组AOX1基因属同源重组；抗Amp基因和pBR322能使空载体和构建的表达载体在E.coli中筛选和复制。毕赤酵母表达系统中常用载体的基本结构第106页，共190页，2023年，2月20日，星期三pPIC9载体的信号肽序列和多克隆位点第107页，共190页，2023年，2月20日，星期三1.载体的3'AOX1区与基因组的AOX1基因的末端发生整合重组表达载体与毕赤酵母基因组发生重组的两种方式：2.载体的HIS4区与基因组的HIS4基因的末端发生整合重组第108页，共190页，2023年，2月20日，星期三图10-12第109页，共190页，2023年，2月20日，星期三

图示:巴斯德毕赤酵母中乙型肝炎表面抗原的表达第110页，共190页，2023年，2月20日，星期三图10—13第111页，共190页，2023年，2月20日，星期三甲醇酵母系统高效表达影响因素载体稳定性：是整合还是粘附到酵母染色体上基因剂量：单/多拷贝甲醇利用表型：Muts(利用甲醇慢型)，Mut+(利用甲醇快型)mRNA5′端：应尽量避免在UTR区出现AUG和次级结构AT含量：AT含量越高、越容易出现类似于终止子的结构表达产物稳定性：分泌表达时，胞外蛋白酶是要影响因素第112页，共190页，2023年，2月20日，星期三外源基因的3'末端的最低自由能稳定性对于实现目的基因在毕赤酵母中成功高效表达是比较重要的因素，汕头大学医学院生物化学与分子生物学教研室李恩民教授课题组联合北京军事医学科学院李伍举教授课题组建立了一个针对pPIC9表达载体在毕赤酵母中高效表达的数学模型。第113页，共190页，2023年，2月20日，星期三外源基因在毕赤酵母表达系统中高效表达预测的网页服务器/ppic9

第114页，共190页，2023年，2月20日，星期三分析流程：在“sequence”方框中输入由目的基因末端100bp及其后面的载体100bp组成的200bp序列片段；点击底下的“Evaluation”按钮，在“Evaluation”方框中显示预测的结果；如果结果显示低于0.5，则可点击“Design”这个按钮，则显示根据密码子使用改造后的序列。第115页，共190页，2023年，2月20日，星期三昆虫表达系统杆状病毒基因组：闭环双链DNA，88-166kb启动子：杆状病毒科核多角体病毒的多角蛋白强启动子表达系统杆状病毒表达系统（BEVS）家蚕核型多角体病毒-家蚕表达系统宿主：鳞翅目、膜翅目、双翅目、鞘翅目、直翅目、脉翅目、毛翅目的600多种昆虫克隆基因方法：转移载体→共转染→同源重组→空斑筛选→纯化→重组病毒第116页，共190页，2023年，2月20日，星期三杆状病毒表达系统优点容量大：能插入12kb的外源基因高表达：polh基因启动子是目前所知的最强的真核启动子；产物对宿主影响小；产物可结晶高效：可同时表达多个基因安全：杆状病毒对脊椎动物无病原性具加工修饰功能：昆虫细胞较高等家蚕易饲养第117页，共190页，2023年，2月20日，星期三哺乳动物细胞表达表达系统常用宿主细胞哺乳动物细胞常用载体真核细胞表达元件哺乳动物基因转移的遗传标记基因表达的检测方法第118页，共190页，2023年，2月20日，星期三哺乳动物细胞表达的优点重组DNA易转染，遗传稳定，可重复识别和去除内含子进行翻译后修饰磷酸化、糖基化、二硫键、寡聚体等的形成、高级结构的正确折叠产品的构型正确率高，可被改造成类人体源性，免疫源性好可分泌至培养基，提纯工艺简单，成本低可用于基因治疗第119页，共190页，2023年，2月20日，星期三常用宿主细胞细胞名称来源已投放产品BHK-21地鼠幼鼠肾凝血Ⅷ因子CHO-K1中国仓鼠卵巢tPA，Ⅷ因子，EPO，G-CSF等C127小鼠乳腺肿瘤GHMDCK长耳狗肾脏兽用疫苗NamalwaBurkitt淋巴瘤病人的类淋巴母细胞EPO，LT，tPA，IFNVero成年非洲绿猴肾HBsAg，GH鼠骨髓瘤细胞骨髓瘤tPA，抗体COSSV40转化的绿猴肾细胞CD34，CD69，TGF第120页，共190页，2023年，2月20日，星期三（3）无细胞体外蛋白质合成体系原核表达体系真核表达体系第121页，共190页，2023年，2月20日，星期三无细胞体外蛋白质合成体系（Invitrocellfreetranslationorproteinsynthesissystem）是一种细胞裂解物，这种系统只有翻译功能，当加入外源mRNA，能量物质和氨基酸，该系统就能合成蛋白质，经SDS—PAGE后可检测出翻译活性。

