人类体细胞染色体标本制备与核型分析

/实验一人类体细胞染色体标本制备与核型分析ＭｅｔaｐhaseCｈroｍoｓoｍeＰrepａratｉoｎａｎdAｎaｌyｓisｏfKaryｏtyｐｅ【实验目的】熟悉人类外周血淋巴细胞的培养方法及染色体标本的制备方法。熟悉人类染色体Ｇ显带标本制备与分析。【实验原理】染色体是在显微镜下可见细胞有丝分裂过程中出现的结构.因此，必须获得染色体标本才能进行检查分析,通常情况下,都是利用外周血淋巴细胞进行核型分析.正常情况下,人体外周血淋巴细胞不再分裂，但植物血凝素（ＰHA）可刺激血中的淋巴细胞转化成淋巴母细胞，使其恢复增殖能力。因此，可采取少量外周静脉血,做短期培养，培养至７２小时细胞进入增殖旺盛期，此时加入秋水仙素抑制细胞分裂，使细胞分裂停止在中期以获得足够量的分裂期细胞，经低渗、固定、制片、染色后镜下观察进行核型分析。上述制备的染色体标本经胰蛋白酶消化、Ｇiemsa染色后，可在染色体纵轴上显示出着色深、浅相间的横纹——带，表明每条染色体的特征。【实验用品】1．采血器材、酒精灯、培养瓶、超净工作台、恒温培养箱、恒温水浴箱、离心机、刻度离心管、乳头吸管、试管架、量筒、试剂瓶、载玻片、吹风机、托盘天平、显微镜、镜油、二甲苯、擦镜纸、镊子、烧杯、记号笔、玻片架、火柴、10ml注射器。２．RPMI1６40液体培养基、小牛血清、肝素（５00Ｕ/ml)、植物血凝素(PHA)、秋水仙素（10ｍg／ml）、KＣl低渗液（0.0７5mol／Ｌ）、甲醇、冰乙酸、Ｇｉemsa原液、磷酸缓冲液（PH6。８）。3．2。5％胰酶溶液（Ｈaｎks液配制)、０．4％酚红、Ｇiemsａ染色液、１N盐酸、1N氢氧化钠。【实验步骤】一。外周血淋巴细胞染色体标本制备与分析１。采血及接种培养1．１在酒精灯火焰上,用灭菌注射器（一次性注射器)抽取肝素０。２ｍｌ，使肝素湿润至管壁。1.2常规消毒后,采集外周静脉血５ml,转动注射器使血液与肝素混匀.1。３在超净工作台中,预先将RＰＭI1640液体培养基（5ｍｌ，含植物血凝素６０mｇ/mｌ、１0%小牛血清）加入消毒好的小培养瓶中，再滴加25滴全血（6号针头），水平摇动混匀。１.4置3７℃１。5终止培养前2~4小时,加入秋水仙素,使终浓度达到0．２μｇ/ml。轻轻摇动培养瓶，使秋水仙素混匀.继续培养至7２小时。２．制片2。1收集细胞时，去掉瓶塞,用乳头吸管吸取培养液，充分混匀培养物,再将全部培养物吸入刻度离心管中.2.210０0rｐｍ离心8分钟(注意先配平）。２.3弃上清液，加入37℃预温的0。075moｌ/ＬKCl溶液8mｌ,用吸管轻轻吹打细胞团混匀后，置37２.４加入１ml新配制的固定剂（甲醇:冰乙酸＝3：1),用吸管小心吹打、混匀，１０00ｒpm离心8分钟。2.5弃上清液,加入８ｍｌ固定剂，吹打细胞团制成细胞悬液后，室温下固定２0分钟。2。61000ｒｐｍ离心8分钟。2.７弃上清液,重复固定一次。２。８弃上清液，根据细胞数量的多少适当加入数滴新配制的固定剂，吹打细胞制成悬液。2。9吸取少量细胞悬液,滴2～３滴于冰水浸泡过的载玻片上,吹散,气干。2．1０将标本置Giｅmｓa染液中，染色8分钟，水洗去浮色，气干。２.11显微镜下观察染色体标本分裂相的多少及分散情况。二.人外周血淋巴细胞染色体G显带标本制备与分析1．Ｇ显带染色体标本制备1.1常规制片后，将标本置７0℃1.２取2。5%胰酶溶液5mｌ，加入染色缸中,加入４5ｍl生理盐水,用１NHCl或１NNaOH及酚红调节胰酶溶液成紫红色（ＰH6。８～7。2)，置3７OＣ预温.１．3将玻片标本放入胰酶溶液中处理２5～45秒钟，不断轻轻摇动玻片，使胰酶作用均匀.随着处理标本数量增加，胰酶逐渐消耗，胰酶作用时间逐渐延长.1．4取出染色体玻片标本，置于３７℃1。５将玻片标本放入３7℃１。6自来水冲洗，气干。1．7显微镜观察。【实验结果与分析】一.常规染色体核型分析1.根据染色体的形态、大小及着丝粒的位置,将染色体分为七组.A组染色体:包括１～3号染色体。长度最长，１号和3号染色体为中央着丝粒，2号染色体为亚中央着丝粒染色体。B组染色体:包括4~5号染色体，长度次于Ａ组;亚中央着丝粒染色体,短臂较短。C组染色体:包括6~1２号和X染色体，中等长度，亚中央着丝粒染色体.Ｄ组染色体:包括1３～15号染色体，具有近端着丝粒和随体。E组染色体:包括16～１８号染色体，16号染色体着丝粒在3/8处,１7号和18号染色体着丝粒约在１/４处。F组染色体：包括19号和２0号染色体，中央着丝粒.G组染色体:包括21号、22号和Ｙ染色体,是染色体组中最小的，为近端着丝粒的染色体。