流式细胞仪的课件资料

流式细胞仪的课件资料第1页/共78页流式细胞术发展史1930年Caspersson和Thorell开始致力于细胞计数的研究1934年Moldaven最早设想细胞检测自动化，用光电仪记录流过一根毛细管的细胞1940年Coons提出结合荧光素的抗体去标记细胞内的特定蛋白1949年WallaceCoulter申请了在悬液中计数粒子的方法的专利1950年Caspersson用显微UV-VIS检测细胞第2页/共78页流式细胞术发展史1953年Croslannd-Taylor应用分层鞘流原理，成功设计红细胞光学自动计数器1969年VanDilla及其同事在LosAlamos,NM发明第一台荧光检测细胞计1972年Herzenberg研制出细胞分选器1975年Kohler等提出单克隆抗体技术，为细胞研究提供大量的特异免疫试剂大量厂家不断生产流式细胞仪第3页/共78页流式细胞术发展史目前国内主要流式细胞仪厂家：BecktonDickinson(BD)公司BACKMANCOULTER公司第4页/共78页流式细胞仪构造流式细胞仪(FlowCytometer，FCM)的结构分五部分：流动室及液流驱动系统激光光源及光束成形系统光学系统信号检测与存贮、显示、分析系统细胞分选及浓缩系统流式细胞术(FlowCytometry，FCM)图示如下页：第5页/共78页流式细胞仪构造模式图第6页/共78页流式细胞仪构造示意图第7页/共78页流动室与液流驱动系统流动室是仪器核心部件，被测样品在此与激光相交。流动室由石英玻璃制成，中央有一长方形小孔，供单个细胞通过。流动室内充满了鞘液，其作用是将样品环形包绕。鞘液流速稳定，样品流在鞘流的环包下形成流体动力学聚焦，从而得到准确的细胞荧光信息。流动室上装有压电晶体，受到振荡信号可发生振动。

第8页/共78页流动室与液流驱动系统第9页/共78页激光光源及光束成形系统目前台式机FCM，大多采用氩离子气体激光器。激光光束在到达流动室前，先经过透镜聚焦，形成约22×66μm的光斑，这样激光能量较强，以激发荧光染料。台式机的整个光路是封闭的，在安装时由工程师调试完毕后，无需用户作任何调节，使用十分方便。第10页/共78页激光光源及光束成形系统第11页/共78页光学系统FCM的光学系统由若干组透镜、滤光片和小孔组成，它们将不同波长的荧光信号分别送入到不同的电子测控器。主要光学原件：滤光片(Filter)长通滤片

LongPassFilter,LP短通滤片

ShortPassFilter,SP带通滤片

BandPassFilter,BP第12页/共78页长通滤片第13页/共78页短通滤片第14页/共78页带通滤片第15页/共78页信号检测与分析当细胞携带荧光素标记物，通过激光照射时，产生代表细胞内不同物质、不同波长的荧光信号，这些信号以细胞为中心，向空间360度立体角发射，产生散射光和荧光信号。以激发光光源波长488nm为例示意图：第16页/共78页荧光信号示意图第17页/共78页散射光信号散射光信号不依赖任何样品的制备技术（如染色），因此称为细胞的物理参数。前向散射角(ForwardScatter，FSC)：与细胞的大小有关，在FCM应用中，常取FSC作阈值，来排除样品中的各种碎片。侧向散射角(SideScatter，SSC)：与激光束正交90度的散射光信号，与细胞粒度及复杂程度正相关。散射光信号波长与激光相同。第18页/共78页散射光信号示意图RightAngleLightDetectoraCellComplexityForwardLightDetector