常用翻译系统有以下几种：

1.兔网织细胞裂解物(reticylocytelysatesystem)

由未成熟的兔红细胞裂解而成，该种细胞是向动物注射苯肼后引起贫血产生的,向该系统加入血红素基和能量物质，裂解物中的内源mRNA可被翻译成球蛋白，其合成速度与用完整细胞的合成速度接近。第122页，共190页，2023年，2月20日，星期三

微球菌核酸酶可除去内源mRNA，同时也不会对系统中的tRNA和rRNA损伤过大。由于该核酸酶的活性依赖于Ca2+，当除去内源mRNA后，可用EGTA除去Ca2+，此系统仍可保持70%的活性。因该系统无内源核酸酶和蛋白酶，可用于大分子mRNA的翻译。2.

小麦胚抽提物(wheatgermextract)

该系统不具内源mRNA，属外源mRNA依赖型，利用Sephadex-G50可减少该系统中的内源氨基酸，因而可大大增加翻译产物的高比活性。由于该系统存在着核酸酶和蛋白酶，因此不能用于翻译很大的mRNA，该系统仅为前一系统活性的1/10。

3.

其它系统：鼠骨髓瘤抽提物，艾氏腹水瘤和酿酒酵母裂解物等。

4.

两栖动物卵母细胞:翻译效率高，翻译产物稳定，灵敏度高（10ngmRNA），也可作为转录—翻译系统。第123页，共190页，2023年，2月20日，星期三三、酶的发酵工艺条件与控制

Thefermentationprinciplesanditscontrolofenzymeproduction培养基发酵条件控制提高产酶的措施第124页，共190页，2023年，2月20日，星期三典型的植酸酶发酵生产工艺第125页，共190页，2023年，2月20日，星期三第126页，共190页，2023年，2月20日，星期三酶发酵工艺组成部分

培养基制备↓种子培养→发酵罐→产物的提取精制↑无菌空气生长和产酶、经济、高转化纯种、高生长率无菌、高溶氧、均匀混合多相系统传质传热培养条件维持高密度发酵、产酶经济、高收率控制点第127页，共190页，2023年，2月20日，星期三MediumandInoculationAgitationCoolingandheatingAirinletandoutletpHcontrolVolumecontrol一般性工艺条件NutrientadditionProteinbiosynthesisInductionRepressionExcretionGenestability特殊工艺条件第128页，共190页，2023年，2月20日，星期三第129页，共190页，2023年，2月20日，星期三发酵工艺控制