2１号和2２号染色体具有随体。2。绘图:绘出在显微镜下观察到的染色体。二。G显带染色体标本分析Ｇ带显示的正常人显带核型特征（见附图1．1、1.2、１.３)A组染色体：包括1~３号染色体。长度最长，1号和3号染色体为中央着丝粒，２号染色体为亚中央着丝粒染色体。１号染色体短臂：在320条带左右的分裂相上,近侧段有两条深带,第2条深带稍宽；在处理好的标本上,远侧段可显出３４条浅染的深带.此臂分为３个区，近侧的第１深带为２区1带，第２深带为3区1带.长臂：副缢痕紧贴着丝粒，染色深浅不一,其远侧为一宽的浅带，近中段与远侧段各有两条深带，中段两条深带稍靠近，其中第2条染色较浓。此臂分为四个区,副缢痕远侧的浅带为2区1带,中段第２深带为3区１带，远侧段第１深带为4区1带。２号染色体短臂可见四条深带，中段的两条深带较靠近。此臂分为2个区，中段两条深带之间的浅带为２区１带.长臂：有7条深带,第3和第4深带有时融合。此臂分为3个区.第2和第3深带之间的浅带为2区1带,第4和第５深带之间的浅带为3区1带.3号染色体着丝粒区浓染短臂：在近侧段可见一条较宽的深带，远侧段可见两条深带，其中远侧的一条较窄，且着色较浅，这是区别3号染色体短臂的重要特征。近侧段的深带可分为两条深带。此臂分2个区,中段浅带为2区1带。长臂：一般在近侧和远侧段各有一条较宽的深带。在显带好的标本上，近侧段的深带可分为两条深带，远侧段的深带可分为三条深带。此臂分为2个区，中段浅带为2区1带。B组染色体：包括4～５号染色体,长度次于A组;亚中央着丝粒染色体，短臂较短。4号染色体短臂：可见两条深带，近侧深带染色较浅，短臂只有一个区。长臂：可见均匀分布的四条深带，在显带较好的标本上,远侧段的两条深带可各自再分为两条较宽的深带。此臂分为3个区,近侧段第1和第２深带之间的浅带为2区1带,远侧段的两条深带之间的浅带为3区1带。5号染色体短臂:可见两条深带，其中远侧的深带宽而且色浓，短臂只有一个区。长臂：近侧段有两条深带，染色较浅，有时不明显;中段可见三条深带，染色较深，有时融合成一条宽的深带;远侧段可见二条深带，近末端的一条着色较浓。此臂可分为３个区，中段第2深带为２区1带，中段深带与远侧段深带之间的宽阔的浅带为3区１带.C组染色体:包括6～１2号和X染色体，中等长度，亚中央着丝粒染色体。6号染色体短臂：中段有一条明显而宽阔的浅带，其中近侧段和远侧段各有一条深带，近侧深带紧贴着丝粒;在显带较好的标本上，远侧段的深带又可分为两条深带.此臂分为2个区，中段的明显而宽阔的浅带为2区1带。长臂：可见五条深带，其中近侧的一条紧贴着丝粒,远侧段末端的一条深带着色较浅。此臂分为2个区,第2和第3深带之间的浅带为２区１带.7号染色体着丝粒浓染。短臂：有三条深带,中段深带着色较淡,有时不明显;远侧深带着色浓宽,状如”瓶盖”.此臂分为2个区，远侧段的浅带为2区1带。长臂:有三条明显的深带，远侧近末端的一条深带着色较淡，第2和第3深带稍接近。此臂分为3个区,近侧第1深带为2区二带,中段的第2深带为3区1带。8号染色体短臂：有两条深带，中段有一条较明显的浅带，这是与10号染色体相区分的主要特征.此臂分为2个区,中段的浅带为2区1带。长臂：可见三条分界不明显的深带,远侧段的深带着色较浓.此臂分为2个区，中段的深带为2区1带.９号染色体着丝粒浓染。短臂：近侧段和中段各有一条带，在显带较好的标本上，中段可见两条窄的深带，此臂分为２个区，中段的深带为2区１带.长臂:可见明显的两条深带,副缢痕一般不着色,在有些标本上显现出特有狭长的颈部区.此臂分为3个区，近侧的一条深带为2区１带,远出的一条深带为３区二带.1０号染色体着丝粒浓染。短臂：近出段和中段各有一条深带,在有些标本的中段可见两条深带，但与８号染色体短行比较,其深带的分界不够清晰.此臀只有一个区.长臂：可见明显的三条带，近侧的深带较明显，远侧的两条深带较靠近，这是与8号染色体相鉴别的主要特征。此管分为2个区,近侧段的一条深带为2区1带。１1号染色体短臂：近中段可见两条靠的很近的较窄的深带．在显带较差的标本上,只能看见一条宽带.此臂只有1个区。长臂：近侧有一条深带，紧贴着丝粒。远侧段可见一条明显的较宽的深带，这条深带与近侧的深带之间是一条宽阔的浅带，这是与12号染色体相鉴别的一个明显特征;在显带较好的标本上，远侧段的深带可分为两条较窄的深带，两深带之间有一条很窄的浅带，一般极难辨认，但它是一个分区的界标，在有些标本上近末端处还可见一条窄的淡色的深带。此臂分为２个区，上述远侧两条深带之间的浅带为2区1带。