管碟法测定抗生素效价

管碟法测定抗生素效价第1页，共66页，2023年，2月20日，星期二目录概述1基本原理2菌液制备3基本操作及注意事项4操作要点5检定的影响因素6第2页，共66页，2023年，2月20日，星期二1概述抗生素微生物检定法是国际上通用的、经典的抗生素效价测定方法。随着HPLC等化学分析技术的发展，一些抗生素效价的测定已被化学方法所替代，但由于以下原因，抗生素微生物检定法，目前在各国药典中仍占有重要地位。第3页，共66页，2023年，2月20日，星期二1.微生物检定法可直观、特异的反应出抗生素药品的抗菌活性，显示临床的特点。2.多组分抗生素由于不同组分生物活性的差异，化学测定结果难以准确表征组分、组成、含量和活性的关系。3.许多抗生素品种由于各种原因目前没有适当的化学分析方法表征其活性。4.同时微生物法所需的仪器设备简单，成本低。第4页，共66页，2023年，2月20日，星期二在中国药典2010年版二部附录Ⅺ抗生素微生物检定法及2015版药典中，详细描述了管碟法和浊度法测定抗生素效价的方法，根据公司生产及检测情况，主要是硫酸庆大霉素和硫酸庆大霉素颗粒，采用抗生素管碟法测效价来计算含量，因此，此章主要介绍管碟法。第5页，共66页，2023年，2月20日，星期二抗菌活性抗菌活性是指抗菌药物抑制或杀死病原微生物的能力。抗生素的抗菌活性通常用效价来表示。在临床应用中，抗生素的抗菌活性可准确地反应抗生素的医疗价值。如：硫酸链霉素798单位/毫克青霉素G钠1670单位/毫克第6页，共66页，2023年，2月20日，星期二2010版药典二部附录及2015版药典，在适宜条件下，根据量反应平行线原理，利用抗生素在琼脂培养基内的扩散作用，比较标准品与供试品两者对接种的试验菌产生抑菌圈的大小，测定供试品的效价。2基本原理第7页，共66页，2023年，2月20日，星期二两种互动作用：一种是抗生素溶液向培养基内呈球面状扩散作用；另一种是试验菌的生长作用。当培养到一定时间，琼脂培养基的两种互动作用达到动态平衡时，琼脂培养基中便形成透明的抑菌圈。即：在抑菌圈中因抗生素浓度高于抑菌浓度，试验菌生长受到抑制，此处琼脂培养基成透明状；在抑菌圈边缘抗生素浓度恰好等于抗生素最低抑菌浓度。抑菌圈的形成第8页，共66页，2023年，2月20日，星期二第9页，共66页，2023年，2月20日，星期二量反应平行线原理：当抗生素浓度的对数剂量和反应呈直线关系，且供试品和标准品的作用性质相同时，供试品和标准品的两条量-反应关系曲线相互平行。（中国药典二部附录XIV生物检定统计法）第10页，共66页，2023年，2月20日，星期二根据中国药典2010年版二部附录要求，硫酸庆大霉素和硫酸庆大霉素颗粒测效价，选取短小芽孢杆菌作为试验菌。取短小芽孢杆菌[CMCC(B)63202]的营养琼脂斜面培养物，接种于盛有营养琼脂培养基的培养瓶中，在35～37℃培养7日，用革兰氏染色法涂片镜检，应有芽孢85%以上。用灭菌水将芽孢洗下，在65℃加热30分钟，备用。3菌液制备第11页，共66页，2023年，2月20日，星期二第12页，共66页，2023年，2月20日，星期二流程图冻干菌粉