Processcontrolandmonitoring发酵参数控制SugarconsumptionpHTemperatureFermentationtime(h)AgitationCellDryWeightProductComputersoftwareshavebeendevelopedtomonitorandchangetheprocessonline第130页，共190页，2023年，2月20日，星期三第131页，共190页，2023年，2月20日，星期三1、选择适宜的营养物质2、营养物的浓度及配比合适3、物理、化学条件适宜4、经济节约5、精心设计、试验比较培养不同的微生物必须采用不同的培养条件；培养目的不同，原料的选择和配比不同；不同阶段，培养条件也有所差异。培养基的设计原则1、培养基第132页，共190页，2023年，2月20日，星期三五大要素：碳源、氮源、无机盐、生长因子、水培养基几乎是一切对微生物进行研究和利用工作的基础培养基（medium）是人工配制的，适合微生物生长繁殖或产生代谢产物的营养基质。任何培养基都应该具备微生物生长所需要五大营养要素第133页，共190页，2023年，2月20日，星期三构成细胞物质或代谢产物中碳架碳源可作能源，为生命活动提供能量常用碳源：糖类、醇类、脂类、有机酸、烃类、蛋白质及其降解物异养微生物：糖类是最好碳源（葡萄糖最为通用）水是微生物最基本的组成分（７０％—９０％）水是微生物体内和体外的溶剂（吸收营养成分和代谢废物）水是细胞质组分，直接参与各种代谢活动调节细胞温度和保持环境温度的稳定（比热高，传热快）水碳源选择合适碳源，以适应目的酶的合成调节机制第134页，共190页，2023年，2月20日，星期三构成细胞物质和代谢产物中氮素（不能用作能源）氮源有机氮源蛋白胨、酵母膏、牛肉膏无机氮源铵盐、硝酸盐参与酶的组成、构成酶活性基、激活酶活性维持细胞结构的稳定性调节细胞渗透压控制细胞的氧化还原电位有时可作某些微生物生长的能源物质常用：硫酸盐、磷酸盐、氯化物以及含有钾、钠、钙、镁、铁等元素的化合物。氮源无机盐需要注意合适的碳氮比第135页，共190页，2023年，2月20日，星期三生长因子生长因子是指某些微生物不能用普通的碳源、氮源物质进行合成，而必须另外加入少量的生长需求的有机物质。分类：化学结构分成维生素、氨基酸、嘌呤（或嘧啶）及其衍生物和类脂成分等四类功能：以辅酶与辅基的形式参与代谢中的酶促反应实验室中常用酵母膏、蛋白胨、牛肉膏等作为各种生长因子的的需要，麦芽汁、米曲汁等天然培养基中本身含有各种生长因子工业规模中通常由有机氮源辅助提供第136页，共190页，2023年，2月20日，星期三实验室的常用培养基：细菌：牛肉膏蛋白胨培养基（或简称普通肉汤培养基）；放线菌：高氏1号合成培养基培养；酵母菌：麦芽汁培养基；霉菌：查氏合成培养基；例如枯草芽孢杆菌：一般培养：肉汤培养基或LB培养基；自然转化：基础培养基；观察芽孢：生孢子培养基；产蛋白酶：以玉米粉、黄豆饼粉为主的产酶培养基；第137页，共190页，2023年，2月20日，星期三枯草杆菌BF7658α-淀粉酶发酵培养基：玉米粉8%，豆饼粉4%，磷酸氢二钠