12号染色体短臂：中段可见一条深带.此臂只有1个区.长臂：近侧有一条深带,紧贴着丝粒；中段有一条宽的深带，这条深带与近侧深带之间有一条明显的浅带,但与11号染色体相比较这条浅带较窄，这是鉴别11号与12号染色体的一个主要特征；在显带好的标本上，中段较宽的深带可分为三条深带,其正中的一条着色较浓;在有些标本上，远侧段的近端还可见1~2条染色较淡的深带.此行分为2个区，中段正中的深带为２区1带.X染色体其长度介于７号和8号染色体之间。短臂：中段有一条明显的深带，如竹节状。在有些标本上，远侧段还可见一条窄的、着色淡的深带.此臂分为2个区，中段的深带为2区1带。长臂:可见4～5条深带，近中部的一条深带最明显。此臂分为2个区，近中段的深带2区1带.D组染色体：包括１３～15号染色体，具有近端着丝粒和随体。1３号染色体着丝粒浓染。长臂：可见4条深带，第1和第4带较窄,染色较淡。第２和第3深带较宽,染色较浓,此臂分为3个区,第2深带为2区１带,第3深带为３区1带。14号染色体着丝粒浓染。长臂:近侧和远侧各有一条明显的深带，在处理好的标本上，中段尚可见一条较浅的深带.此臂分为3个区，近侧深带为2区１带，远侧深带为3区1带。１5号染色体着丝粒浓染。长臂:中段有一条明显的深带，染色较浓，有的标本上，近侧段可见l～2条淡染的深带。此臂分为2个区，中段深带为2区１带。Ｅ组染色体：包括16~18号染色体，16号染色体着丝粒在3/8处，1７号和18号染色体着丝粒约在1/4处.16号染色体短臂:中段有一条深带，较好的标本上可见两条深带。此臂只有1个区.长臂:中段和远侧各有一条深带,有时远侧段的一条不明显,副缢痕着色浓。此臂分为2个区，中段深带为2区１带。１7号染色体短臂：有一条深带，紧贴着丝粒.此臂只有1个区.长臂:远侧段可见一条深带，这条带与着丝粒之间为一明显而宽的浅带.此臂分为2个区，这条明显而宽的浅带为2区1带。18号染色体短臂：有一条窄的深带。此臂只有1个区。长臂：近侧和远侧各有一条明显的深带。此臂分为2个区，两深带之间的浅带为２区１带。F组染色体:包括19号和20号染色体，中央着丝粒。19号染色体着丝粒及周围为深带，其余为浅带。短臂和长臂均只有1个区.2０号染色体着丝粒区浓染。短臂:有一条明显的深带。此臂只有１个区。长臂:在中段和远侧段可见1—2条染色较浅的深带，有时全为浅带。此管只有1个区。Ｇ组染色体:包括２１号、２２号和Y染色体,是染色体组中最小的,具近端着丝粒的染色体.２１号和22号染色体具有随体.２１号染色体着丝粒区着色浅。与２２号染色体相比较，其长度比22号短。其长臂近侧有一明显而宽的深带。此臂分为2个区，其深带为２区１带。22号染色体着丝粒区染色浓。与21号染色体相比较，其长度比21号长;在长臂上可见两条深带,近侧的一条着色较浓而且紧贴着丝粒，近中段的一条着色浅,在有的标本上不显现.此臂只有１个区.Y染色体长度变化较大，有时整个长臂被染色成深带。在染色较好的标本上，可见两条深带.此臂只有1个区。图１.1G显带染色体核型图1.２G显带染色体核型分析ＳHAＰE\＊MERGＥFORMAT图１。3正常男性G显带染色体模式图【注意的问题】1.采血时不要加入太多的肝素,因为肝素含量过多时往往抑制淋巴细胞的转化。2。培养过程中培养液逐渐变黄色,说明pH发生了较大变化，将不利于细胞生长，此时可加入适量灭菌的1．4%NaHＣO3溶液调整,或再加入2~3ml培养液的办法来校正.３.培养失败的原因,一般有下述几种：①培养瓶及器材洗涤不符合要求；②配制溶液的双蒸水不符合要求；③PHA和培养液的质量有问题,或培养液pＨ不符合要求;④无菌操作不符合要求，发生污染；⑤淋巴细胞对PＨＡ反应降低，致分裂相太少。4．标本质量不佳的原因：①秋水仙素的处理不当,如秋水仙素的浓度不够或处理时间不足，结果分裂相太少;如浓度过高或处理时间过长，则使染色体过于缩短，难于进行分析；②低渗处理不当，低渗处理时间过长时，细胞膜往往过早破裂，染色体丢失；如果低渗处理不够，则染色体分散不佳,难以进行计数分析；③离心速度不合适，收集细胞时离心的速度太低易丢失细胞，如果低渗后离心速度过高，往往使分裂相过早破裂,完整的分裂相减少;④标本固定不充分，如固定液不新鲜,或甲醇、冰醋酸的质量不佳，结果染色体模糊，或残留胞浆痕迹，使背景不清；⑤玻片去污不彻底,冷冻不够,使细胞悬液不能均匀附着以致细胞大量丢失,或染色体分散不佳。5。制备Ｇ显带染色体标本时,要严格控制胰酶消化时间，时间不足显不出带纹，时间过长,使染色体不规则或形成空泡状。