血液分子生物学造血干细胞

血液分子生物学造血干细胞第1页，共65页，2023年，2月20日，星期二造血干细胞的生物学

一、造血干细胞的增殖和分化造血干细胞（hematopoieticstemcell,HSC）是各种白细胞和免疫细胞的始祖，担负极其重要的生理功能。

具有三个重要特征：①高度自我更新或自我复制的能力；②多向分化潜能；③绝大多数可长期维持在非增殖状态，这些特征随着干细胞的分化逐渐减弱和消逝。第2页，共65页，2023年，2月20日，星期二造血干细胞的生物学

一、造血干细胞的增殖和分化HSC的自我更新及分化增殖受众多的细胞因子调节，包括干细胞因子（SCF）、血小板生成素（TPO）、红细胞生成素（EPO）、白细胞介素11（IL-11）、粒细胞集落刺激因子（G-CSF）、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）及趋化因子等多种因子。

第3页，共65页，2023年，2月20日，星期二造血干细胞的特征和识别

造血干细胞没有明确的形态学特征，形态上都表现为淋巴样的单个核母细胞，这就给干细胞从形态的识别和检测带来了困难。但从干细胞的功能及细胞表面抗原的表达上则为造血干细胞的识别和分离提供了条件。

第4页，共65页，2023年，2月20日，星期二造血干细胞的特征和识别（一）功能的角度，可用细胞培养方法在体外观察细胞发育潜能

集落形成单位（CFU）

第5页，共65页，2023年，2月20日，星期二造血干细胞的特征和识别X

（一）功能的角度，可用细胞培养方法在体外观察细胞发育的潜能，1、脾集落形成单位（CFU-S）

是较早期的造血干细胞，具有形成红细胞、中性粒细胞、嗜酸粒细胞、巨核细胞或混合多种造血细胞的多向分化能力。2、髓系多向祖细胞集落（CFU-GEMM）是检测可以生成红细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和巨核细胞的祖细胞，它具有一定的自我复制能力，有向不同细胞学分化的能力，具有造血干细胞的部分功能。3、长期培养起始细胞（LTC-IC），是指那些经5-8周培养后仍能生成单向或多向性祖细胞群的造血细胞，比较接近多能干细胞，这种检测方法是近几年实验和临床研究中国的较多、较可靠的干细胞检测方法。上述检测和实验的方法都不能直接识别单个干细胞。

第6页，共65页，2023年，2月20日，星期二造血干细胞的特征和识别

（二）细胞表面抗原表达及其单克隆抗体1、CD34+细胞为具有造血重建能力的人造血干细胞，2、CD34+

、Thy－1low、Lin-为造血干细胞特征，其中Thy为胸腺细胞表面抗原标记，Lin为特定细胞系的系列标记，如果表达阳性，那么它就成为已分化的细胞。3、CD34+

、CD33-、Lin-、HLA―DR-代表造血干细胞，其中HLA―DR与细胞的增殖有关，而干细胞常处在非增殖状态，因此干细胞应不表达HLA―DR。第7页，共65页，2023年，2月20日，星期二4、CD34+

、Lin-、Sca-1+

、C―Kit+

细胞属多能造血干细胞。5、AC133是一个新的造血干细胞标记，AC133特异在造血干细胞和早期祖细胞上表达，6、近几年实验研究发现CD34-造血细胞比CD34+造血细胞更为原始，它能分化为CD34+细胞并进一步向髓系和淋巴系发育。

第8页，共65页，2023年，2月20日，星期二CD34+细胞选择法亲和柱层析，分离和免疫磁珠法。通过特异性识别、俘获及洗脱分离得到CD34+细胞。（1）亲和柱层析:将预分选的细胞与生物素化（biotinglated）的抗CD34抗原的单抗一起孵育，然后洗去未结合的抗体，通过抗生物素蛋白包被的聚丙酰胺柱的亲和柱，使CD34+细胞留滞在柱内的聚丙酰胺表面上，再经机械摇动，冲洗出CD34+细胞。

