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文档简介

———柱层析常见的几种方法

柱色谱法是一种常用于分离复杂混合物中分子的方法。与平面色谱不同，在柱色谱中固定相或树脂被填充到色谱柱中。然后流动相通过填充的固定相以实现分离。这种分离的目的可以是分析性的或制备性的。柱层析在玻璃、塑料或金属柱内的填充三维固定相上进行，可用于制备和分析目的。柱层析技术包含基于不同固相和液相化学和柱配置的广泛应用，能够实现精确分析以及分离难以或不可能通过其他方法分离的复杂混合物。

有许多系统可用于液相色谱，系统的选择取决于所需分离的复杂性。流动相可以通过重力流、使用离心力或使用基于泵的自动系统通过固定相。基于泵的系统范围从由蠕动泵和馏分收集器组成的更简单的低压色谱系统到复杂的中压色谱系统和包括多波长检测器和缓冲液混合功能的高压液相色谱系统。因此，柱色谱根据所用流体流动系统的类型进行分类：重力色谱、低压层析、中压色谱（包括快速蛋白液相色谱）、高压/高效液相色谱(HPLC)。其中，重力色谱通常用于小规模的制备色谱。低压和中压色谱系统通常用于中等规模的制备应用。中压系统用途更广可用于分析和制备目的。高压系统允许对蛋白质或小分子进行高分辨率分离，最常用于分析目的。

一、重力色谱：

重力色谱利用重力使样品和缓冲液通过分析柱的树脂。尽管预装重力柱在市场上有售，但实验室自己装柱填充的情况并不少见。重力色谱法是一种低成本、简单的制备色谱法，但它不能提供高分辨率。重力色谱可应用于核酸、肽和蛋白质的小规模、快速制备层析等方面。

二、低压层析：

低压层析系统在低于50psi(0.35MPa)的压力下运行。这些系统需要一个样品泵并且通常配备馏分收集器、梯度能力和检测器来监测柱洗脱。低压系统与预装柱兼容，并提供比重力色谱更大的灵活性和更高的分辨率。尽管如此，低压层析并不是一种适用于复杂蛋白质纯化的高分辨率层析方法。低压层析应用于天然或重组蛋白质的中等规模制备层析。

三、中压色谱：

中压色谱，也称为快速蛋白液相色谱，更适用于复杂的纯化，也可用于分析目的。中压色谱法是在实际上相当高的操作压力下进行的，最高可达3500psi(24MPa)。中压色谱系统通常包括附加功能，例如柱切换阀、高级梯度功能和多波长检测器。这些系统与各种预装柱和树脂兼容，中压色谱可应用于简单的重组蛋白纯化以及从非挥发性有机物到核酸、肽和蛋白质的分析目的。

四、高压液相色谱：

高压液相色谱法(HPLC)也称为高效液相色谱法，是在高达5,000psi(34MPa)的压力下进行的。HPLC是一种强大的分析工具，具有高分辨率和灵敏度，能够检测低至万亿分之一的浓度，同时具有非常小的样品需求。由于HPLC系统可以在更高的压力下运行，因此可以减小树脂的粒径，从而提高树脂的分辨率。

使用HPLC分析的化合物种类很多，所以HPLC系统通常具有多种类型的检测器。一种常见的组合是紫外吸光度检测器与蒸发光散射检测器(ELSD)和/或质谱仪(MS)的组合。HPLC和质谱法的结合产生HPLC-MS，通常缩写为LC-MS，一种非常强大的分析工具，用于

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