动物细胞融合实验操作简要流程

———动物细胞融合实验操作简要流程

定义：

动物细胞融合是指两个或者多个动物细胞结合形成一个细胞的过程。融合后形成具有原来两个或多个细胞遗传信息的单核细胞，称为杂交瘤细胞。

动物细胞融合通常有物理法（电刺激）、化学法（聚乙二醇）、生物法（灭活病毒）三种方法。

而杂交瘤细胞是由经免疫的B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合而成的，既有无限增殖能力又能产生特定抗体能力的细胞。

实验材料：DMEM高糖培养基

FBS/NBS

生物安全柜

灭菌手术剪刀、镊子

HAT或HT选择培养基

CO2细胞培养箱

双抗（青链霉素混合液）

5mL一次性无菌注射器

单通道移液枪、多通道移液枪

低速离心机

倒置相差显微镜

15mL、50mL无菌离心管[NEST]

96孔细胞培养板[NEST]

100mm细胞培养皿[NEST]

200L、1000L吸头[NEST]

220目（70m）细胞筛[NEST]

实验准备：饲养细胞：

融合前一天，取符合免疫质控标准的Balb/c小鼠，脱颈处死并泡在75%酒精中消毒。

用手术剪刀轻轻剪开老鼠的腹部皮肤。（注意请勿破坏小鼠的腹膜）取10mLDMEM培养基在50mL无菌离心管中，5mL注射器吸取3~5mL培养基，用手术镊子提起小鼠腹膜，将5ml培养基打入老鼠腹部，反复吹打3-4次后将培养基回收，置于50ml无菌离心管中。再次吸取5ml培养基，重复此步骤。在无菌条件下取出小鼠脾脏，用研磨器研磨脾脏，与DMEM混合过筛网制成单个脾细胞悬液，再与腹腔细胞悬液混合，低速离心（1000rpm*10min），弃上清。使用HAT培养基重悬，制成饲养细胞悬液，可按照105/孔使用，均匀铺96孔板，每孔100L。（在制备过程中严格保证无菌）

SP2/0准备：SP2/0细胞在融合前45天复苏，培养换液，使细胞在融合前状态良好且处于对数增长期。试剂准备：

取1mL/管50%PEG1450一支，DMEM，FBS-DMEM，FBS-DMEM(HAT)等试剂，均预热置37℃

实验流程：

SP2/0收集：

SP2/0低速离心（1000rpm*5min），弃上清，用DMEM复悬清洗，再重复一次此步骤，37℃复悬备用。

脾细胞悬液制备：

取免疫完成的小鼠，眼球取血后，浸润在75%的酒精中消毒灭菌。在无菌条件下取出其脾脏，使用研磨器研磨脾脏，与DMEM混合过筛网制成单个脾细胞悬液，低速离心（1000rpm*10min），弃上清，用DMEM清洗并再一次重复此步骤，37℃复悬备用。

细胞融合：

将脾细胞和SP2/0按照[脾细胞：SP2/0=2:1~3:1]的比例，混合于50ml离心管中低速离心（1000rpm*10min），弃上清且确保管内无液体残留，将细胞团块轻轻敲散，使脾细胞SP2/0在管底均匀混合铺开。加入预热完成的50%PEG1450，在1min内逐滴均匀加入，加完后37℃反应1min，反应完成后加入10~15ml左右终止液（DMEM）终止反应，由慢至快逐步滴加，10min全部加入完成。

融合铺板：

细胞融合完成后，低速离心（1000rpm*10min），弃上清，使用FBS-DMEM(HAT)复悬细胞制成细胞悬液，（过程中注意动作轻柔，不可用力吹打，以免破坏融合细胞降低融合率）。将提前一天已加入饲养细胞的细胞培养板取出，用吸头将板内培养基上清全部吸出丢弃，将刚制备完成的细胞悬液加入96孔培养板中，每孔200L，转入5%CO2恒温培养箱中培养观察。

融合换液：

融合细胞在FBS-DMEM(HAT)中培养3~7天，根据细胞融合情况，将培养上清吸出丢弃，更换成FBS-DMEM(HT)，每孔200L。换液后观察细胞形态，根据细胞生长情况，在4~7天后用Elisa进行融合阳性筛选检测。

附：