ELISA酶联免疫吸附剂测定的分类和实验流程

———ELISA酶联免疫吸附剂测定的分类和实验流程

定义：

酶联免疫吸附测定（简写ELISA）指将可溶性的抗原或抗体结合到聚苯乙烯等固相载体上，利用抗原抗体特异性结合进行免疫反应的定性和定量检测方法。

常用的ELISA可以分为五大类：直接ELISA、间接ELISA、夹心ELISA、竞争ELISA、竞争抑制ELISA。其他的ELISA都由这五类组合衍生。

所有的ELISA基本由基础的几个步骤组合而成：将抗原或抗体吸附到固相载体上；加入待检样品以及后续试剂；温育；洗涤去掉游离未结合的反应物；加入酶检测底物；结果的判读

分类：

1.直接ELISA

将抗原按一定的比例稀释，包被到固相载体上，加入稀释好的特异性的酶标抗体，孵育后加入底物显色并判读结果。直接ELISA中只经过了一步信号放大，所以其灵敏度不是很高

2.间接ELISA

间接ELISA与直接ELISA不同的是，与包被好的抗原结合的是非酶标抗体，另外再引入第二种抗体（即二抗）。二抗是经过酶标的，它可以与第一种抗体特异性结合，最后加入底物显色并判读结果。在检测抗体的效价、血清的效价以及单克隆抗体的筛选过程中，间接ELISA都是非常重要的实验过程。

3.夹心ELISA

3.1直接夹心ELISA

3.1.1双抗体夹心ELISA

将第一种抗体（捕获抗体）包被在固相载体上，封闭后加入待检抗原，温育后加入第二种抗体（检测抗体），捕获抗体和检测抗体可以是针对不同表位的两种单抗，也可以是针对同一抗原的一种单抗与一种多抗，但是检测抗体需要经过酶标。

3.1.2双抗原夹心ELISA

原理和操作与双抗体夹心ELISA基本相同，不同的是包被的是抗原，待检对象是抗体，然后加入酶标抗原，再加底物显色。双抗原夹心ELISA利用特异性的抗原代替酶标二抗，所以特异性比间接法更好。另外，由于间接ELISA中使用的二抗一般只能识别IgG，而双抗原夹心ELISA中任何类似的免疫球蛋白都可以被检测出，因此，双抗原夹心ELISA比间接ELISA也更灵敏。

3.2间接夹心ELISA

间接夹心ELISA是基于两种不同种属来源的抗体的夹心ELISA，其原理是将一种种属来源的特异性抗体包被于固相载体上（作为捕获抗体），封闭，加入待检抗原，温育，洗涤后加入另一种种属来源的特异性抗体（非酶标，作为检测抗体），最后加入酶标二抗（特异性识别检测抗体），再加底物显色。与直接双抗夹心ELISA相比，其中引入了特异性识别检测抗体的酶标二抗，相当于整个体系的信号增加了一步放大系统，最终的结果比直接双抗夹心ELISA更灵敏。

4.竞争ELISA

将特异性抗体吸附于固相载体表面，经洗涤后分成两组：一组加酶标记抗原和被测抗原的混合液；而另一组只加酶标记抗原，再经孵育洗涤后加底物显色，这两组底物降解量之差，即为所要测定的未知抗原的量。这种方法所测定的抗原只要有一个结合部位即可，因此，对小分子抗原如激素和药物之类的测定常用此法。

5.竞争抑制ELISA

预先将抗原包被在固相载体上，实验时加入稀释好的待检抗原（或抗体），然后依次加入特异性的抗体以及此抗体对应的酶标二抗。待检标本中的抗原（或抗体）就和预制备体系中固相载体上结合的抗原（或抗体）竞争结合特异性的抗体（或固相载体上结合的抗原）。洗掉被竞争的特异性抗体，最后加底物显色。最终显色的结果与待检抗原（或抗体）量呈反比。

实验材料：

96孔高吸附酶标板[NEST]10L/200L/1000L吸头[NEST]

单通道移液枪、多通道移液枪微量离心管[NEST]

显色液（A/B液）15/50ml离心管[NEST]

洗液（PBST）终止液（H2SO4）

BSA蛋白稀释液（PBS）

包被液（CB）全波段酶标仪

恒温箱

实验流程：

以使用比较广泛的间接ELISA为例，简述实验过程

1.抗原包被：

将对应抗原用CB稀释至1ug/ml，加入96孔酶标板孔中，每孔100ul，4℃包被过夜，之后进行下一步骤。若实验时间比较紧张，包被后可放置恒温箱内，37℃包被3h后即可进行下一步操作。

2.洗板：

将酶标板内的包被液甩干，用洗液（PBST0.2%的吐温20PBS）清洗酶标板2次，并拍干板内液体，使之无余液残留。

3.封闭：

用PBS充分溶解BSA蛋白制备成封闭液（体积比为5~10%），将封闭液加入酶标板孔中，每孔150ul，恒温箱37℃封闭1h。若实验时间安排充裕，可在4℃条件下封闭过夜。

【若抗原内含有偶联BSA分子，则更换封闭成分，可用羊血清代替】

4.洗板：

将酶标板内的封闭液液甩干，用洗液（PBST）清洗酶标板2次，并拍干板内液体，使之无余液残留。

【若暂无使用需求，可将包被后的酶标板放置-20℃条件下储存，需要时解冻使用即可。】

5.一抗：

用PBS稀释液将待检样品（含有对应抗原的抗体）按需求稀释，再将稀释后样本加入包被好的酶标板中，每孔100ul，阴性对照孔加入100ulPBS稀释液，在恒温箱中37℃孵育1h。

6.洗板：

将酶标板内的一抗甩干，用洗液（PBST）清洗酶标板3次，并拍干板内液体，使之无余液残留。

7.二抗：

用PBS稀释液按照说明，稀释对应的酶标二抗，将稀释完成的二抗加入一抗孵育完成的酶标板中，每孔100ul，恒温箱37℃孵育30min。

8.洗板：

将酶标板内的二抗甩干，用洗液（PBST）清洗酶标板4次，并拍干板内液体，使之无余液残留。

9.显色：

将显色液A/B液等体积混合，配置成显色液，加入二抗孵育完成的酶标板中，每孔100ul，恒温箱避光37℃反应5~10min。

【显色液现配现用，不可提前配置】

10.终止与读数：

显色完成后，无须丢弃显色液，直接加入终止液（H2SO4）终止反应，每孔50ul，随即转移至全波段酶标仪450nm单