营养肉汤半固体琼脂斜面制菌悬液穿刺管（保藏及传代用）备注：每经过一次培养箱培养，菌的代数就增加一代。参考：《药品微生物学检验技术》主编：苏德模马绪荣2007年出版（复活）第13页，共66页，2023年，2月20日，星期二1.复活从菌种保藏机构购回的标准菌株，是冷冻干燥粉，需经过复活。（冻干菌种为第0代）第14页，共66页，2023年，2月20日，星期二无菌操作，将冷冻干燥菌种安瓿用75%乙醇消毒后，用砂轮在安瓿颈部刻线，用无菌纱布掰开，或灼热安瓿顶部，立即作灭菌湿纱布盖住顶部，安瓿顶部便骤然裂开，小心移去玻璃碎片，用一无菌毛细管吸取0.5-1ml适宜的液体培养基，直插安瓿底部，挤出营养肉汤培养基，在底部振摇使菌粉溶解，再将安瓿内菌液吸出，接种至营养肉汤培养基。35-37度培养18-24小时。（此为第一代）第15页，共66页，2023年，2月20日，星期二制保藏用菌株将营养肉汤培养物，用接种针沾取菌苔（菌液），沿半固体培养基中心向管底作直线穿刺。穿刺到保藏管中，同样温度35-37度，培养18-24h，然后，放置2-8度冰箱保存，作为保藏及传代用的菌株。第16页，共66页，2023年，2月20日，星期二试验用菌种穿刺管1支，按无菌操作要求，接种于盛有30ml普通琼脂培养基的大三角瓶中，旋转三角瓶使全部琼脂培养基表面被菌液浸润，多余的菌液用吸管吸出弃入消毒液中。将已接种的三角瓶置35～37℃的培养箱中培养7～10天，用革兰氏染色法涂片镜检，应有芽孢85%以上，用灭菌水20ml洗下芽孢，制成悬液，在65℃水浴中加热30分钟，即得。置5℃冰箱中保存。制工作用菌悬液第17页，共66页，2023年，2月20日，星期二革兰染色法具体操作步骤：⑴涂片⑵干燥（自然干燥、培养箱内）⑶固定（火焰）⑷染色（包含初染、媒染、脱色、复染四步）第18页，共66页，2023年，2月20日，星期二涂片第19页，共66页，2023年，2月20日，星期二染色初染：草酸铵结晶紫染1分钟，自来水冲洗。媒染：加碘液覆盖涂面染1分钟，自来水冲洗。脱色：加95%酒精数滴，并轻轻摇动进行脱色，30秒后自来水冲洗。复染：加沙黄（复红）复染液30秒后，自来水冲洗。自然干燥或用吸水纸吸去水分，镜检。染色的结果：革兰阳性菌呈紫色，革兰阴性菌呈红色。第20页，共66页，2023年，2月20日，星期二图片染色步骤涂片盐水95%乙醇自然干燥媒染1min脱色

30s固定初染1min复染30s干燥

镜检接种环草酸铵结晶紫碘液复红第21页，共66页，2023年，2月20日，星期二革兰染色原理由于细菌细胞壁的结构和组成不同，将细菌分为革兰阳性菌和革兰阴性菌。⑴G＋菌：细胞壁厚，肽聚糖网状分子形成一种透性孔障，当乙醇脱色时，肽聚糖脱水而孔障缩小，透性降低,故保留结晶紫-碘复合物不易被洗脱而保留在细胞膜上，菌体呈紫色为革兰阳性菌。⑵Gˉ菌：肽聚糖层薄，交联松散，乙醇脱色不能使其结构收缩，其脂含量高,乙醇将脂溶解，细胞壁透性加大，结晶紫-碘复合物溶出细胞壁，沙黄复染后菌体呈红色为革兰阴性菌。第22页，共66页，2023年，2月20日，星期二革兰染色注意事项1.革兰染色成败的关键是脱色时间，如脱色过度，革兰阳性菌也可被脱色而被误认为革兰阴性菌；如脱色时间过短，革兰阴性菌也会被误认为是革兰阳性菌。因此必须严格把握脱色时间。2.选用培养18～24小时菌龄的细菌为宜，若细菌太老，由于菌体死亡或自溶常使革兰阳性菌转呈阴性菌。第23页，共66页，2023年，2月20日，星期二革兰染色结果第24页，共66页，2023年，2月20日，星期二革兰染色结果第25页，共66页，2023年，2月20日，星期二管碟法的操作步骤预试验试验准备双碟的制备供试品、标准品溶液的制备菌层的制备放置小钢管滴加抗生素溶液双碟的培养抑菌圈的测量结果的可靠性检验及效价测定4基本操作及注意事项第26页，共66页，2023年，2月20日，星期二预试验：确定最佳的试验条件：调整试验菌的浓度、使用量、抗生素浓度、培养基等，使抑菌圈的大小符合规定，即二剂量法高剂量浓度标准品溶液所致的抑菌圈直径在18～22mm,三剂量法中间剂量浓度标准品溶液所致的抑菌圈直径在15～18mm.