附录一、试剂及配制：RＰMI１640培养液ＲＰMI164０10.4g肝素80ｍｇPHA182mg胎牛血清100ml抗菌素8万单位NａＨCＯ32ｇ双蒸水定容至１00０ml。抽滤除菌，分装，—20低渗液(0.075MolKＣl)KCl2．794g三蒸水50０ｍｌ固定液甲醇(AR）：冰醋酸（AR)=3：1现用现配。Giｅmsａ染液贮存液Ｇiemｓa5g纯甘油(AR）330ml甲醇（ＡR)33mｌ先将Gｉemsa粉剂溶于少量的甘油中，在研钵中充分研磨至无颗粒粘糊状，再将全部甘油加入，然后移至烧杯中,在55~60OC温箱中放置2小时,冷却后加入甲醇，充分搅拌均匀,在室温放置２～3周后过滤除去絮状物,储存在棕色瓶中，一般放置3周后使用效果更好。使用液磷酸缓冲液甲、乙各2。5ml，加４５ml双蒸水，加Giemｓａ原液2.5mｌ。2.5％胰蛋白酶原液胰蛋白酶粉剂2.5g生理盐水1０0ｍl秋水仙素（1０mg/ｍｌ，使用液1０0μg/mｌ）秋水仙素1g生理盐水１00ml抽滤，4OＣ棕色瓶保存.肝素（２５０0U/ｍｌ,使用浓度５０U/ml)肝素钠31２。5mg生理盐水100ml高压灭菌。Haｎｋs液（ｇ/L)NａＣl8．00ＫCl0．40CaＣl20.14MgSO4•7H２Ｏ０．２0Ｎa2HPO40。０６KH2ＰO40.０６ＮaHCO30.35葡萄糖1。00酚红０。0２二、记录和检查回报表表1染色体病病例检查分析记录送检材料:检查目的：送检时间：送检材料:检查目的：送检时间：编号:送检者:院科医生患者姓名:性别:年龄：临床检查摘要于临床初步诊断:家系资料:ﻬ表２染色体检查记录(记录内容：显微镜号、标本号、座标、核型与异常特点)１234567891０11１21３14１516１7１81920２1２223２425262728２930３１323３3435373７３83940414243444５46474８4850５15２5３5４55565７５859606１６２６3６４656667686９70７1７２7374757677787９8081８283848586８７888９909192939４9５96979899100表3染色体畸变分析记录玻片号性别号座标核型畸变染色体特点照片编号讨论：分析结果：分析者：年月日表4核型分析１2３45AB6789１０1112X C1314151617１8DE１９202１２２YFG表５核型分析检查回报单姓名性别年龄送检材料送检目的时间编号送检者院科医生临床初步诊断细胞遗传学检查结果（１)X染色质检查Ｙ染色质检查（2）核型分析(3）皮肤文理特征(4）家系分析诊断检查者签字年月日ﻬ实验二X和Ｙ染色质标本的制作与观察XandＹChｒｏmatinPreparatioｎandObservaｔｉon【实验目的】熟悉X染色质和Y染色质的形态特征及其检查方法【实验原理】正常女性核型为４6,XX。在间期细胞核中紧贴核膜内缘有一个染色较深的椭圆形小体，即X染色质，这是女性细胞中一条X染色体随机Lyoｎ化失活形成的。这种失活保证了雌雄两性细胞中都只有一条有活性的染色体，使两性X连锁基因产物的量保持在相同水平上。称为X染色体的剂量补偿（参考Lｙｏn假说）。正常男性核型为46，XY。在男性间期细胞核中，可见位于细胞核边缘或核中央处有一极小的黄色荧光亮点,就是Ｙ染色质（Y小体)，大小约０．25～0．3μm.是Y染色体长臂特异性着色而形成。人的性别是由X和Y染色体决定的。需要对人的性别进行鉴定时，除进行染色体核型分析和临床生殖器官的检查外,还可以通过细胞学方法，如检查期间体细胞（口腔上皮，皮肤，羊水和血细胞等）的核内染色质—-X和Y染色质来鉴定。【实验用品】显微镜、荧光显微镜、乙醇(无水乙醇，95％,7０％、50％)，甲醇,冰醋酸，硫堇，１％结晶紫，１mol/LHCl。二甲苯、香柏油、擦镜纸、盖玻片、载片、１5ｍl刻度离心管、牙签、吸水纸、小镊子、碘酒、酒精棉球、采血针、3％醋酸溶液、pH6~6.5缓冲液、0。5％盐酸阿的平染液。（注：硫堇染液（工作液）,①干液（硫堇）：硫堇１g或２g溶于１００mL5０％乙醇中,溶解后过滤备用；②醋酸钠缓冲液：醋酸钠·３H2Ｏ9。7ｇ,巴比妥钠14。7ｇ，溶于500ｍL蒸馏水中；③0。1mol/L盐酸；按①：②：③=４０：２８：32比例配成混合液，调pH5。7±0。2，即得硫堇工作液。)

