经典液相色谱法

1第1页，共63页，2023年，2月20日，星期二

第1节液-固吸附柱色谱法（LSC）

经典的液—固吸附色谱（liquidsolidadsorptionchromatography，LSC）是以吸附剂为固定相，有机溶剂为流动相，利用不同组分在吸附剂上吸附性能的差异，进行分离分析的方法。用于分离分析极性至弱极性的化合物，不适用于分离分析强极性的物质。一、基本原理1．吸附与吸附平衡第2页，共63页，2023年，2月20日，星期二

吸附过程是试样中组分分子与流动相分子争夺吸附剂表面活性中心的过程。图10-1吸附色谱示意图m.流动相a.吸附剂Xm.流动相中溶质分子Ym.流动相分子Xa.被吸附的溶质分子

第3页，共63页，2023年，2月20日，星期二这种吸附平衡过程可表示为吸附平衡常数:

因为流动相的量很大，近似于常数，而且吸附只发生于吸附剂表面，所以，吸附平衡常数可写成第4页，共63页，2023年，2月20日，星期二CS为溶质在固定相表面的分析浓度，Cm为溶质在流动相中的分析浓度

K与组分的性质、吸附剂的活性、流动相的性质及温度有关。第5页，共63页，2023年，2月20日，星期二K值小，说明该物质的吸附能力弱，在固定相中滞留时间短，移动速率快，先流出色谱柱；若K值大，说明该物质的吸附能力强，在固定相中滞留时间长，移动速率慢，后流出色谱柱。在一定条件下，不同组分因吸附系数的差异得以分离。

2．吸附等温线

在一定温度下，某一组分在固定相和流动相之间达到平衡时，以组分在固定相中的浓度Cs为纵坐标，以组分在流动相中的浓度Cm为横坐标得到的曲线。

第6页，共63页，2023年，2月20日，星期二等温线有三种类型：线性、凸形和凹形。通常在低浓度时，每种等温线均呈线性，而高浓度时，等温线则呈凸形（常见）或凹形。吸附等温柱内溶质浓度分布柱内溶质浓度的分布曲线流出曲线保留时间与进样量的关系第7页，共63页，2023年，2月20日，星期二二、吸附剂

1.对吸附剂的要求：

(1)表面积大，具有一定的吸附能力。

(2)不应与流动相发生化学反应。

(3)粒度要细，一般为150目左右。2.常用吸附剂有机类

活性炭、淀粉、葡萄糖、聚酰胺、大孔树脂等无机类

氧化铝、硅胶、活性炭、碳酸钙、硅藻土等（1）硅胶（SiO2·xH2O）第8页，共63页，2023年，2月20日，星期二结构：内部——硅氧交联结构→多孔结构表面——有硅醇基→氢键作用→吸附活性中心

游离羟基(I)键合羟基(Ⅱ)硅醚结构(Ⅲ)硅醚结构(Ⅲ)没有吸附活性。第9页，共63页，2023年，2月20日，星期二由于硅胶具有弱酸性，能与碱起反应，只适用于分离酸性和中性化合物。

碱性氧化铝pH9～10适于分析碱性、中性物质中性氧化铝pH7.5适于分析酸性碱性和中性物质酸性氧化铝pH4～5适于分析酸性、中性物质（2）氧化铝(3)聚酰胺

由酰胺聚合而成的高分子物质。第10页，共63页，2023年，2月20日，星期二

酰胺基中的羰基与酚类、黄酮类、酚类中的羟基或羧基形成氢键；酰胺基中的氨基与醌类、硝基类中的醌基、硝基形成氢键而产生吸附作用。（4）大孔吸附树脂

一种不含交换基团，具有大孔网状结构的高分子吸附剂。理化性质稳定，不溶于酸、碱及有机溶剂。大孔树脂可分为非极性和中等极性两类，在水溶液中吸附力较强且有良好的吸附选择性，而在有机溶剂中吸附能力较弱。第11页，共63页，2023年，2月20日，星期二硅胶含水量（%）氧化铝含水量（%）活度级别051525380361015ⅠⅡⅢⅣⅤ表10-1硅胶、氧化铝的含水量与活度级别的关系2.吸附剂的吸附活性：