高低剂量之比为2:1.第27页，共66页，2023年，2月20日，星期二试验结果中抑菌圈直径不应该过大或者过小，在试验之前，可以先做一个关于用不同浓度菌液配制的琼脂培养基菌层预试验，选择抑菌圈直径在18～22mm的菌液浓度为试验用浓度（菌液浓度约为106个/mL）。批量试验中后期，菌液保存的时间过久，菌株就会逐渐衰亡，生长周期不一致，影响其对抗生素的敏感度，导致抑菌圈变大、模糊或者出现双圈。如若菌株不纯，也会造成这样的结果。因此，菌液在使用一段时间后，可以重新配制纯化或者减小原来菌液在使用中的稀释倍数。第28页，共66页，2023年，2月20日，星期二试验准备：双碟、钢管、毛细滴管、吸管的清洗及灭菌；容量瓶、定量吸管的清洗；培养基、缓冲液的准备、半无菌间的紫外消毒等.

第29页，共66页，2023年，2月20日，星期二抗生素试验中，玻璃双碟、小钢管往往会连续使用。由于清洗方面的原因，它们还是容易残留上次试验中的抗生素（庆大霉素、争光霉素、链霉素等）或者被清洗用的杀菌剂（如新洁而灭、洗洁精、去污粉等）污染，以至于在下次试验中造成抑菌圈不正常的现象。因此，在清洗时要尤为注意多用流水冲洗。第30页，共66页，2023年，2月20日，星期二双碟的制备：每只双碟加底层培养基约20ml,待培养基凝固后,将双碟放入35～37℃培养箱中,待用.第31页，共66页，2023年，2月20日，星期二无菌室工作台面可能因为使用时间已久，变得凹凸不平或者倾斜，会影响培养基菌层的厚度均匀性。菌层越薄，形成的抑菌圈越大，会给试验造成很大的误差。我们可以在桌面上放置一块足够大的玻璃平板，保证双碟放置区域的平整。在双碟底部预先标记样品的高低浓度区域，在加注培养基底层的时候，有顺序地按照一致方向排列。接下来加注培养基菌层的时候，仍然按照原来的位置与方向排列。这样，即使桌面不够水平，还是能够保证培养基菌层是在水平的培养基底层上铺开，达到消除误差的目的。第32页，共66页，2023年，2月20日，星期二试验中加注的培养基如果温度太低，就容易在内部结块，或者加注到双碟之后不能及时铺开，使得培养基表面为非水平面，会给试验带来误差。加注60～80℃的培养基底层之后，不应立即给双碟加盖。因为温度过高的培养基会形成大量的水蒸气，在双碟盖上凝集并滴落在已经凝固定的培养基底层上，会给培养基菌层的加注带来影响。第33页，共66页，2023年，2月20日，星期二供试品、标准品溶液的制备：估计供试品的效价,根据试验要求设计供试品、标准品溶液稀释步骤,平行制备供试品、标准品相关剂量的溶液.依公司产品，硫酸庆大霉素和硫酸庆大霉素颗粒，采用的是二剂量法，试验中，制成高、低浓度的溶液。依中国药典2010版及2015版二部附录要求，第34页，共66页，2023年，2月20日，星期二菌层的制备：注意菌层培养基温度；根据预试验确定加入菌层培养基的菌液量,注意制备菌层的速度和平整度.