0.8%，硫酸铵0.4%，氯化钙0.2%，氯化按0.15%（自然pH）。枯草杆菌AS1.398中性蛋白酶发酵培养基：玉米粉4%，豆饼粉3%，麸皮3.2%,

糠1%,磷酸氢二钠0.4%,磷酸二氢钾0.03%（自然pH）。黑曲霉糖化酶发酵培养基：玉米粉10%，豆饼粉4%，麸皮1%（pH4.4～5.0）。地衣芽孢杆菌2709碱性蛋白酶发酵培养基：玉米粉5.5%,豆饼4%,磷酸氢二钠0.4%,磷酸二氢钾0.03%(pH8.5)。黑曲霉AS3.350酸性蛋白酶发酵培养基:玉米粉6%,豆饼粉4%,玉米浆0.6%,氯化钙0.5%,氯化铵1%,磷酸氢二钠0.2%(pH5.5)。游动放线菌葡萄糖异构酶发酵培养基：糖蜜2%，豆饼粉2%，磷酸氢二钠0。1%，硫酸镁0。05%(pH7.2)。桔青霉磷酸二酯酶发酵培养基：淀粉水解糖5%，蛋白胨0.5%,硫酸镁0.05%,氯化钙0.04%,磷酸氢二钠0.05%,磷酸二氢钾0.05%(自然pH)。黑曲霉AS3.396果胶酶发酵培养基:麸皮5%,果胶0.3%,硫酸铵2%,磷酸二氢钾0.25%,硫酸镁0.05%,硝酸钠0.02%,硫酸亚铁0.001%(自然pH)。枯草杆菌AS1.398碱性磷酸酶发酵培养基:葡萄糖0.4%,乳蛋白水解物0.1%,硫酸铵1%,氯化钾0.1%,氯化钙0.1mmol/L,氯化镁1.0mmol/L,磷酸氢二钠20mol/L(用pH7.4的Tris-HCl缓冲液配制)第138页，共190页，2023年，2月20日，星期三1.固态发酵法微生物的培养物是固态，一般使用麸皮作为培养基。在曲房内将培养基拌入种曲后（固态，含水量60％左右）铺成薄层（1cm左右）在曲盘或帘子上，然后置于多层架子上进行微生物的培养。培养过程中控制曲房的温度和湿度（90～100％），逐日测定酶活力的消长，待菌丝布满基质、酶活力达到最大值不再增加时，即可终止培养，进行酶的提取。固态培养法一般适用于霉菌的生产。起源于我国酿造生产特有的传统制曲技术，生产简单易行，但劳动强度高。近年新发展了通风制曲工艺，在酶制剂的生产中仍占有重要作用。2、典型的酶制剂发酵工艺第139页，共190页，2023年，2月20日，星期三2.深层液体培养法采用在通风搅拌的发酵罐中进行微生物深层液体培养，是目前酶制剂发酵生产中最广泛应用的方法。液体深层发酵法的优点机械化程度高，发酵条件易控制。酶的产率高、质量好。培养的无菌要求高，在生产上要特别注意防止染菌。第140页，共190页，2023年，2月20日，星期三微生物酶制剂生产工艺举例——α－淀粉酶生产工艺菌种微生物培养法微生物培养条件细菌液体深层发酵中性至微碱性霉菌固体曲法微酸性一般在酶活达到最高峰时结束发酵，离心以硅藻土作为助滤剂去除菌体及不溶物。在钙离子存在下低温真空浓缩后，加入防腐剂、稳定剂以及缓冲剂后就成为成品。第141页，共190页，2023年，2月20日，星期三为制造高活性的淀粉酶并便于贮运，可把发酵液用硫酸铵或有机沉淀剂沉淀制成粉状酶制剂，最好贮藏在25℃以下、较干燥避光的地方。利用蛋白酶比淀粉酶的耐热性差的特点，将α－淀粉酶的发酵液加热处理可以使淀粉酶的储藏稳定性大为提高。在培养基中添加柠檬酸盐可抑制某些菌株产生的蛋白酶，用底物淀粉进行吸附也可将淀粉酶和蛋白酶进行分离。第142页，共190页，2023年，2月20日，星期三（一）米曲霉固态法α-淀粉酶生产工艺1.生产工艺流程试管斜面培养基↓三角瓶种子↓种曲培养↓厚层通风培养↓烘干↓粗酶制剂↓酿造等用粉碎↓抽提↓过滤↓沉淀↓压滤↓烘干↓成品↓供助消化药、酿造等用←调配第143页，共190页，2023年，2月20日，星期三2.