第9页，共65页，2023年，2月20日，星期二（2）免疫磁珠分离法

CD34单抗标记细胞后，与超顺磁性微球连接、通过强磁场中的过滤柱时，阳性细胞被吸附，阴性细胞被滤掉。研制出了纳米微粒作为固相收集CD34+细胞。通过将采集物与抗CD34抗原的单抗结合，细胞特异地被超顺磁铁－葡聚糖纳米（直径50nm）微球结合，使CD34+细胞与纳米微球形成复合物，再通过磁铁诱导的强磁场过滤柱，分离出CD34+细胞。其CD34+细胞回收纯度＞95％,回收率67%以上。第10页，共65页，2023年，2月20日，星期二

造血干细胞（HSC）主要来源于骨髓、成人外周血、脐血脐血来源干细胞的特点CD34＋细胞数低于骨髓，但CD34＋CD38-细胞数高于骨髓，且脐血CD34＋CD38-细胞增殖分化能力高于骨髓，尤其是加入各种细胞因子后CFU-GEMM（多向祖细胞）、BFU-E（红系祖细胞）集落数明显高于骨髓。淋巴系统抗原表达弱，淋巴细胞功能不成熟，这显示出脐血干细胞移植(UCBT)后移植物抗宿主病(GVHD)的发生率可能较低。研究表明冻存10年的脐血HSC仍具有良好的回收率。第11页，共65页，2023年，2月20日，星期二

造血干细胞的可塑性

造血干细胞不仅能重建造血细胞,而且能分化心肌细胞、骨骼肌细胞、内皮细胞、肝细胞、胆管上皮细胞、消化道上皮细胞、肺上皮细胞等。

另外：骨髓基质干细胞在恰当的刺激下能转化为脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞、骨骼肌细胞、星形细胞、神经元细胞、心肌细胞等细胞。骨髓多能前体细胞,其表达胚胎干细胞的遗传标志,体外培养条件类似于胚胎干细胞,且能高度扩增;在体外它不仅能分化成基质细胞,而且能分化为内脏中胚层、神经外胚层细胞和肝细胞等内胚层细胞。

第12页，共65页，2023年，2月20日，星期二

干细胞的可塑性

对造血系统被破坏的小鼠进行肌细胞移植后,小鼠造血功能恢复,是由于肌肉组织内的造血干细胞的作用引起.■

肝损害的小鼠进行骨髓移植后,肝脏再生的原因是骨髓中的卵圆细胞在肝内转化为肝细胞.第13页，共65页，2023年，2月20日，星期二

干细胞可塑性机制干细胞可以经历转分化的过程,细胞的基因信息可以重组,经过基因重组,细胞能够转化为多种不同的细胞.

如从视网膜神经中提取少突胶质细胞,在体外无血清,低密度的培养条件下,获得神经干细胞的功能和特征.细胞融合是最近对干细胞可塑性的又一种解释.

如将小鼠骨髓干细胞和胚胎干细胞,或小鼠神经干细胞和胚胎干细胞共培养后,获得的融合细胞表现胚胎干细胞的功能和特征.

第14页，共65页，2023年，2月20日，星期二造血干细胞移植及在肿瘤治疗中的应用

HematopoieticStemCellTransplantationinCancerThearpy

造血干细胞移植（hematopoieticstemcelltransplantation;HSCT）的概念

是经大剂量放、化疗或其他免疫抑制剂进行预处理，清除受者体内的病理细胞（肿瘤细胞、异常克隆细胞、病态造血细胞）或阻断发病机制，然后把异体或自体的造血干细胞移植到受者体内，以重建受者的正常造血及免疫功能，达到治疗疾病目的的治疗手段。第15页，共65页，2023年，2月20日，星期二造血干细胞移植概况

自1993年以来，自体外周血干细胞移植（autologousperipheralbloodstemcelltransplantation;APBSCT）的数量超过了自体骨髓移植（ABMT）。近几年，随着对脐血研究的不断深入，发现人类脐血中含有大量的造血干/祖细胞，其中淋巴细胞抗原性弱，功能相对不成熟，移植后发生急性移植物抗宿主病（GVHD）的危险性低等，已成为造血干细胞移植的又一方法，即脐血干细胞移植（cordbloodstemcelltransplantation,CBSCT）。第16页，共65页，2023年，2月20日，星期二造血干细胞移植种类及特点

一、移植种类（一）根据造血干细胞来源分类

1、骨髓移植（bonemarrowtransplantation,BMT）.

