生物制药技术基因构建

生物制药技术基因构建第1页/共36页《生物制药技术（含实验）》课程教学大纲2教学内容理论课学时绪论1基因与工程细胞的构建3工程细胞的发酵培养与蛋白表达2重组蛋白的分离纯化2生物制药的制剂研究1生物制药的质量研究与分析技术4生物制药的中试研究2生物制药的稳定性研究1生物制药的主要药效学研究1生物制药的药代动力学研究1教学内容理论课学时小课讨论学时生物制药的安全性评价3

第一次PBL—生物制药立项

2抗体药物3

基因治疗与基因药物2

肿瘤的细胞免疫治疗3

第二次PBL—肿瘤的治疗

2个体化医学诊疗2

生物制药的知识产权问题1

生物制药的药品注册2

第三次PBL—生物制药申报

2第2页/共36页生物制药研发的基本流程3基因构建发酵培养分离纯化制剂研究质量研究中试放大稳定性研究药效学研究安全药理研究临床申报药学(实验室)药学(中试)药理学临床试验第3页/共36页2.1基因与工程细胞构建2.2工程细胞的发酵培养与蛋白表达2.3重组蛋白的分离纯化2.4生物制药的制剂研究2.5生物制药的质量研究与分析技术2.6生物制药的中试研究2.7生物制药的稳定性研究第二章重组蛋白药物的药学概论原核细胞真核细胞4第4页/共36页2.1.1基本概念2.1.2质粒、载体2.1.3工程细胞与细胞库2.1.4表达方式选择2.1.5基因构建与诱导表达2.1.6实例2.1基因与工程细胞构建5第二章重组蛋白药物的药学概论第5页/共36页2.1

基因与工程细胞构建基因重组——分子水平、提取、连接、转染、复制、表达别称——基因工程、DNA重组、遗传工程、基因操作、克隆工程细胞的三要素基因载体宿主细胞62.1.1基本概念第6页/共36页基因——一段具有蛋白结构编码的核酸序列载体——质粒、噬菌体、病毒限制性内切酶、连接酶抗生素抗性基因——Kan、Neo、Tet、Amp、Str宿主细胞——细菌、酵母、哺乳动物细胞、昆虫细胞2.1

基因与工程细胞构建72.1.1基本概念第7页/共36页组建表达载体条件强启动子两侧的调控序列选择标记正确的读码框架合适的核糖体结合位点（SD序列）SD序列与起始密码子ATG之间合适的距离被翻译的蛋白性质与稳定性合适的宿主细胞2.1

基因与工程细胞构建SD序列（Shine-Dalgarnosequence）：mRNA中用于结合原核生物核糖体的序列。SD序列在细菌mRNA起始密码子AUG上游7-12个核苷酸处，有一段富含嘌呤的碱基序列，能与细菌16SrRNA3’端识别，帮助从起始AUG处开始翻译82.1.1基本概念第8页/共36页2.1.2质粒、载体2.1

基因与工程细胞构建9第9页/共36页2.1

基因与工程细胞构建10第10页/共36页2.1

基因与工程细胞构建11第11页/共36页克隆鉴定宿主细胞细胞筛选细胞库合成、分离、RT-PCR优化、测序抗性基因、限制性内切酶位点宿主与产品的相关性表达水平、产品鉴定三级细胞库、遗传稳定性载体2.1

基因与工程细胞构建122.1.3工程细胞与细胞库第12页/共36页原始种子库主种子库工作种子库2.1

基因与工程细胞构建13第13页/共36页调控调控生物遗传中心法则DNARNAProtein2.1

基因与工程细胞构建14第14页/共36页蛋白质结构PrimaryStructure——ThesequenceofaminoacidsonthepolypeptidechainSecondaryStructure——Conformationofthepolypeptidechain(3Dstructure)TertiaryStructure——ThreeDimensionalStructure(Folding)oftheproteinQuaternaryStructure——Complexationwithotherproteins(Similarordissimilarstructures)2.1基因与工程细胞构建152.1.4表达方式选择第15页/共36页依赖于制备过程的蛋白质结构Prokaryoticcells

EasiertomakeCheapertoproduceImproperfoldingofproteinNoglycosylationNoSecretionEukaryoticcells

CanproperlyfoldtheproteinGlycosylate-(maybedifferently)HardertocloneHardertomaintainincellcultureMayharborviruses

LoweryieldsHigherexpense2.1基因与工程细胞构建162.1.4表达方式选择第16页/共36页2.1.5基因构建与诱导表达2.1基因与工程细胞构建17第17页/共36页2.1基因与工程细胞构建182.1.5基因构建与诱导表达第18页/共36页SolubleInclusionBodySecreting2.1