氧化铝、硅胶的吸附力的大小,还与其含水量有较大的关系：第12页，共63页，2023年，2月20日，星期二

活度级数含水量活性吸附能力小少大强大多小弱

加热除水，活性提高，吸附力加强（活化）吸水，活性下降，吸附力减弱。

三、色谱条件的选择选择色谱分离条件时，必须从吸附剂、被分离物质、流动相(洗脱剂)三方面进行综合考虑。第13页，共63页，2023年，2月20日，星期二1.被分离物质的极性被分离物质的极性越大,被吸附剂吸附得越牢!常见的化合物极性大小顺序:

烷烃<烯烃<醚类<硝基化合物<二甲胺<脂类<酮类<醛类<硫醇<胺类<酰胺<醇类<酚类<羧酸类被分离物质的极性与结构的关系

(1)基本母核相同,基团极性愈大,分子极性愈大。基本母核相同,极性基团数目愈多,分子极性愈大。(2)分子双键多,吸附力↑。(3)空间排列,影响极性。例如羟基处于能形成分子内氢键的位置时第14页，共63页，2023年，2月20日，星期二2.吸附剂的活性:

吸附剂的活性↑大，对被测组分的吸附能力↑强

物质的极性吸附剂活性大小防吸附太牢,难洗脱小大防tR太小,不易分离3.流动相的极性

流动相极性大，对被测组分的洗脱能力强第15页，共63页，2023年，2月20日，星期二常用流动相极性强弱顺序:

石油醚<环己烷<四氯化碳<苯<甲苯<乙醚<氯仿<醋酸乙酯<正丁醇<丙醇<乙醇、甲醇<水

被分离物质的极性吸附剂活性流动相极性

大小大小大小

流动相可用一元,两元或三元，也可采用梯度洗脱等技术。第16页，共63页，2023年，2月20日，星期二一、基本原理

将液体均匀地涂渍在惰性物质(载体)表面上作为固定相，利用被分离组分在固定相与流动相中的溶解度差别所造成的分配系数差别而被分离。第2节液-液分配柱色谱法（LLC）第17页，共63页，2023年，2月20日，星期二

分配系数小的组分，移动速度快，先流出色谱柱；分配系数大的组分，移动速度慢，后流出色谱柱。二、载体载体（担体）起支撑与分散固定液的作用要求：化学惰性，不吸附被分离组分，纯净，颗粒大小均匀。常用的载体有硅胶、纤维素、硅藻土等三、

固定液与流动相的选择

固定液是机械吸附在惰性载体上的液体第18页，共63页，2023年，2月20日，星期二分配色谱根据固定液和流动相的相对极性，可以分为两类：正相色谱和反相色谱

正相色谱反相色谱固定液极性大小流动相极性小大适于分离的物质极性物质中等极性至非极性的物质流出顺序极性小的组分先流出柱极性大的组分先流出在正相色谱法中，固定液有水、各种缓冲溶液、稀硫酸、甲醇、甲酰胺或丙二醇等强极性溶剂，以及它们的混合液.用极性较小的有机溶剂为洗脱剂进行洗脱分离。第19页，共63页，2023年，2月20日，星期二在反相分配色谱中，常以硅油、液体石蜡等极性较小的有机溶剂作为固定液，而以极性强的水、水溶液或与水混溶的有机溶剂为流动相。第3节离子交换色谱法（IEC）以离子交换树脂为固定相的柱色谱法称为离子交换柱色谱法。流动相为水溶液或各种缓冲溶液。用于离子或可离子化化合物的分离。一、分离原理第20页，共63页，2023年，2月20日，星期二

离子交换平衡常数:

[A+]r、[B+]r分别表示树脂中A、B离子的浓度;[A+]、[B+]分别表示水液中A、B离子的浓度若

KB/A>1,说明B+较牢地结合在树脂上

KB/A<1,说明A+较牢地结合在树脂上所以KB/A说明了树脂对A+、

B+两种离子选择性交换的能力,故也称之为选择性系数。

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用离子交换树脂分离不同离子时，样品组分离子与流动相离子在树脂上产生竞争交换，交换能力弱的离子易被流动相洗脱。选择性系数大的离子交换能力强，保留时间长，后流出色谱柱。结果各种离子按选择性系数的大小顺序被洗脱。二、离子交换树脂结构与分类离子交换树脂是具有网状立体结构的高分子多元酸或多元碱的聚合物。常用的是聚苯乙烯型离子交换树脂。它是以苯乙烯和二乙烯苯聚合而成球形网状结构，聚苯乙烯型磺酸基阳离子交换树脂的制备：第22页，共63页，2023年，2月20日，星期二磺酸化交联剂如果用其它基团代替磺酸基，就可以得到一系列阳离子交换树脂。例如─COOH、─OH等。这些基团上的氢离子可被样品溶液中的阳离子交换。