2、外周血干细胞（peripheralbloodstemcelltransplantation,PBSCT）。

3、脐血干细胞移植（cordbloodstemcelltransplantation,CBSCT）。（二）根据供者来源不同分类

1、同基因造血干细胞移植（syngeneicHSCT,syn–HSCT）。

2、异基因造血干细胞移植（allogeneicHSCT,allo–HSCT）。

3、自体造血干细胞移植（autologousHSCT,AHSCT）.

第17页，共65页，2023年，2月20日，星期二造血干细胞移植种类及特点（三）二者结合分类

1、同基因骨髓移植（Syn–BMT）

2、同基因外周血干细胞移植（Syn–PBSCT）

3、异基因骨髓移植（allo–BMT）

4、异基因外周血干细胞移植（allo–PBSCT）

5、自体骨髓移植（ABMT）

6、自体外周血干细胞移植（APBSCT）

7、脐血干细胞移植（CBSCT）（四）根据预处理强度分

1、清髓性异基因造血干细胞移植

2、非清髓性异基因造血干细胞移植

第18页，共65页，2023年，2月20日，星期二造血干细胞移植种类及特点二、各类造血干细胞移植特点（一）同基因造血干细胞移植

1、供者为同卵孪生同胞，不存在HLA（humanleukocyteantigen）差异。

2、易于植入，不存在排斥及移植物抗宿主病（GVHD），亦无移植物抗白血病效应（GVL）。

3、不需进行移植细胞的体外净化。

4、移植并发症较少，安全性高，移植费用较低。

5、移植后恶性疾病复发率较异基因造血干细胞移植为高。

6、移植适应症较广泛。

第19页，共65页，2023年，2月20日，星期二造血干细胞移植种类及特点（二）异基因造血干细胞移植

1、需要有HLA相同的同胞或非血缘关系志愿者作为供者，理论上同胞兄妹间有1/4的机会相配，非同胞兄妹间约1/10万-1/20万。

2、供受者之间存在不同程度的免疫学差异，移植后可发生排斥反应及移植抗宿主反应GVHD。

3、供者干细胞为正常细胞，移植适应症广泛。

第20页，共65页，2023年，2月20日，星期二4、移植物中无残留病变细胞，不需体外净化，移植后有抗白血病效应，因而移植疗效确切，肿瘤性疾病的复发率低，效果最好。