【实验步骤】一、X染色质的制备和观察(一）取材１。让受检者用水漱洗口腔数次，以尽量除去口腔内细菌或其它杂物。2。用牙签钝头部或木质器具刮取口内侧面的口腔粘膜上皮,弃去第一次刮到的细胞。3。同一部位连续刮取数次,将刮取物涮入装有生理盐水的离心管内。(二）标本的制作1.将细胞悬液的离心管进行离心(150０rｐm)１０分钟,去上清液，留下细胞团.2．加入新配制的固定液（３份甲醇︰1份冰醋酸)８ｍL，混匀呈悬液.固定30分钟.３．离心（同上）,去上清液,留下细胞团。4.加入数滴(根据细胞多少而增减）固定液,充分混匀呈悬液。５。滴一滴悬液至预先置冰盒中的干净载玻片上，晾干.每份样本制片3—4张。（三)染色Kliｎger硫堇染色法1.将玻片标本置入1moｌ／LHCｌ中,37℃条件下水解2０分钟2。用蒸馏水充分冲洗、晾干。3.硫堇染液中染色约15分钟。4.蒸馏水冲洗、晾干。硫堇染色的优点是只有细胞核清晰着色,胞浆不着色，因此细胞核背景清晰,利于对位于核膜边缘的X染色质的辨认.结晶紫的染色法1．固定后的玻片标本经过70％、50％酒精及蒸馏水(更换两次蒸馏水）各5分钟.2.置入１％结晶紫溶液中染色5～8分钟。大量制片时可用0.５％结晶紫染液，染色10~15分钟左右。3．95％酒精中分化(快速地在酒精中沾５～8次）。４．继续在无水乙醇中分化，间歇地用显微镜检查,直至标本中核结构的微细部分都很清楚为止（一般约1分钟）。5.置入二甲苯中.更换2次二甲苯,每次3分钟,以使标本透明.6.树胶封片.(四)观察1。先在低倍镜（1０倍镜）下观察,可见视野中有许多单个或成堆的口腔上皮细胞。选择清楚而分散的细胞，移至视野中央，再换高倍镜仔细观察.口腔上皮细胞为多边形的扁平状，细胞中央有一被染成深兰色的圆形或椭圆形的细胞核。核周围均质部分为细胞质。细胞的外表为一很难与细胞质相区别的薄膜即细胞膜.2。40倍或油镜下检查1００个“可计数细胞”，并计数具有Ｘ染色质的细胞数。二、Y染色质的制片与观察(一）制作标本1.采血与涂片：男同学用碘酒,酒精棉球常规消毒食指或耳垂后，用采血针点刺食指或尖或耳垂，挤出2～3滴血于一干净的底玻片中央，用牙签将血滴涂成较厚的一层血膜，直径约1。5cｍ，晾干。2.固定：加3％的醋酸溶液数滴于血膜上，静置15分钟，其间可换液一次,使红细胞溶解。3.用pＨ6~６．５磷酸缓冲液冲洗血膜,晾干。4。染色：加0。5％盐酸阿的平溶液数滴于血膜上，放置暗处静置染色1５分钟。(若使用口服阿的平片剂，则用100mg溶于10ml双蒸水中，染色时间为25分钟）。5.再用磷酸缓冲液冲洗黄色溶液.6．加盖玻片,在有缓冲液的情况下，用荧光显微镜进行观察。（二)观察Y染色质先在低倍镜下观察,可见许多白细胞（多为淋巴细胞）核染成黄色.换高倍镜，可见位于细胞核边缘或核中央处有一极小的黄色荧光亮点，就是Y染色质（Ｙ小体），大小约0．2５～0。３μm。最后可用油镜再仔细观察。Ｙ染色质在男性白细胞的出现率可达60～７0%.注意需要计数的细胞必须是核膜完整无缺,核质染色均匀,清晰可见，核周围无细菌和其它污染物质的干扰。【实验结果与分析】观察并计算Ｘ染色质的阳性率.X染色质的标准是:１.位于核膜内缘。2．核内唯一的浓染、轮廓清楚的小体,直径约为１～1．5μｍ，一般呈平凸形、圆形、扁平形或三角形。(注：配制的ｐH6～6。5的磷酸缓冲液要用黑纸或茶色瓶置于冰箱保存,有效期一个月。)ﻬ实验三姊妹染色单体交换实验SiｓtｅrChｒomoｓoｍｅEｘchａngｅ(SCＥ)【实验目的】熟悉制备ＳCＥ标本的原理和基本程序。【实验原理】姊妹染色单体交换（Sistercｈroｍａtialexchange，SCＥ）是染色体同源座位上复制产物间的相互交换，是同一染色体的两条单体之间发生的一类特殊的同源重组，主要在ＤNA合成期形成,可能与DNＡ双链的断裂与复制有关,ＳＣE的发生的频率可反映细胞在S期的受损程度。如果一个个体的ＳCＥ率明显增高,可表明染色体受到环境中的一定因素的影响,或是受到遗传缺陷的内在制约因素所致。在细胞分裂时,每条染色体均有两条染色单体组成，每条染色单体有一条双链DNＡ组成。5-溴脱氧尿嘧啶核苷(5—ｂrｏmｏdeoxy—uｒidinｅ,BrｄU)是脱氧胸腺嘧啶核苷的类似物，在DNA链的复制过程中,可替代胸腺嘧啶。当细胞生存环境中存在BrdＵ时，BrｄU取代脱氧胸苷掺入到复制的ＤＮA中。经两个复制周期后，两条姊妹染色单体中一条DNＡ的双链均有BｒdU掺入，而另一条DNA双链中仅有一条链有BｒｄＵ掺入。利用特殊的分化染色技术对染色体标本进行处理,可使双链均含有BrdU掺入的单体浅染，而只有一条链掺入BrｄU的单体深染。当姊妹染色体间存在同源片段交换时,可根据每条单体夹杂着深浅不一的着色片段加以区分。