基因与工程细胞构建原核细胞表达系统192.1.5基因构建与诱导表达第19页/共36页优点突出正确指导蛋白质正确折叠提供糖基化等多种翻译后加工在新基因发现、蛋白质结构功能研究中起极为重要的作用生产阶段系统表达水平达到7g/L生物医药产业发达国家新药研发中均选择哺乳动物细胞表达系统2.1基因与工程细胞构建哺乳动物细胞表达系统202.1.5基因构建与诱导表达第20页/共36页正常细胞生长特性锚地依赖性血清依赖性接触抑制性形态依赖性体外培养正常细胞改变某些特征，越过生理临界点，继续无限制分裂——细胞系形成2.1基因与工程细胞构建哺乳动物细胞表达系统212.1.5基因构建与诱导表达第21页/共36页哺乳动物细胞表达系统受体细胞条件细胞系特征——丧失细胞接触抑制和锚地依赖性遗传稳定性——外源基因多次传代不丢失合适的标记——便于筛选与维持生长快且齐——分裂周期短，生长均一安全性——不合成、分泌致病物质，不致癌以高效表达外源基因为目标的高等哺乳动物受体细胞必须条件2.1基因与工程细胞构建222.1.5基因构建与诱导表达第22页/共36页遗传标记遗传标记编码产物筛选药物作用机理APH-氨基糖苷磷酸转移酶G418APH灭活G418DHFR二氢叶酸还原酶氨甲喋呤DHFR变体抗氨甲喋呤HPH-潮霉素B磷酸转移酶潮霉素BHPH灭活潮霉素BTK-胸腺嘧啶核苷激酶氨甲喋呤TK合成TMPXGPRT-黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶霉酚酸XGPRT合成GMPADA-腺嘌呤核苷脱氨酶腺嘌呤木酮糖苷ADA灭活Xyl-A哺乳动物细胞表达系统2.1

基因与工程细胞构建232.1.5基因构建与诱导表达第23页/共36页常用宿主细胞商业化CHO——中国仓鼠卵巢细胞系BHK——小仓鼠肾细胞系COS——非洲绿猴肾成纤维细胞系NSO——小鼠骨髓瘤细胞系SP2/0——小鼠骨髓瘤细胞系HEK293——人胚肾细胞系NIH313——鼠成纤维细胞系因稳定性与糖基化不同，根据表达目的蛋白选择适当细胞系哺乳动物细胞表达系统2.1

基因与工程细胞构建242.1.5基因构建与诱导表达第24页/共36页真核表达载体必要原件高活性启动子、转录终止序列、有效mRNA翻译信号复制子、抗生素抗性基因、限制性酶切位点标志基因内含子内部核糖体进入位点（IRES）哺乳动物细胞表达系统2.1

基因与工程细胞构建

一般真核mRNA的翻译都需要5'帽子来介导核糖体结合，但真核生物和病毒中还存在一些例外情况，例如一些基因5'端具有一段较短的RNA序列（约150-250bp），这类RNA序列能折叠成类似于起始tRNA的结构，从而介导核糖体与RNA结合，起始蛋白质翻译，这段非翻译RNA被称为内部核糖体进入位点序列（Internalribosomeentrysite,IRES）252.1.5基因构建与诱导表达第25页/共36页诱导的方式IPTG/乳糖低温pH低磷表达检测方式表达标志物电泳GFP遗传稳定性基因稳定性——琼脂糖电泳、指纹图谱、PCR、测序表达稳定性——表达标志物、活性四环素蜕皮激素他可莫斯/雷帕霉素RU4862.1

基因与工程细胞构建262.1.5基因构建与诱导表达第26页/共36页高效表达外源蛋白的基本原理通过强化基因扩增高效表达外源基因DHFR-MTX高效表达系统哺乳动物细胞表达系统2.1

基因与工程细胞构建272.1.5基因构建与诱导表达第27页/共36页组织纤溶酶原激活剂第一个重组哺乳动物细胞规模化生产的溶栓药物——人组织纤溶酶原激活剂(tPA)目前市场上销售的阿替普酶(tPA)采用DHFR-MTX系统表达，受体细胞为CHO系统人tPA也可由大肠杆菌生产，但蛋白折叠效率低2.1

基因与工程细胞构建282.1.6实例第28页/共36页组织纤溶酶原激活剂2.1基因与工程细胞构建292.1.6实例第29页/共36页代表药物优点缺点第一代链激酶（SK）尿激酶（UK）溶栓能力强缺乏特异性导致出血过敏反应第二代组织型纤溶酶原激活剂（tPA）具有溶栓特异性副作用较少半衰期短需大量注射第三代瑞替普酶（rPA）兰替普酶（NPA）溶栓快速治疗效率高半衰期长生产工艺复杂第四代PAI-1抑制剂可以口服给药半衰期长价格低廉仍处于试验阶段未开发用于临床组织纤溶酶原激活剂2.1基因与工程细胞构建302.1.6实例第30页/共36页tPArPA

527个氨基酸分子量65kD缺失突变

355个氨基酸

分子量39kDKringleⅡ、丝氨酸蛋白酶区Finger区、KringleⅠ、KringleⅡ、EGF区、丝氨酸蛋白酶区2.1

基因与工程细胞构建组织纤溶酶原激活剂312.1.6实例第31页/共36页2.1基因与工程细胞构建组织纤溶酶原激活剂322.1.6实例第32页/共36页