5、移植相关并发症、死亡率较高，移植费用较高。

6、移植成活后，因GVHD的影响，生存质量较自体移植差。

第21页，共65页，2023年，2月20日，星期二造血干细胞移植种类及特点（三）自体造血干细胞移植AHSCT

1、供者为患者本人，不受供髓来源限制。

2、是否适宜进行AHSCT，受患者自身病情限制，移植适应症较窄。

3、因移植物中可能有残留病变细胞，移植后病情复发率较高。

4、需考虑进行体外净化处理移植物，以改善疗效。

5、移植相关并发症、相关死亡率较低，适宜移植患者的年龄范围较大，移植费用较低。

6、无GVHD，移植成功后生存质量较好。第22页，共65页，2023年，2月20日，星期二造血干细胞移植种类及特点（四）外周血干细胞移植

1、外周血中造血干细胞收集比较方便，用血细胞分离机进行分离、采集，采集方法可重复，供体无需麻醉，可免于多部位骨髓穿刺的痛苦和不便，供者易于接受。

2、因从外周血进行造血干细胞的采集，对骨髓有浸润纤维化或接受过骨盆放疗的患者仍可施行。

3、正常情况下外周血干细胞含量很少，需进行动员处理方可有效增加外周血干细胞含量，以供移植时采集。

第23页，共65页，2023年，2月20日，星期二

4、与骨髓相比，外周血中肿瘤细胞混入可能较少，自体移植后外周血移植复发率可能低于自体骨髓移植。

5、外周血干细胞移植PBSCT后造血功能重建快，免疫功能恢复早，感染出血并发症低且轻，降低了移植相关死亡率，缩短了住院时间。

6、PBSCT时，因外周血干细胞中存在大量T淋巴细胞，可能增加GVHD的发生率或加重GVHD的程度。

第24页，共65页，2023年，2月20日，星期二造血干细胞移植种类及特点（五）脐血造血干细胞移植

1、脐血干细胞来源广泛，采集方便，作为造血干细胞容易获得，但需冻存保存，保存条件要求高，规模要求大，需相当投资规模的脐血库来进行保存。

2、脐血淋巴细胞抗原性弱，免疫功能不成熟，脐血干细胞移植后GVHD的发生率及严重程度较低。因此，对HLA配型的要求和严格程度低于骨髓移植。

3、造血重建较慢。

4、单份脐血量较少（约50-150ml），造血干细胞数量有限，目前临床上主要用于儿童或低体重成年人，大体重成年人的广泛应用仍在探索中。

第25页，共65页，2023年，2月20日，星期二造血干细胞移植种类及特点（六）非清髓性异基因造血干细胞移植（nonmyeloablativeallogeneicstemcelltransplantation）

1、处理（放/化疗）剂量低。

2、预处理减弱同时加强免疫抑制用药。

3、移植后造血常呈供受者两种血细胞的混合嵌合状态。

第26页，共65页，2023年，2月20日，星期二造血干细胞移植的适应症X一、异基因造血干细胞移植适应症（一）肿瘤性疾病

1、急性白血病为allo-HSCT的主要适应症，移植时机以在初次完全缓解期进行，效果为好，但儿童ALL标危型和AMLM3型可能通过化疗获得良好的效果，一般主张在第二次缓解或早期复发的时候进行。

2、慢性粒细胞性白血病allo-HSCT是目前可以根治CML的惟一手段，年龄越轻，疗效越好，对45岁以下患者应尽早做，确诊后17个月内行HSCT，效果优于17个月后行HSCT。加速期或急变期的疗效差，成功率低。

第27页，共65页，2023年，2月20日，星期二异基因造血干细胞移植适应症X

（一）肿瘤性疾病

3、骨髓增生异常综合征主要用于幼稚细胞比例较高或有复杂染色体异位的患者。allo-HSCT治疗可使患者3年无病生存率接近50%，相当一部分可获根治，尤其年轻患者，早期移植者疗效佳。

4、恶性淋巴瘤对高危型、难治性、多发性或骨髓被累及者宜行allo-HSCT。

5、多发性骨髓瘤早期治疗效果优于晚期治疗，allo-HSCT不能使MM患者已发生的骨质损害恢复正常。

6、实体瘤：乳腺癌、卵巢癌、小细胞肺癌等。第28页，共65页，2023年，2月20日，星期二异基因造血干细胞移植适应症X（二）非肿瘤性疾病

1、重症再生障碍性贫血为非肿瘤性疾病中接受BMT最多的疾病，未输血前行allo-HSCT治疗效果明显好于输血后行allo-HSCT。

2、免疫缺陷病包括重症联合免疫缺陷病（遗传性）、自体免疫性疾病。

3、遗传代谢病包括范可尼综合征、高雪病、尼曼–匹克病。

4、珠蛋白生成障碍性贫血allo-HSCT可使患者无病长期存活率达70%~90%，对无脾大或门脉纤维化的患者，效果尤佳。但是本病为慢性疾病，对症治疗可使患者生存相当长的时间，allo-HSCT有一定的近期病死率及远期并发症，是否做移植要权衡利弊。

5、阵发性睡眠性血红蛋白尿、急性放射病等。

第29页，共65页，2023年，2月20日，星期二自体造血干细胞移植适应症

X（一）恶性血液病

1、急性白血病，一般应在初次完全缓解后并进行3~4个疗程巩固化疗后进行。

2、慢性粒细胞白血病，AHSCT对慢性粒细胞性白血病的疗效差，很难消除Ph1染色体阳性克隆，复发率高，一般不主张做。有学者研究用经过补体长期培养及分选技术分选出的ph1（‐）细胞做AHSCT，似有发展前景。

3、霍奇金病，对经过3~4个常规疗程化疗仍未能获得CR患者或取得CR后复发者宜进行AHSCT。

4、非霍奇金淋巴瘤（NHL），低恶度NHL病情急变者，中高恶度NHL，首次治疗达CR后巩固强化治疗或仅达部分缓解（PR）者及常规化疗取得CR后又复发的患者均是AHSCT的适应症。