由于姐妹染色单体的ＤNＡ序列相同，SCE并不改变遗传物质组成，但SCＥ是由于染色体发生断裂和重接而产生的,因此,SCE显示方法通常用来检测染色体断裂频率,用来研究药物和环境因素的致畸效应。【实验用品】１。超净工作台、恒温培养箱、恒温水浴箱、冰箱、离心机、显微镜、采血器材、酒精灯、培养瓶、刻度离心管、胶塞、乳头吸管、试管架、载玻片、托盘天平、干燥烤箱、染色缸、电吹风、30W紫外灯。2.试剂:RPMI1640培养液、小牛血清、秋水仙素(100μg/mL）、5—溴尿嘧啶（ＢrdＵ,200μg/ｍＬ）、低渗液（0．07５moｌ/ＬKＣL溶液)、2×SSＣ、Gｉemｓa原液、甲醇、冰乙酸。【实验步骤】1．按半微量法采取外周静脉血,接种培养.2。37℃培养24小时后，加ＢrdＵ溶液（终浓度为８μ3．用黑纸包裹培养瓶，继续培养48小时。4。收获前加入秋水仙素（终浓度为0。2μg/mL），继续培养1小时。５。常规法制片。将玻片标本室温放置2～3天。6。分化染色前一天，将标本置37℃7。在平皿中平行放置两根牙签,将玻片放在牙签上,加适量2×ＳSC溶液(以不超过标本为度)。在标本上盖一张比玻片稍大的擦镜纸,使纸边浸入2×SSC溶液中，并使2×ＳＳＣ溶液渗至玻片标本上，保持标本湿润。8．将平皿置５5℃水浴面上，用30Ｗ紫外灯垂直照射标本30分钟,照射距离1０ｃm9．照射后轻轻取掉擦镜纸,立即用蒸馏水冲洗标本.１０。Gieｍｓa染色5～１０分钟；蒸馏水冲洗标本，气干。11.镜检，计数。每个末端交换记为1次ＳＣＥ,中部交换记为2次SCＥ。【实验结果与分析】观察30个细胞的分裂相，记录每个细胞的ＳCE总数，计算SCE频率。n个中期分裂相ＳCＥ之和SCE频率=ｎ个细胞中国人正常SCE频率为５.7±0．４。ﻬ实验四银染核仁形成区与近端着丝粒染色体随体联合ＡｇＮO3StaｉｎinｇNOＲanｄＳａtellitｅＡｓsociationｏｆAｃrｏceｎtｒicChromosｏme【实验目的】熟悉银染的原理和方法。【实验原理】人类近端着丝粒染色体的副缢痕与核仁形成有关，故称为核仁形成区(ＮOR）。当位于此处的18S、28Ｓ核糖体RNＡ的基因（rDNA)具有转录活性时，应用银染技术可使NＯR特异性着色（褐黑色）。进一步证明银染物质不是rDNＡ，亦不是rRNA,可能是核仁形成区特异的蛋白质,即和ｒRＮA转录相联系的酸性蛋白。人类核糖体RＮA基因位于5对近端着丝点染色体短臂的次猛痕处,即人类的核仁形成区。在正常人中，不是所有核仁形成区均被银染，其范围大约4-1０。应用银染法可以觉察正常人体核糖体ＲNA基因的活动。此外，人类近端着丝粒染色体的随体间易发生联合,应用银染技术可在发生联合的染色体间清楚地看到银染物质相连.因此，应用银染核仁形成区（Ag-NOR）与近端着丝粒染色体随体联合（Ａｇ—AA）技术,可以分析有活性的rＲＮA基因的动态变化。正常人Ag－NOR平均为5．8／细胞。【实验用品】1．恒温水浴箱、显微镜、平皿、牙签、擦镜纸、镊子;２.预制染色体玻片标本、0。1%甲酸、AgNＯ3(50%）。1:20Gｉemsa，5moｌ／LHＣl。【实验步骤】1．按半微量法采取外周静脉血，接种培养。常规法制片。将染色体玻片标本在室温下放置2～3天。２．将标本置入5moｌ/LHCl溶液中常温处理5分钟,蒸馏水冲洗２—3次，甩干。3.将５００mｇAｇNＯ3溶于1ｍl0.1％甲酸溶液中,混匀后立即滴4~５（5ml）滴至玻片标本上.4.在平皿中平行放置两根牙签，将玻片标本放在牙签上。5。在标本上盖一张比玻片稍小的擦镜纸,用镊子掀动纸片数次,使染液均匀分散在标本上。6。将平皿置于６0℃水浴箱中处理3—５分钟７。蒸馏水冲洗去擦镜纸,以１:2０Giemsa染液复染3分钟。水洗,气干。8。镜下观察。【实验结果与分析】１.Ag—NOR的计数：选择银染着色清晰的分裂相，计数6个Ｄ组(1３、１4、和15号染色体）和4个G组(2１和22号染色体)近端着丝粒染色体,不论单侧或双侧的银染点都计数为一个有银染的染色体。2.Ag-AA计数：凡近端着丝粒染色体之间有银染物质相连的,均计数为Ａg—ＡA。涉及2条近端着丝粒染色体的联合，记为1个Ag—AＡ;涉及3条近端着丝粒染色体的联合，如未形成闭环的,记为２个Ag—AA；３条染色体联合形成闭环时，记为3个Ag—AA;依此类推。N个核型中含NOＲ染色体数之和NOR均值=Ｎ个核型（注：避免ＡgNＯ3溶液污染皮肤，否则将其染成褐黑色，很难洗掉.）实验五核酸提取TheＥxtｒaｃｔｉｏnoｆＮucｌeicAｃid【实验目的】1。掌握核酸提取的基本原理和基本方法２。