发酵将试管斜面（于32～34℃培养70～72h），接种到500mL三角瓶（每瓶一菌耳种菌），摇匀于32～34℃下培养3d，每24h扣瓶一次以防结块，待菌体大量生长孢子转出黄绿色时，即可作为种子用于制备种曲。种曲房要保持清洁，并定期用硫磺和甲醛熏蒸灭菌。种曲培养一般采用木制或铝制曲盒，培养基经高温灭菌后放入种曲箱房，打碎团块冷却到30℃左右接入0.5～1％的三角瓶种子，拌匀后放入曲盒，料层厚度1cm左右为宜。盒上盖一层布后放入专用的木架上，曲房内保持30℃左右进行培养。盖布应每隔8～12h用水浸湿，以保持一定湿度，每24h扣盘一次，经3d后，种曲成熟，麦麸上布满黄绿色孢子。厚层通风固体发酵，蒸煮1h后培养基冷却到30℃接入0.5％的种曲，拌匀后入池发酵。前期品温控制在30℃左右，每隔2h通风20min，当池内品温上升至36℃以上时则需要连续通风，使温度控制在34～36℃。当池内温度开始下降后2～3h则通冷风使品温下降到20℃左右出池，整个发酵过程约需要28h。第144页，共190页，2023年，2月20日，星期三2.提取直接把麸曲在低温下烘干，作为酿造工业上使用的粗酶制剂，特点是得率高、制造工艺简单，但酶活性单位低，含杂质较多。把麸曲用水或稀释盐水浸出酶后，经过滤和离心除去不溶物后用酒精沉淀或硫酸铵盐析，酶泥滤出烘干，粉碎后加乳糖作为填充剂最后制成供作助消化药、酿造等用的酶制剂。特点是酶活性单位高，含杂质较少，但得率低、成本高。第145页，共190页，2023年，2月20日，星期三（二）枯草杆菌BF-7658深层液体发酵α-淀粉酶生产工艺枯草杆菌BF-7658淀粉酶是我国产量最大、用途最广的一种液化型α-淀粉酶，其最适温度65℃左右，最适pH6.5左右，pH低于6或高于10时，酶活显著下降。其在淀粉浆中的最适温度为80～85℃，90℃保温10min，酶活保留87％。第146页，共190页，2023年，2月20日，星期三1.生产工艺无菌空气BF-7658菌种↓孢子斜面↓种子罐↓发酵罐↑热处理↓盐析↓压滤↓干燥↓粉碎↓混粉↓成品←硫酸铵补料罐→硫酸铵废液←填充料第147页，共190页，2023年，2月20日，星期三2.发酵孢子培养一般采用马铃薯培养基，于37℃下培养72h，使菌体全部形成孢子即为成熟。种子培养维持罐温37℃，罐压0.5～0.8atm，10h后加大通风，当菌体处于对数生长期后期，立刻接种至大罐，种子培养一般14h左右。发酵控制温度37℃，罐压0.5atm，通气量0～12h控制0.5～0.6VVM，12h后控制在0.8～1.0VVM，发酵后期控制在0.9VVM。发酵培养一般采用补料工艺，一方面可解除分解代谢阻遏效应，另一方面也有利于pH的调节，最终达到提高产量的作用。补料体积和基础培养基体积一般为1:3左右。从10h左右开始补加，一般前期、后期少，中期大，根据菌体的生长情况来调整。当pH低于6.5，细胞生长粗壮时可酌减；当pH高于6.5，细胞出现衰老并有空胞时可酌增，发酵周期一般为40h。第148页，共190页，2023年，2月20日，星期三3.提取工业上回收α-淀粉酶一般采用硫酸铵盐析法。硫酸铵浓度、酶液的浓度和pH对盐析效果都有影响，甚至α-淀粉酶来源或菌种不同对硫酸铵浓度的要求也不同，如枯草杆菌α-淀粉酶的硫酸铵浓度一般为37～50％不等。第149页，共190页，2023年，2月20日，星期三3、发酵条件及控制培养基的pH必须控制在一定的范围内，以满足不同类型微生物的生长繁殖或产生代谢产物。为了维持培养基pH的相对恒定，通常在培养基中加入pH缓冲剂，或在进行工业发酵时补加酸、碱。通常培养条件：细菌与放线菌：pH7~7.5酵母菌和霉菌：pH4.5~6范围内生长pH值的控制细胞发酵产酶的最适pH值与生长最适pH值往往有所不同。细胞生产某种酶的