恶性淋巴瘤是AHSCT的最好适应症，是AHSCT做得最多的病例。

第30页，共65页，2023年，2月20日，星期二自体造血干细胞移植适应症X

（一）恶性血液病

5、多发性骨髓瘤（MM），由于MM患者年龄多偏大，常规治疗MM有效率较低，因此MM成为AHSCT较好的适应症。

6、慢性淋巴细胞白血症（CLL），对于常规治疗效果不佳的进展性的CLL，AHSCT是其有效的选择。

7、原发性巨球蛋白血症（WM），对于常规化疗效果不佳的难治性或进展性的WM，AHSCT可能有很好的效果。（我们的1例难治性、进展期WM，常规治疗无效时行APBSCT，4年后仍处于CR中。）

第31页，共65页，2023年，2月20日，星期二自体造血干细胞移植适应症X（二）实体瘤

1、乳腺癌：AHSCT对转移性或难治局灶性乳腺癌显示了较好的疗效，乳腺癌是目前AHSCT最多的疾病之一。

初治的Ⅲ、Ⅳ期及炎性乳腺癌在常规诱导化疗达CR或PR者，复发乳腺癌对常规诱导化疗方案敏感者，Ⅱ期病人腋淋巴结转移6个以上及有其他不良预后因素者。

2、卵巢癌，AHSCT治疗卵巢癌是一种可望延生其生存期的有效治疗手段。用于手术及化疗失败、复发或难治的患者。

3、小细胞肺癌：小细胞肺癌恶性程度高，易早期发生血性转移，是肺癌症发展最迅猛的一种，对放化疗高度敏感。AHSCT可以提高有效率和生存率。

4、其他：神经母细胞瘤、Ewing肉瘤、恶性黑色素瘤等。（三）非恶性疾病

自体免疫性疾病，如系统性红斑狼疮、原发性血小板减少性紫癜、类风湿关节炎、多发性硬化症等都有移植有效的报道。

第32页，共65页，2023年，2月20日，星期二造血干细胞移植相关技术一、造血干细胞采集目前用于移植的造血干细胞主要来源于骨髓、外周血和脐带血。不同来源的造血干细胞其采集方式不同。

第33页，共65页，2023年，2月20日，星期二骨髓的采集1、骨髓采集的条件（1）自体：①前提：血液系统恶性疾患已取得完全缓解或实体瘤尚未累及骨髓；

②身体条件适宜做自身造血干细胞移植，有移植适应症，无移植禁忌症；③麻醉危险相关的检查，无麻醉禁（2）异体：①年龄：亲属供者年龄一般8-55岁；②身体条件：身体健康，无急、慢性传染性疾病，无特殊家族史及遗传病史，HLA配型适合；③知情同意。

第34页，共65页，2023年，2月20日，星期二骨髓的采集2、骨髓采集的准备

（1）术前体检，了解自体或异体供者的身体状况，进行术前评估，确无禁忌方可采髓。

（2）自体循环备血，移植时所采集的骨髓是骨髓液与血液的混合液。采髓过程中根据采髓量的多少会有明显的失血。因此必须进行采髓前自体循环采血备血，以备采髓时回输补充血容量。

第35页，共65页，2023年，2月20日，星期二骨髓的采集3、骨髓采集方法骨髓的采集必须在洁净手术室内进行，整个过程应保持无菌。麻醉由麻醉师主持与操作，采用硬膜外麻醉。在髂后及髂前上棘行多点穿刺抽吸，每个点在多方向、多层次上进行抽吸，每次抽取4~6ml骨髓液。采集的骨髓予含有肝素的灭菌MPI1640或TC199保养液进行抗凝保养，每100ml保养液加肝素4000单位，庆大霉素2000单位，1ml保养液可抗凝3~8ml骨髓液。第36页，共65页，2023年，2月20日，星期二骨髓的采集每次采集的骨髓量根据具体情况不同而不同，自体骨髓采集细胞数为有核细胞数1×108/kg体重，若采出的骨髓要进行体外净化处理，则需3×108/kg体重以上。异体骨髓采集细胞数为有核细胞数达3×108/kg体重。采出的骨髓液中含有骨髓小粒须经100目金属网过滤，最后装袋，做好标记，保持无菌。患者在开始采髓时即给予输血，在采髓的整个过程中应注意输血及静脉足量输液，予生理盐水和胶体溶液交替输入。采髓结束后，采髓局部应严密消毒，无菌纱布加压包扎，压迫止血。患者回病房后密切观察术后反应，连续给予抗生素3天预防感染。第37页，共65页，2023年，2月20日，星期二4、骨髓采集并发症