RSO3-H++X+→RSO3-X++H+

第23页，共63页，2023年，2月20日，星期二阴离子交换树脂具有与阳离子交换树脂同样的有机骨架，只是在骨架上引入了可离解的碱性基团，如季胺基(─NR＋3OH－

)等，就成为阴离子交换树脂。其交换反应如下：

三、离子交换树脂的性能1.交联度:

交换树脂中,交联剂(二乙烯苯)的含量为交联度,以重量百分比表示。第24页，共63页，2023年，2月20日，星期二

交联度网眼交换速度离子选择性大小慢小离子好小大快大小离子差阳离子交换树脂一般交联度8%

阴离子交换树脂一般交联度4%2.交换容量:

交换容量是指每克干树脂能参加交换反应的活性基团数。一般为1～10mmol/g。它反映了离子交换树脂进行离子交换反应的能力，决定于网状结构内所含有的酸性或碱性基团的数目。树脂的结构与组成、溶液的pH等因素都影响交换容量。第25页，共63页，2023年，2月20日，星期二第4节空间排阻柱色谱法（SEC）利用被测组分分子大小不同，在固定相上选择性渗透，实现分离。主要用于大分子物质如蛋白质、多糖等的分离。

固定相→多孔性凝胶流动相→水——凝胶过滤色谱流动相→有机溶剂——凝胶渗透色谱

一、基本原理1．分子筛效应第26页，共63页，2023年，2月20日，星期二体积大的组分完全不能进入凝胶颗粒内的孔隙中，只能经过凝胶颗粒之间的间隙随流动相最先流出色谱柱；而体积小的组分，可渗入凝胶颗粒内的孔隙中，因此在流经凝胶颗粒之间的间隙和全部凝胶颗粒的孔隙之后，最后流出；介于大小分子中间的组分，只能进入一部分颗粒内较大的孔隙，在中间时间段流出。根据溶质分子大小的不同进行分离的现象称为分子筛效应2．渗透系数KP

第27页，共63页，2023年，2月20日，星期二Xm与Xs分别代表在孔外流动相中和凝胶孔隙中同等大小的溶质分子。平衡时，两者浓度之比为渗透系数根据空间排阻理论，凝胶孔内外同等大小的分子处于扩散平衡状态Kp仅取决于待测分子尺寸和凝胶孔径大小，与流动相的性质无关第28页，共63页，2023年，2月20日，星期二在凝胶孔径一定时，当分子大到不能进入凝胶所有空隙时（排斥极限），

[XS]=0，则KP=0；而当分子小到能进入所有空隙时（全渗透），[XS]=[Xm]，KP=1；分子尺寸在上述两种分子之间时，能进入部分空隙，

0＜KP＜1.在高分子溶液中，相同成分的分子尺寸大小与分子量成比例，因此，在一定范围内，KP与分子量相关，分子量小，KP大。第29页，共63页，2023年，2月20日，星期二排斥极限与全渗透之间对应的分子量范围称为凝胶的分子量范围。选择凝胶时应使试样的分子量落入此范围。当组分的分子量在凝胶的分子量范围之内时，其保留体积与渗透系数有如下关系:VS为凝胶孔隙的总体积（固定相体积），Vm为凝胶的粒间体积（流动相体积）二、固定相和流动相第30页，共63页，2023年，2月20日，星期二固定相常用的凝胶有葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和.聚苯乙烯凝胶等。

要选择对样品的溶解好，又能润湿凝胶，粘度要低的溶剂，否则，会限制分子扩散而影响分离效果。一般水溶性试样选水溶液，非水溶性试样选四氢呋喃、氯仿、甲苯和二甲基甲酰胺等有机溶剂。流动相第5节薄层色谱法（TLC）第31页，共63页，2023年，2月20日，星期二

将固定相均匀地涂铺在具有光洁表面的玻璃、塑料或金属板上形成薄层，在此薄层上进行色谱分离分析的方法称为薄层色谱法（TLC）。铺有固定相的板子称为薄层板简称薄板。在薄层色谱法中使用的流动相又称为展开剂。