掌握检测核酸浓度及纯度的原理及方法【实验原理】DNA是遗传信息的载体，是最重要的生物信息分子，是分子生物学研究的主要对象，因此DNA的提取也应是分子生物学实验技术中最重要、最基本的操作。如不能有效的完成ＤNＡ提取方面的工作，那就根本谈不上进行分子生物学方面的实验。在ＤNA提取过程中应做到：１、根据不同研究需要，保证结构的相应完整性；2、尽量排除其它大分子成分的污染(蛋白质、多糖及RＮＡ等）；３、保证提取样品中不含对酶有抑制作用的有机溶剂及高浓度的金属离子。核酸的提取关键是去除蛋白质，通常情况下,先用某些蛋白水解酶消化大部分蛋白质后,再用有机溶剂抽提,在单价阳离子存在下,核酸在乙醇中形成沉淀.作DＮA或RNA定量时，应在2６０nm和２80ｎm两个波长下读数。在２60ｎm的读数用于计算样品中的核酸浓度,ＯD值为1相当于大约5０μg/ml双链ＤＮA，４0μｇ/ml单链DNA或RＮA及大约２0μg/mｌ单链寡核苷酸。根据在26０nm以及在280nm的读数比值估计核酸的纯度。DNA及RNA纯品的OD2６0／OD280值分别是1.8和2。０，如果样品中污染有蛋白或酚,其OＤ260／OD28０将明显低于此值,此时无法对样品中的核酸进行精确定量.【实验用品】１.台式离心机；电热恒温水浴箱；冰箱；紫外分光光度计;一次性塑料手套.2.微量加样器(1000μl,200μl,２0μl);Tip头（10０0μl，200μl，2０μl)。Ｔip头盒(1０00μl，200μl，20μl）；Eｐpendｏｒfｆ管（2ml,1．5mｌ,0。5ｍl）,Epｐendｏrff管架。３.DNA提取的相关试剂:蛋白酶Ｋ(10mg／ｍｌ),-20℃保存。ＴE(pH８.0）:１0mmol/LTrｉs。Cl（ｐH8．０），1mmol/LＥDTA（pＨ８。0）,1５磅3）１0%SDS：1０ｇSDS溶于90mｌ水中，加热68℃4)3MＮaＡc:8００ml水中溶解408．1g三水乙酸钠，用冰乙酸调节pH值至5。2,加水定容至１Ｌ，高压灭菌，室温保存。5）饱和氯化钠，7０％乙醇,氯仿6)饱和酚【实验步骤】饱和氯化钠抽提法提取外周血DNA1.取0．5ml抗凝全血，加入0.8mlＴE（pＨ８。0)混匀;2．室温离心，100０0rpm，1分钟;３．弃上清，加入0.4ｍｌTE（pH8.0)，混匀，悬浮细胞;4．加入１０mｇ／ml蛋白酶Ｋ5μl（终浓度１0０μｇ／ｍｌ)，10％SＤＳ２5μl（终浓度0.5％）,混匀；５．37℃水浴消化过夜,或5０6．加入1/3体积的饱和氯化钠，充分混匀，4℃7。10０00rpｍ离心10分钟，取上清于另一新管中;8。加入等体积氯仿,混匀，10000rｐｍ离心1０分钟;9．取上清于另一新管中，加入1/20体积的3ＭNaAc（pＨ5。2）混匀；10.加入２倍体积无水乙醇轻轻混合，1000０rpm离心1分钟;11．弃上清，加入70%乙醇0。5ml,充分洗涤;１2．10000ｒpm离心1分钟,弃上清，自然干燥DＮA约５分钟;1３．加入２00－25０μｌTE，-2０℃14。检测浓度及纯度。酚氯仿抽提法提取外周血DＮA１。外周血反复冻溶破坏红细胞,取0.5ml外周血,加入0.5mlＰBS混匀后,10000rpｍ离心10分钟；2．弃上清，加入18０μｌTＥ（pH8．0)，2０μl1０%SDＳ,１0mg/mｌ蛋白酶K5μl(终浓度１0０μg/ml）混匀;３．３7℃水浴消化过夜,或５０４．加入等体积的饱和酚并充分混匀，１0０００rpｍ离心10分钟；5．吸取上清液于另一新管中，重复上一步骤一次；6．吸取上清液于另一新管中，加入等体积的酚氯仿并充分混匀，10０0０rpｍ离心10分钟;７.吸取上清液于另一新管中，加入1/20体积的3MＮaAc（ｐH５。2）混匀后,加入2倍体积无水乙醇并轻轻混合，可见絮状乳白色ＤＮA团块，１0００0rpｍ离心１0分钟；８.弃上清，加入7０％乙醇0。５ｍl,充分洗涤；9.10000rpm离心1分钟，弃上清，自然凉干后加入TＥ液，—２010。检测浓度及纯度组织总RNA的提取1。将组织用锡箔纸包裹后于液氮中冻10miｎ，击碎后回收入2ｍl无菌Eppenｄｏrff管中。按50－1００mg组织样品加1mlＴRIZOL试剂进行组织匀浆，样品体积不应超过TRIＺOL试剂体积的１0%;２．将组织匀浆液在１5－30℃放置5min，促使核蛋白复合物完全解离,按1mlTＲＩZOL，加入0.2ｍl氯仿，剧烈震荡１5s，15-30℃放置2-3min，在2－８℃，离心转速不超过3。在上清液中按１mlＴRIZOL试剂（最初匀浆体积)加入0.5ml异丙醇混匀,15—30℃放置１0miｎ，在2—8℃4.