第35页，共66页，2023年，2月20日，星期二制备琼脂培养基菌层时，培养基温度过高或者受热时间太长都会导致试验菌死亡。当菌种为非芽孢杆菌的时候，现象尤为明显，甚至会出现无菌生长。因此，培养基应放在50℃水浴中保温。当加入试验菌种混匀后，应尽快加注到底层培养基上。在试验的时候，如果从大瓶内用刻度吸管吸取带菌培第36页，共66页，2023年，2月20日，星期二养基吸管中培养基量少极易冷却，加在底层培养基上就不易均匀铺开，导致菌层厚度不均，影响到抑菌圈的直径。因此可以事先把配制好的培养基分装在具塞试管内，每管5mL，湿热灭菌后放在50℃水浴锅内保温(水浴温度：细菌为48~50℃，芽孢可至60℃)。试验中，再分别加入菌液混匀，配制成带菌琼脂。震荡混匀后继续保温5min使培养基温度回升，然后直接倒在底层培养基上，转动双碟使培养基均匀铺开。第37页，共66页，2023年，2月20日，星期二放置小钢管放置小钢管时，注意管与管之间不能太靠近，否则会引起相邻的两个抑菌圈之间的抗生素扩散区中的浓度增大，相互影响形成卵圆形或椭圆形抑菌圈。管与双碟边缘同样也不能太靠近，因为液面浸润作用，边缘的琼脂培养基菌层为非平面，会影响抑菌圈的形状。第38页，共66页，2023年，2月20日，星期二小钢管放置时，要小心地从同一高度垂直放在菌层培养基上，不得下陷，不得倾斜，不能用悬空往下掉的方法。放置之后，不能随意移动，要静置5min，使之在琼脂内稍下沉降稳定后，再开始滴加抗生素溶液。第39页，共66页，2023年，2月20日，星期二滴加抗生素溶液：注意标准品、供试品高、低剂量溶液滴加顺序,保证滴加速度和加量的均匀一致.滴加抗生素要按照SH→TH→SL→TL（二剂量法）或者SH→TH→SM→TM→SL→TL（三剂量法）的顺序滴加。滴加之前，滴管至少要用被滴液体冲洗3次。在滴加抗生素到小钢管的时候，由于毛细管内抗生素溶液往往会有气泡或者毛细管开口端有液体残留，继第40页，共66页，2023年，2月20日，星期二续滴加容易造成气泡膨胀破裂，使溶液溅落在琼脂培养基表面造成破圈。因此一旦毛细管中出现气泡或者残留，就重新吸取抗生素溶液进行滴加，毛细管口应避免太细，滴加的时候离开小钢管口距离不要太高。第41页，共66页，2023年，2月20日，星期二TH样品的高浓度SH标品的高浓度SL标品的低浓度TL样品的低浓度第42页，共66页，2023年，2月20日，星期二滴加中若有溅出，可用滤纸片轻轻吸去，不致造成破圈。在滴加中还有可能出现抗生素溶液滴入小钢管后，没有与琼脂培养基菌层接触，有一段空气被压在溶液与培养基之间，这样是不会产生抑菌圈的。此时可以小心的用滴管吸出小钢管内的抗生素溶液，弃去。换滴管重新滴加。抗生素溶液滴加后，液面应该与小钢管管口齐平，液面反光呈黑色。（抗生素液体加入量不能按滴计算，即使同一滴管，每滴的量也有差异。）如果抗生素溶液滴加过满，可以用无菌滤纸片小心吸去多余部分。第43页，共66页，2023年，2月20日，星期二双碟的培养：根据培养温度的要求在培养箱中进行培养,培养箱中水平碟放的双碟数以不超过三层为宜。滴加了抗生素溶液后的双碟忌震动，要轻拿轻放。在搬运到培养箱的过程中，可以预先在培养箱中垫上报纸铺平，再把双碟连同垫于桌上的玻璃板小心运至培养箱，缓慢推入箱内。双碟在37℃下培养约16h。时间太短会造成抑菌圈模糊，太长则会使菌株对抗生素的第44页，共66页，2023年，2月20日，星期二敏感性下降，在抑菌圈边缘的菌继续生长，使得抑菌圈变小。在培养过程中，如果温度不均匀（过于接近热源），会造成同一双碟上细菌生长速率不等，使抑菌圈变小或者不圆。所以把双碟放入培养箱时，要与箱壁保持一定的距离，双碟叠放也不能超过3个。培养中，箱门不得随意开启，以免影响温度。应经常注意温度，防止意外过冷过热。第45页，共66页，2023年，2月20日，星期二抑菌圈的测量：抑菌圈测量仪的使用,每组试验双碟应在相同的测量参数下进行测量.硫酸庆大霉素颗粒剂，采取每组12只，同时做一份平行样品，共做2组，试验后，剔除部分不合格品。第46页，共66页，2023年，2月20日，星期二采用抑菌圈自动测量分析仪ZY-300IV型，自动扫描出抑菌圈，测出直径并计算出产品效价。（中国药典2010版附录XIV生物检定统计法）第47页，共66页，2023年，2月20日，星期二第48页，共66页，2023年，2月20日，星期二第49页，共66页，2023年，2月20日，星期二第50页，共66页，2023年，2月20日，星期二第51页，共66页，2023年，2月20日，星期二第52页，共66页，2023年，2月20日，星期二第53页，共66页，2023年，2月20日，星期二结果的可靠性检验及效价测定：抑菌圈测量仪提供计算结果.如低于估计效价的90%或高于估计效价的110%时，应调整其估计效价，重新试验。除另有规定外，本法的可信限率不得大于5%。第54页，共66页，2023年，2月20日，星期二1.试验菌需新鲜培养，传代最好不超过5次,以防止菌种老化变异.芽孢杆菌培养物用灭菌水洗下后,应在65℃加热30分钟,使菌体的菌龄一致,用革兰氏染色,应有芽孢85%以上.2.加入菌悬液的体积,一般不少于0.3ml,并且不大于上层培养基体积的2%.如果加入菌悬液的体积过小,则在同次实验中,不同次加入菌悬液的体积相差较大,造成实验误差；如果加入菌悬液的体积过大,则会使上层培养基变稀,并且因菌悬液的温度较低,加至培养基5操作要点第55页，共66页，2023年，2月20日，星期二中可能造成培养基结块,影响测定结果.对于加入菌悬液体积的控制,可通过调节菌悬液的浓度来实现.