aCellSurfaceAreaIncidentLightSource第19页/共78页荧光信号一种是细胞自身在激光照射下发出微弱的荧光信号，称自发荧光。一种是经过特异荧光素标记后，受激发光照射得到的荧光信号，通过对这类荧光信号的检测和定量就能了解所研究细胞参数的存在与定量。第20页/共78页常用荧光染料目前台式机FCM配置488nm激光管常用染料有PI(PropidiumIodide)PE(Phycorey-thrin)FITC(FluoresceinIsothiocyanate)PerCP(PeridininChlorophyllProtein)PE-CY5等633nm激光管常用染料有APCAPC-Cy第21页/共78页FCM测量数据的存贮、显示和分析目前FCM所采用的都是多参数指标，荧光参数标记物最多可达4个，数据的存贮采用列表排队方式，可节省存贮空间。数据文件为二进制文件，缺乏直观性，数据的显示常用以下几种方式：直方图散点图等高线图密度图三维图第22页/共78页直方图直方图(DistributionHistogram)横坐标代表荧光信号或散射光信号相对强度，单位是道数，可以是线性或对数坐标。纵坐标一般是细胞数。第23页/共78页散点图散点图(DotPlot)X坐标为该细胞一参数相对含量，Y坐标为该细胞另一参数的含量，可以将细胞亚群分开。第24页/共78页等高线图和密度图第25页/共78页三维图第26页/共78页设门分析可以通过设“门”(Gate)，分析、分选感兴趣的细胞。第27页/共78页FCM的分辨率分辨率是衡量FCM测量精度的指标，通常用变异系数CV表示。一般要求CV<8，最好CV<3。第28页/共78页FCM图片——台式机第29页/共78页FCM图片——大型机第30页/共78页FCM的检测范围细胞结构细胞大小细胞粒度细胞表面面积核浆比例DNA含量与细胞周期RNA含量蛋白质含量细胞功能细胞表面/胞浆/核的特异性抗原细胞活性细胞内细胞因子酶活性激素结合位点细胞受体第31页/共78页FCM的临床应用HIV免疫分型，CD4绝对计数白血病和淋巴瘤的免疫分型肿瘤的细胞周期和倍体分析网织红细胞计数细胞移植的交叉配型和免疫状态监测干细胞计数残量白血病细胞检查HLA-B27检查血小板功能及相关疾病第32页/共78页FCM的科研应用树突细胞研究干细胞研究癌症病人的多药耐药性细胞动力学功能研究环境微生物分析流式细胞术与分子生物学研究第33页/共78页FCM的应用——肿瘤学细胞周期分析细胞凋亡的分析凋亡细胞的分析凋亡相关蛋白的分析肿瘤相关基因表达的研究多药耐药基因的研究第34页/共78页细胞周期分析细胞周期G2MG0G1s02004006008001000G0G1sG2MDNA分析细胞数量2N4N第35页/共78页DNA分析的临床意义DNA分析诊断肿瘤DNA非整倍体细胞峰突出的四倍体细胞峰SPF>15%

DNA倍体分析：

结合临床病理的形态学诊断，对一些恶性肿瘤进行早期诊断，跟踪随访和早期治疗，大大提高一些肿瘤的治愈率和生存率。尤其对一些细胞抽吸物、体液、组织液的脱落细胞的分析，意义尤为重要。增殖状态分析：