骨髓采集基本是安全的，术后反应以局部疼痛最常见，少数患者可发热，偶有与麻醉有关的严重并发症（术后肺炎、心律不齐）或局部感染。

第38页，共65页，2023年，2月20日，星期二外周血干细胞的动员与采集

1、外周血干细胞的动员正常状态下，外周血中的干/祖细胞含量较低，占单个核细胞的0.01%~0.1%。在化疗后骨髓抑制的恢复早期，细胞因子的作用下可有大量的干/祖细胞由骨髓进入到外周血，使外周血在短期内存在有大量的干/祖细胞。此时采集可得到供造血干细胞移植用的足量的造血干/祖细胞。

第39页，共65页，2023年，2月20日，星期二外周血干细胞的动员与采集动员方法

外周血干细胞动员的方式有三种，即大剂量化疗，单用造血生长因子，化疗加造血生长因子。①单用造血生长因子：a、G-CSF：5~10ug/kg.d皮下注射，5~7天。一般大多数供者在G-CSF5ug/kg.d×5天情况下，可使外周血细胞数量明显增加有足够的干/祖细胞供移植时采集，且有量效关系；b、GM-CSF：5~10ug/kg.d皮下注射7~10天。GM-CSF较G-SF的动员作用稍差，付作用较G-CSF大；c、G-CSF+GM-CSF与单用G-CSF相比无明显优点。

第40页，共65页，2023年，2月20日，星期二外周血干细胞的动员与采集②单纯使用化疗动员：a、大剂量环磷酰胺：大剂量环磷酰胺是大剂量单一药物进行动员的代表。4~7g/m2的剂量被广泛认可而采用b、大剂量足叶乙甙（VP16）及马法兰也是单一药物动员中报道较多的药，VP16可用至2g/m2，马法兰可用至140mg/m2；c、联合化疗的动员：很多的资料显示联合化疗作为动员外周血干细胞的方法是确切可行的，只要化疗强度足够能达到骨髓的抑制，就可能成功的动员外周血干细胞。动员方案因疾病的不同可为不同的联合化疗方案。

第41页，共65页，2023年，2月20日，星期二外周血干细胞的动员与采集③化疗加G-CSF联合动员：化疗加G-CSF联合动员外周血干细胞已是较为成熟的动员方法，有很多的应用报道。本动员方法较单用化疗或G-CSF效果更好，且兼顾了原发病的治疗。第42页，共65页，2023年，2月20日，星期二外周血干细胞PBSC的动员与采集（2）影响PBSC动员效果的因素①年龄：在同样动员方案及药物剂量下，动员效果与年龄呈负相关关系。②动员方法：化疗加G-CSF的动员效果较单纯化疗或G-CSF动员效果好。③药物剂量：化疗的剂量、骨髓抑制的程度和白细胞恢复的速度均与动员效果呈正相关关系。G-CSF、GM-CSF的剂量与动员效果亦呈正相关关系。④动员前的治疗情况：动员前化疗次数过多、强度过强，距前一次化疗时间过近，均可影响动员效果。既往化疗中使用了包括卡氮芥和马法兰在内的烷化剂类药物，且剂量过强易使造血干细胞严重受损而影响动员效果。

第43页，共65页，2023年，2月20日，星期二外周血干细胞的动员与采集（3）外周血干细胞动员的并发症及副反应①含有化疗动员方案的动员因在用药后多有白细胞和血小板的明显减少，故感染和出血为其主要的并发症。②含有造血生长因子动员方案的动员常可发生骨痛，以腰骶部和骨盆部的酸、胀、痛为突出，严重时呈全身骨痛，尤以健康供者表现突出。还可有胸膜渗出物，血管神经水肿和发热。使用GM-CSF时，常有发热及流感样症状，这些副反应均随着药物的停用而很快消失。无远期不良反应。

