应用文章 使用脂质纳米颗粒对人类原代 T 细胞进行基因编辑

———应用文章使用脂质纳米颗粒对人类原代T细胞进行基因编辑

嵌合抗原受体(CAR)在T细胞上的表达将患者的细胞转化为基于细胞的癌症疗法，并彻底改变了当今的癌症治疗格局。尽管这项技术取得了成功，并获得了业界的积极响应，但市场对于借助CRISPR/Cas介导的基因编辑技术实现更复杂基因工程的需求日益高涨。复杂基因工程的应用包括：破坏肿瘤微环境所利用的抑制途径、提高CART细胞的效率4,5和使用同种异体供体生产通用CART细胞。业界迫切希望在下一代T细胞疗法中同时实现基因编辑和转基因表达，这凸显了在细胞功能、细胞产量、生产简化和放大工艺中发挥关键作用的遗传物质递送方法的重要性。一种有前景的新型T细胞工程方法是，使用RNA来表达治疗性蛋白质和基因编辑核酸酶。RNA通常通过电穿孔递送至细胞，但在多步基因工程中使用连续电脉冲时，需要在效率和细胞活力之间进行仔细权衡。而脂质纳米颗粒(LNP)则无需进行这种权衡，使其成为一种具有吸引力的RNA递送替代方法。LNP是完全合成的脂质配方，用于在将RNA递送到细胞之前对其进行包封和保护。目前，LNP的生产已经成熟，并且可放大用于大规模基因递送和基因编辑，而这是满足当下和未来临床需求的关键。RNA-LNP复合物在结构上与低密度脂蛋白(LDL)类似，并可以利用LDL的内源性摄取途径，通过受体介导的内吞作用进入细胞。这种温和的摄取机制能够成功地进行T细胞基因工程，同时保持高细胞活力。

在本文中，我们报告了一种使用GenVoy-ILMTCellKitformRNA对T细胞进行连续基因工程的新型方法。我们利用优化的生产工作流程来递送各种RNA（图1）。在本案例研究中，我们介绍了CRISPR/Cas9介导的T细胞受体(TCRɑ)敲除(KO)技术，并探讨了使用多步LNP工程（一种有前景的同种异体CART细胞疗法）来产生TCRɑKOCART细胞。我们还详细描述了LNP生产和细胞培养处理方案，以及T细胞基因编辑的优化策略，以确保使用GenVoy-ILMTCellKitformRNA成功进行基因工程。图1.使用脂质纳米颗粒对人类

原代T细胞进行基因编辑。

基因敲除是通过递送Cas9mRNA和合成向导RNA(sgRNA)实现的。在递送和翻译后，Cas9蛋白和sgRNA在细胞内结合，并穿梭到细胞核中进行靶基因的双链断裂。如果没有DNA供体模板，绝大多数断裂会通过易突变的非同源末端连接(NHEJ)进行结合，从而永久性敲除靶蛋白。

原代T细胞的基因编辑可以通过许多酶来实现，包括转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)、锌指核酸酶(ZFN)和成簇的规则间隔短回文重复序列(CRISPR)Cas9。其中，CRISPR/Cas9因易于进行靶标选择和优化而越来越受欢迎。在CRISPR/Cas9介导的基因编辑中，Cas9蛋白通过向导RNA被导向靶DNA，并诱导双链断裂，这些断裂大多通过非同源末端连接(NHEJ)修复。RNA导向的CRISPR/Cas9系统能够灵活地进行靶标选择和多重基因编辑，为CART细胞治疗创造了巨大的潜力

传统上，病毒载体用于T细胞工程，但存在几个限制，包括有限的包载量、不良免疫反应和高生产成本。为了避免病毒载体的这些缺点，电穿孔的使用日益普及；然而，如上所述，同时实现基因编辑和蛋白质表达所需的连续电脉冲可能对细胞有害。这会降低细胞活力和产量，造成基因失调，并增加细胞衰竭标记基因的表达。

尽管LNP相关研究的数量有限，但Billingsley等人的两项近期研究表明，与电穿孔和/或慢病毒转染相比，原代T细胞中LNP介导的CD19CARmRNA表达具有同等的肿瘤杀伤效力。

GenVoy-ILMTCellKitformRNA提供了一种临床相关、可放大的LNP基因编辑方法，以推进细胞治疗领域的发展，其利用的LNP技术也是变革新冠肺炎mRNA疫苗开发工作的强大技术。这项工作旨在展示LNP在治疗性蛋白表达和先进T细胞工程中的强大作用。我们对用于包封商用Cas9mRNA和向导RNA(sgRNA)的LNP的封装、包载比率和多导向组合进行了优化。此外，我们展示了LNP可以无缝整合到标准原代T细胞培养工作流程中，以及多次LNP添加如何产生基因编辑的CART细胞。借助NanoAssmblrSpark微流控平台，这些研发规模的RNA-LNP在不到5分钟的时间内产生，并直接添加到细胞中。

这项工作表明，使用GenVoy-ILMTCellKitformRNA生产的LNP能够高效地进行靶标敲除（两个sgRNA为808%）和CAR蛋白表达(915%)，同时保持高细胞活力(90%)。所得的基因编辑CART细胞与白血病细胞共培养，并显示出高效的靶标特异性杀伤作用，而基因编辑本身对治疗潜力没有负面影响。图2.原代T细胞基因编辑和多步工程工作流程。第1天-解冻并活化冻存的人类原代PanT细胞。第1-4天生产LNP，评估RNA包封效率以确定剂量。第4天-活化的T细胞与基因编辑RNA-LNP一起孵育。第4-11天-细胞扩增以增加细胞数量用于随后的实验。第13天-用CARmRNA-LNP处理基因编辑细胞，表达治疗性抗CD