3.放置孵箱培养时排放应不得超过三层,避免因培养温度不均匀而导致各双碟中抑菌圈大小不一.

4.在制备菌层培养基时,将菌液加入菌层培养基后,立即充分摇匀,但应避免产生气泡.

5.标准品与供试品溶液浓度的比值应控制在±2%以内，以保证两者的浓度偏差在一定的范围内。第56页，共66页，2023年，2月20日，星期二6.培养基的PH值对试验结果影响很大，使用时培养基的PH值应调节到适合该品种试验的最佳范围。对氨基糖苷类碱性抗生素而言，在偏碱性条件下抗菌活性比较强，通常灭菌后的PH值范围为7.8-8.0。如抑菌圈清晰，当圈偏小时，可考虑把培养基的PH值调高至8.0.第57页，共66页，2023年，2月20日，星期二1.试验菌种：当试验菌种中含有对抗生素敏感度不同的两种或两种以上的菌株时，由于各菌株的最低抑菌浓度不同，在形成抑菌圈时可能出现双圈及边缘模糊不清，影响测量抑菌圈的准确度。因此，应定期将试验菌种进行平板分离，经涂片镜检后，挑选典型的单个菌落作为工作用菌种。陈旧的试验菌培养物也会使抑菌圈边缘模糊，故试验时应用新鲜制备的试验菌液。6检定的影响因素第58页，共66页，2023年，2月20日，星期二2.培养基：培养基的质量对抑菌圈的大小和清晰度都有影响，故对配制培养基用的几种主要原材料如胨、牛肉膏、酵母膏及琼脂等都应通过预试验选择适宜的品种使用。庆大霉素检定用的培养基是Ⅰ号。第59页，共66页，2023年，2月20日，星期二3.双碟的制备：铺双碟底层培养基时，培养基的温度不宜过高，一般将融化后的培养基在室温冷至约70℃时加入双碟中为宜，否则加双碟盖后，底层培养基上会出现冷凝水。当铺菌层培养基时，由于冷凝水的局部冷却和稀释作用，可使菌层培养基凝固后表面不平。菌层培养基一定要铺均匀，这是决定抗生素效价测定的关键。故要求铺菌层时一定要与铺底层时双碟的位置、方向相一致。制备菌层时，培养基的温度不要过高，受热时间也不宜过长，特别是一些对热敏感的试验菌更要注意。否则，可使试验菌部分或全部被杀死，导致抑菌圈破裂或甚至无抑菌圈形成。因此，一定要按规定控制菌层培养基的温度。第60页，共66页，2023年，2月20日，星期二在双碟培养基上放置小钢管的距离要合适。当距离太小而抑菌圈又太大时，则相邻两个抑菌圈之间的抗生素扩散区中抗生素的浓度增大，形成互相影响的卵圆形或椭圆形抑菌圈。在滴加抗生素溶液至小钢管时，若毛细滴管口不圆整或有小缺口，或管内有气泡，均可使抗生素溶液从管口溅出；若加液太满，溶液会从小钢管口溢出；小钢管底部不平，溶液会从底部漏出。以上原因均会造成抑菌圈不圆整或破裂成桃形。防止的办法是滴管口要圆整，管口不能太细，管内不能有气泡，加液时滴管口离校钢管的距离不能太高，小钢管两端面要平。第61页，共66页，2023年，2月20日，星期二4.双碟的培养温度和时间：培养箱的温度要均匀，每组双碟要放在同一层盘内，在培养过程中，不要开启培养箱，以免影响培养箱内的温度。双碟的培养时间也与抑菌圈的清晰度有关。5.抗生素污染：无抑菌圈形成的原因，大多由于抗生素污染所致。因此，在进行抗生素效价测定时，要严防抗生素污染。防止的办法是将配置和稀释抗生素溶液所用的容器与制