第44页，共65页，2023年，2月20日，星期二外周血干细胞的动员与采集（4）外周血干细胞的采集时机①异体造血干细胞移植的动员以单纯细胞生长因子进行,多在第5、6天时CD34+细胞达峰值，因而多在动员第5、第6天时采集。②自体造血干细胞移植的动员以化疗加细胞生长因子动员为主，CD34+细胞峰值在白细胞快速回升时达峰值，最佳时机是白细胞快速回升至5×109/L左右时。③动态监测CD34+细胞比值的变化，以CD34+细胞值作采集标准，不论异体外周血干细胞移植还是自体外周血干细胞移植，一旦CD34+细胞>1%即可采集。

第45页，共65页，2023年，2月20日，星期二外周血干细胞的动员与采集X（5）外周血干细胞的采集方法①设备：采集外周血干细胞用血细胞分离机②采集：用血细胞分离机对血液进行大量的体外循环处理，血流速度为30~80ml/分，一般处理3倍以上人体血容量（约12L），绝大部分可在一次采够移植所需细胞数。一次采不够可以在第2天重复进行，若2次仍采不够可进行3次。③外周血干细胞采集量：a、异体外周血干细胞，单个核细胞数为5~8×108/kg体重，CD34+细胞数为2~5×106/kg体重，CFU-GM数为2~5×105/kg体重；b、自体外周血干细胞：单个核细胞数为2~5×108/kg体重，CD34+细胞数为>2×106/kg体重，CFU-GM数为>2×105/kg体重。④影响外周血干细胞采集的因素：a、动员效果不佳；b、采集时机不当；c、采血通路与返血通路不通畅；d、体外循环血量不足。

第46页，共65页，2023年，2月20日，星期二造血干细胞保存和回输

（一）造血干细胞的保存造血干细胞保存是造血干细胞治疗技术的重要组成部分，现己广泛用于临床。主要用于自体造血干细胞移植，脐血干细胞的保存及移植，基因治疗、免疫治疗等方面。造血干细胞的保存分为

(1)非冷冻保存

(2)冷冻保存

第47页，共65页，2023年，2月20日，星期二造血干细胞保存和回输

1、非冷冻保存（1）保存方法非冷冻保存最主要的保存方式是4℃冰箱保存。将经肝素抗凝采集的，含有1/3组织培养液MPI1640或TC199保养液的骨髓或细胞浓度为5×107/ml以下。细胞在4℃保存不同时间后细胞回收率结果在各个实验室有差异。但总的情况是：细胞在4℃保存24h其细胞数及活率基本是稳定的，保存3-4天后一般下降为原来的50-80%。目前在临床应用4℃保存的造血干细胞进行造血干细胞移植时，一般均选择在72h以内回输。实践证明，4℃保存72h内的造血干细胞进行自体移植，移植后病人造血均能顺利重建。

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1、非冷冻保存（2）保存特点1、不需要特殊设备，简便易行，在基层医院均可进行。2、细胞不经冷冻过程，无冷冻损伤，回输后造血恢复快。3、细胞液中不含冷冻保存液，回输时无相关副作用。4、保存时间短，应用受限，仅适用于预处理方案时间短的造血干细胞移植情况。第49页，共65页，2023年，2月20日，星期二造血干细胞保存和回输

2、冷冻保存冷冻保存即零下温度保存，是将造血干细胞降温到零下某一温度，使细胞代谢停止后保存于零下温度.这是造血干细胞安全可靠的保存方式，可使造血干细胞长久保存。目前广泛使用的方法有三种。

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（1）程控降温冻存：造血干细胞（骨髓需先进行冷冻前的分离、浓缩处理）在自体血浆或血浆蛋白浓度为5%保护液中，细胞终浓度在3×107~8×108/ml之间，然后缓慢加入冷冻保护剂二甲基亚砜（DMSO），终浓度为10%，分装于冷藏袋内。在程控降温仪内以每分钟1℃~2℃的降温速度进行降温处理，当被冻存细胞降温到-50℃时，则以每分钟下降5℃的速度继续降温，当冻存细胞温度达-80℃后，即放入液氮中（-196℃）长期保存。程控降温冷冻是最安全可靠的造血干细胞长期保存方法。但所需设备价格昂贵，冷冻耗时过长。