按分离机制薄层色谱法可分为吸附、离子交换、分配和分子排阻色谱法等。按薄层板的分离效率不同，又可分为经典薄层色谱法(TLC)及高效薄层色谱法(HPTLC)。本节主要讨论应用最为广泛的吸附薄层色谱法。操作过程：第32页，共63页，2023年，2月20日，星期二特点：设备简单，操作方便，分析速度快，分离效率高，灵敏度高，显色方便，结果直观，预处理简单。应用：定性、药物杂质检查、纯度测定一、基本原理1.分离过程将混合组分的试液,点在铺了吸附剂的玻璃板一端,在密闭容器中用适当的溶剂(展开剂、流动相)展开,各组分不断地被吸附,解吸附…随展开剂前移,利用吸附剂对不同组分的吸附能力(吸附平衡常数)不同,产生差速迁移,而达到分离。第33页，共63页，2023年，2月20日，星期二2.比移值RfA=a/cRfB=b/c一般要求组分的

值在0.2～0.8之间。Rf=0，被固定完全吸附,K

Rf=1，组分不被固定相吸附,K0)0Rf1第34页，共63页，2023年，2月20日，星期二

比移值是薄层色谱的基本定性参数，它说明组分在色谱系统中的保留行为。比移值的数值除与组分的性质有关外，还与薄层板的性质(活性等)、展开剂的性质(极性、组成等)和温度有关。影响Rf值的因素很多，测量重复性较差

3．相对比移值在一定条件下，吸附平衡常数越大，容量因子k就越大，则比移值越小。第35页，共63页，2023年，2月20日，星期二讨论对照品与被测组分在完全相同条件下展开，可以消除系统误差，大大提高重现性和可靠性；对照品可以是后加入纯物质，也可是样品中已知组分。相对比移值Rst与组分、对照品性质等因素有关，可以大于或小于1。AB对cab第36页，共63页，2023年，2月20日，星期二二、固定相吸附柱色谱的固定相薄层色谱也可以使用,如硅胶、Al2O3等，但粒度比柱色谱更细。硅胶微带酸性，适用于酸性及中性物质的分离。薄层色谱用硅胶粒度为～40μm，硅胶G硅胶+煅石膏（CaSO4）硅胶H硅胶(未加任何物质)硅胶HF254硅胶+荧光物质硅胶GF254硅胶+煅石膏+荧光物质氧化铝一般适用于碱性物质和中性物质的分离第37页，共63页，2023年，2月20日，星期二三、展开剂在吸附薄层色谱法中，展开剂选择的一般原则与吸附柱色谱法中选择流动相的原则相同，主要根据被分离物质的极性、吸附剂的活性以及展开剂本身的极性来选则。第38页，共63页，2023年，2月20日，星期二

实验中，一般先选择单一溶剂展开，对难分离组分，则需使用二元、三元甚至多元的溶剂系统。

在多元展开剂中占比例较大的主要溶剂起溶解样品和基本分离的作用，占比例较小的溶剂起调整Rf

值、改善分离度和对某些组分的选择性作用。

如某一物质在用苯作展开剂时，移动距离太小，说明展开剂的极性太小，此时可以加入一定量的乙醇等极性大的溶剂。再视分离的效果适当改变溶剂的配比，如苯:乙醇为9︰1、8︰2或7︰3等。必要时甚至还要加一些酸或碱。一般希望Rf值在0.2~0.8之间较为满意。第39页，共63页，2023年，2月20日，星期二四、操作方法1.薄层板制备

薄层板分为硬板与软板。软板的制备是直接将吸附剂置于玻璃板上并使成为一均匀薄层便制成了一块软板。硬板的制备需要以下几个步骤：①载板的准备。②匀浆的制备：制备匀浆时有时需要加一些粘合剂，常用粘合剂有煅石膏、羧甲基纤维素钠（CMC-Na）等。第40页，共63页，2023年，2月20日，星期二煅石膏：吸附剂的9-15%左右羧甲基纤维素钠CMC-Na：0.5-1%水溶液

例如，取一定量的硅胶H放入研钵中，加入3倍量的含有0.3%～0.7%羧甲基纤维素钠（CMC-Na）的水溶液，朝同一方向研磨成均匀稀糊状.③铺板

手工涂铺法

机械涂铺法

第41页，共63页，2023年，2月20日，星期二④活化：将铺好的薄层板先凉干，再在105～110℃进行加热活化，活化的程度等要根据样品的性质决定。2.点样（1）样品溶液的制备