反映了肿瘤的生长速度和侵袭性第36页/共78页正常人骨髓细胞DNA分析(ModiFIT)第37页/共78页多发性骨髓瘤第38页/共78页FCM在肿瘤早期诊断和鉴别诊断中的作用DNA非整倍体的出现可能是癌前病变发生早期癌变的一个重要标志在病理形态学不能做出诊断前可提供确切诊断信息DNA非整倍体的交界瘤应按恶性对待形态学表现良性的肿瘤出现非整倍体提示恶变可能DNA指数可作为判断间叶组织肿瘤良恶性的辅助指标第39页/共78页细胞凋亡分析细胞凋亡与细胞坏死是两个不同的过程细胞凋亡的主要检查手段形态学检测Ladders实验流式细胞术检测与凋亡相关的病理过程HIV自身免疫性疾病肿瘤第40页/共78页细胞凋亡分析细胞凋亡的主要指标细胞内酶改变：Caspase-3活化细胞膜不对称性改变，磷脂酰丝氨酸外翻，但仍然保持膜的完整性：AnnexinV/PI细胞核DNA的断裂改变：TUNNEL实验（APO-BRDU，APO-DIRECT）凋亡相关蛋白：FasBcl-2第41页/共78页细胞凋亡—PI分析PI-FluorescenceEvents调亡细胞正常G0/G1期细胞第42页/共78页细胞凋亡—ActiveCaspases-3第43页/共78页细胞凋亡—Caspases-3第44页/共78页细胞凋亡—AnnexinV第45页/共78页细胞凋亡—AnnexinV第46页/共78页细胞凋亡—BrdU第47页/共78页FCM的应用——免疫学淋巴细胞免疫分型淋巴细胞亚群分析CD4绝对计数HIV的诊断与研究淋巴细胞CD4/CD8分析CD4绝对计数T细胞活化细胞移植的交叉配型和免疫状态监测第48页/共78页FCM的免疫学应用免疫功能和免疫调控的研究淋巴细胞和单核细胞的活化细胞因子的研究淋巴细胞的增殖树突状细胞的研究HLA-B27检测第49页/共78页淋巴细胞亚群分析使用特异的单克隆抗体，进行多色分析，同时分析淋巴细胞上多种抗原的表达，可以将淋巴细胞亚群区分开，进行定量分析各淋巴细胞亚群的百分含量淋巴细胞亚群的绝对计数第50页/共78页临床意义了解在不同情况下体内免疫功能状态辅助临床疾病的诊断探索疾病的发病机理、病程、预后监测、指导临床治疗方案免疫系统疾病免疫缺陷病，AIDS移植病人排斥反应或移植物抗宿主反应的检测肿瘤病人化疗后免疫力检测第51页/共78页淋巴细胞亚群分析根据功能，淋巴细胞主要分为B淋巴细胞（CD19+），与体液免疫有关T淋巴细胞（CD3+），与细胞免疫有关总T和总B可以用来判断某些免疫缺陷和自身免疫性疾病NK细胞（CD3-CD16+56+），行使免疫监控功能，能够介导对某些肿瘤细胞和病毒感染细胞的细胞毒性作用。第52页/共78页SimulTESTIMK-Lymphocyte试剂盒CD45/CD14，Leucogate：确定淋巴细胞门，评估门的有效性，并自动计算淋巴细胞亚群占门内淋巴细胞的比例，排除门内杂细胞的干扰1/2a，阴性对照：确定淋巴细胞的阴性界值，评估实验的非特异染色CD3/CD19：分析T淋巴细胞和B淋巴细胞CD3/CD4：分析T辅助/诱导细胞CD3/CD8：分析T抑制/细胞毒性细胞CD3/CD16+56：分析T淋巴细胞和NK细胞第53页/共78页淋巴细胞双色分析LeucoGATE：Back-Gating，准确圈定淋巴细胞门，并评估门的有效性第54页/共78页淋巴细胞双色分析第55页/共78页AIDS病人T细胞亚群分析第56页/共78页FCM的应用——血液病学白血病和淋巴瘤免疫分型残留白血病造血干细胞计数PNH诊断网织红细胞分析血小板分析血小板膜糖蛋白分子的表达血小板活化网织血小板分析第57页/共78页FCM的应用——分子生物学分选细胞后进行FISH分选细胞后进行PCR流式细胞免疫表型与聚合酶链反应及荧光原位杂交（PCR-FISH）结合测定血液CD4＋细胞中HIV特异的DNA或RNA流式荧光原位杂交（Flow-FISH）测定染色体端粒长度第58页/共78页性别选择第59页/共78页FCM在中医药研究中的应用我科室开展较多的有如下几个方面的应用：中药对肿瘤细胞的细胞周期及凋亡影响，抗肿瘤中药成份的筛选中药对细胞表面（细胞因子、激素）受体表达的影响中药对细胞粘附分子表达的影响中药对淋巴细胞亚群（反映免疫状态）的影响针灸及中药对细胞内酶的表达影响中药对生精细胞的影响研究中药治疗艾滋病的研究（我实验室仅提供技术支持）第60页/共78页本实验室流式细胞仪及应用介绍生产厂家：美国BECTONDICKINSON(BD)公司型号：FACSCalibur激光器：488nm和633nm各一个荧光通道（共4通道6参数）FSC及SSC：480-495nmFL1：515-545nm

FL2：564-606nm

FL3：>670nm

FL4：653-667nm技术参数

分析速度10000个/秒，分选速度700个/秒。常用荧光染料光谱学特征第61页/共78页细胞周期分析——PI单染第62页/共78页细胞周期分析——PI单染第63页/共78页细胞周期分析——ModiFit分析第64页/共78页细胞周期分析——ModiFit分析第65页/共78页大鼠生精细胞分析——PI单染第66页/共78页细胞凋亡—PI加AnnexinV双染FITC-AnnexinVPI第67页/共78页淋巴细胞亚群分析CY5.5-CD3FITC-CD4PE-CD8第68页/共78页培养细胞表面粘附分子表达第69页/共78页培养细胞表面粘附分子表达第70