第51页，共65页，2023年，2月20日，星期二造血干细胞保存和回输（2）非程控降温冷冻保存造血干细胞不通过程控降温直接冷冻保存于-80℃冰箱的方法，称为非程控降温冷冻保存。该方法是将造血干细胞（分离、浓缩的骨髓、脐血或外周血干细胞）用5%的DMSO+6%羟乙基淀粉（HES）+4%人血清蛋白做为保护剂，调整细胞终浓度1~4×108/ml分装于冷藏袋内，直接放入-80℃冰箱里冷冻保存。这种方法是较简单可靠的方法，且易进行重复操作。但冻存时间不如程控降温冷冻保存时间长。

第52页，共65页，2023年，2月20日，星期二造血干细胞保存和回输（二）冷冻造血干细胞的解冻和回输解冻是低温保存造血干细胞的最后步骤，此过程易引起细胞肿胀、破裂死亡。合理的解冻方法是快速复温解冻，快速复温可缩短细胞解冻肿胀过程，并可避免重结晶现象的发生，尽可能的减少此过程中的细胞破坏。解冻方法一般是采用37℃~42℃水浴解冻熔化细胞。解冻熔化的细胞须在10分钟之内回输，在回输解冻的细胞时，要注意DMSO所致的不良反应，如：头痛、恶心、呕吐、血尿、低血压等。输注前患者要抗过敏、抗休克等预防处理。

第53页，共65页，2023年，2月20日，星期二造血干细胞的净化

（一）体外净化的方法1、物理学方法：①细胞密度梯度法；②细胞电泳法；③细胞渗透性休克法；④细胞冷冻法；⑤高热杀伤法；⑥光敏法第54页，共65页，2023年，2月20日，星期二造血干细胞的净化（一）体外净化的方法2、药理学方法：①环磷酰胺衍生物：A、4-HC（4-羟环磷酰胺的类似物）；B、ASTA-Z（mafosfamide）；②VP-16（足叶乙甙）；③博莱霉素；④长春新碱；⑤高三尖杉酯碱；⑥烷基溶磷脂（ALP）；⑦阿糖鸟嘌呤（Ara-G）

第55页，共65页，2023年，2月20日，星期二造血干细胞的净化（一）体外净化的方法3、免疫学方法：①单克隆抗体+补体；②免疫胶体钴法；③免疫毒素法；④抗体轭化疗药物；⑤抗体轭放射核素；⑥LAK细胞法；⑦免疫吸附法；⑧免疫磁珠法；⑨补体溶解法；⑩流式激活细胞分选法

第56页，共65页，2023年，2月20日，星期二造血干细胞的净化（一）体外净化的方法4、生物学方法；①长期液体培养法；②胎肝低分子抑瘤物5、分子生物学方法：①反义寡核苷酸法；②自杀基因转染法

第57页，共65页，2023年，2月20日，星期二造血干细胞的净化（二）负净化与正净化及特点负净化（阴性选择）即用不同的方法清除造血干细胞中所含肿瘤细胞而保留正常的造血细胞的方法。这种方法的特点是：①特异性较差，对正常造血细胞的损伤较明显；②移植后造血和免疫功能的重建较慢，并发症发生机会增加；③净化效应有限，移植后的复发率较高；④部分方法简便、易操作，无需特殊设备。第58页，共65页，2023年，2月20日，星期二正净化（阳性选择）即利用正常造血干/祖细胞与许多肿瘤细胞表达CD34+抗原的差异，将CD34+的正常造血细胞从造血移植物中分离出来的方法。这种方法的特点是：①避免了细胞毒性药物和免疫毒素净化时可能对正常造血干细胞的损伤；②无需进行抗肿瘤抗体净化的多环节体外处理，减少污染机会；③不会因肿瘤细胞对细胞毒性药物和免疫毒素的敏感性差异而影响净化效应；④移植后造血和免疫功能恢复较快；⑤净化效应较好，移植后复发率有所改善。

第59页，共65页，2023年，2月20日，星期二造血干细胞移植的预处理

预处理是在回输造血干细胞前对患者进行的一个疗程大剂量化疗和/或大剂量放疗。其目的和意义主要在于：①清除体内的恶性细胞或骨髓中的异常细胞群，以达到治疗疾病的目的；②为移植的造血干细胞准备空间，以利移植的造血干细胞定植；③抑制或摧毁受者的免疫细胞和功能，使造