应尽量避免用水作溶剂，因为水溶液斑点容易扩散，且不易挥发。一般用甲醇、乙醇、丙酮、氯仿等挥发性有机溶剂，最好用与展开剂极性相似的溶剂。水溶性样品可先用少量水溶解，再用甲醇或乙醇稀释定容。

第42页，共63页，2023年，2月20日，星期二（2）点样量

点样量的多少视薄层的性能及显色剂的灵敏度等而定，在检测器灵敏度足够时，应降低点样量。点样量太多，展开后会出现斑点过大或拖尾等现象，而影响分离效果。点样体积一般在几到几十微克（1～10l）,

点样量太大,斑易拖尾,影响分离效果。(3)点样方法点样方式：接触式点样与喷雾式点样点样形状；点状、条状点样点样器具微量进样器、定量毛细管；底距：1.5～2cm点距：0.5～1cm原点直径：2～3mm。（边点边热风吹）第43页，共63页，2023年，2月20日，星期二第44页，共63页，2023年，2月20日，星期二起始线第45页，共63页，2023年，2月20日，星期二3.展开将点好样的薄层板浸入展开剂中，展开剂借薄层板上固定相的毛细作用携带样品组分在薄层板上迁移一定距离的过程称为展开。（1）展开装置常用的展开装置有直立型的单槽色谱缸和双槽色谱缸、圆形色谱缸、卧式色谱缸等。第46页，共63页，2023年，2月20日，星期二(2)展开方式

一般展开方式：上行、下行、双向等展开距离：6～15cm注意点：①展开剂浸薄层板下端0.5cm,不能浸住起始线,层析缸应密闭。②先饱和15～30分钟,再展开,防止边缘效应。

第47页，共63页，2023年，2月20日，星期二

边缘效应是指同一物质的色谱斑点，在薄层板上两边缘部分的Rf值大于中间部分的Rf值的现象。

这是由于色谱缸内溶剂蒸气未达饱和，造成展开剂的蒸发速率在薄层板两边与中间部分不等。展开剂中极性较弱和沸点较低的溶剂在边缘挥发的快些，致使边缘部分的展开剂中极性溶剂比例增大，故Rf值相对变大。

第48页，共63页，2023年，2月20日，星期二原点12双向展开4.斑点定位有色化合物——直接定位第49页，共63页，2023年，2月20日，星期二无色化合物紫外灯下检出荧光板上有暗斑显色剂定位喷雾或浸渍显色蒸气显色显色剂有通用型和专用型两种。通用型显色剂有碘、硫酸溶液、等。碘使许多化合物显色，如生物碱、氨基酸衍生物、肽类、脂类及皂甙等。它的最大特点是与物质的反应是可逆的，当碘升华挥去后，斑点便于进一步处理。硫酸能对大部分有机化合物显色，但它是破坏性显色剂。斑点有荧光物理捡出法化学捡出法第50页，共63页，2023年，2月20日，星期二

专用显色剂是指对某个或某一类化合物显色的试剂，例如茚三酮是氨基酸的专用显色剂，。羧酸可用酸碱指示剂作显色剂，含酚羟基物质可喷三氯化铁—铁氰化钾试剂进行显色。

显色剂直接由喷雾器喷洒在硬板上，立即显色或加热至一定温度显色。五、定性分析1.利用Rf值定性或相对比移值Rst（在同一块板上）2.Rf值+斑点颜色特征（原位化学反应）;3.多种展开剂体系展开进行验证;4.与其他技术联用。第51页，共63页，2023年，2月20日，星期二六、定量分析（一）洗脱法薄层分离——取下斑点——洗脱——离心——取上清液进行测定（二）薄层扫描法又称原位定量薄层扫描法1.基本原理第52页，共63页，2023年，2月20日，星期二

用一束一定波长、一定强度的紫外或可见光对薄层板进行扫描，测定薄层板上的样品斑点对光的吸收强度或斑点经激发后所产生的荧光强度，所得关系曲线下的面积与色谱斑点中待测物质的浓度或量成正比。薄层扫描法的分类扫描方式吸收法荧光法反射法透射法大多用于凝胶色谱非透明界质薄层板第53页，共63页，2023年，2月20日，星期二方程是薄层扫描法定量的依据。Kubelka-Munk古柏尔卡-曼克第54页，共63页，2023年，2月20日，星期二

通常在薄层扫描中都是以空白板为基准，测定相对透光率及相对反射率来