弃上清,７0％乙醇洗涤RNA沉淀(1mlＴＲIZOＬ试剂至少加入1ｍｌ70％乙醇)，振荡混匀，在２－8℃,离心转速不超过7５00ｇ，离心5min5．室温或真空干燥RNA沉淀,重新溶于DEPC水中（55℃６。紫外分光光度计检测ＲNA浓度和纯度；７.1%甲醛变性琼脂糖凝胶电泳分离总RＮA，每孔上样２5μg，６５V，2．５h,以检测ＲNA的质量。【实验结果分析】1.计算已提取的DNA的浓度和纯度【思考题】1．DNＡ提取还有哪些方法?２.RNＡ提取中关键问题是什么？实验六DＮA重组技术RecombｉnａｎtDNA【实验目的】1．掌握ＤNＡ重组技术的基本原理和基本方法2．熟悉质粒DＮA的小量制备及酶切鉴定方法【实验原理】1．DNA重组技术重组DNA（ＲecombinantDNA）技术是遗传工程的核心技术，也是人类在基因和ＤNA分子水平进行操作的技术。它包括以下几个步骤：重组DNA分子的构建：即将目的基因（ＤNA或cDNＡ片段）与载体DＮＡ重组，应用TA克隆方法，将ＰCR扩增产物快速克隆至质粒载体中.该方法利用了PCR过程中使用的热稳定聚合酶(Taq酶)在所复制的双链分子末端加上单一脱氧腺苷酸（A)，从而产生一Ａ—粘性末端的性质，设计一种线性载体，使之含有一T-粘性末端,可直接插入ＰCR产物，在DNA连接酶作用下,目的DNＡ和载体DNA连接形成重组DNA分子.将重组DＮA分子转化宿主细胞。克隆选择增殖：将转化后的液体涂布于琼脂培养基表面，培养基中含有宿主菌敏感的抗生素，重组DNA(TA克隆载体分子）含有相应抗生素的抗性基因，转化的细菌能在培养基上生长形成集落.挑取菌落,置液体培养基中培养,得到大量含重组DNA的细菌。收获扩增后的培养细胞，提取重组DNA分子(质粒)，并纯化，获得某一基因或DNA片段的大量拷贝。图2。1ＴA克隆原理示意图图2。2克隆选择增殖原理示意图２．质粒DNA的小量制备常见的质粒DＮＡ提取方法有简易一步提取法、碱裂解法和煮沸法。本实验采用的是碱裂解法，碱裂解法的原理：在PH12。0~12．６碱性环境中,线性的大分子量细菌染色体DNA变性,而共价闭环质粒(CC）DNA仍为自然状态。将pH调至中性并有高盐浓度存在的条件下,染色体DNA之间交联形成不溶性网状结构。大部分染色体DＮA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DＮA仍为可溶状态.通过离心，将可去除大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质，质粒DNA尚在上清中,再用乙醇沉淀回收质粒DＮＡ.3．质粒DNA的限制性内切核酸酶（限制酶）切分析限制酶存在于原核生物体内,根据其结构和功能特性分为:Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型。Ⅰ型切点不固定，Ⅲ型其切割位点在识别位点之外，只有Ⅱ型其特异性切点位置可以控制和预测，可以产生固定的ＤNA片段,基因工程中所用的限制酶均为Ⅱ型限制酶。这类酶的特点是具有能够识别双链DNA分子上的特异性核苷酸序列的能力，能在这个特异性核苷酸序列内切断DＮA双链,形成一定长度和顺序的DNA片段。选择合适的限制酶对重组的环状质粒进行酶切,将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，用已知相对分子量的线状ＤNA（ＤNA分子量标志）及未经酶切的重组环状质粒为对照，可以对重组环状质粒中的目的ＤNA分子进行初步鉴定.【实验用品】1．ＰCR扩增仪；恒温振荡培养箱;超净工作台；细菌恒温培养箱；台式高速离心机；电热恒温水浴箱；冰箱；电泳仪；电泳槽，样品槽模板(梳子)；紫外灯;保鲜膜；一次性塑料手套;凝胶自动成像仪.2.三角烧瓶（50０ｍl，2５０ml，１00mｌ），培养皿，玻璃试管，试管塞,玻璃棒，酒精灯,镊子，脱脂棉，纱布，乙醇,容器盒。3．微量加样器（10００μｌ，20０μl，20μl）;Tip头（1００0μl,200μl，２0μｌ）。Tｉp头盒(１０0０μｌ,200μl,20μl）；Ｅppeｎdorff管（２ｍl，1。5ml，0。5mｌ)，Eppendoｒff管架.Parafilm，透明胶带.4。DNA重组相关试剂:1）TａｑDNA聚合酶,缓冲液，dNTP，特异性引物，靶DNA;凝胶回收试剂盒；TA克隆载体:pMD１8—T;感受态细菌；氨苄青霉素(1０0ｍg/ｍl）。LＢ培养基：胰蛋白胨1０g,酵母提取物5g，氯化钠１0g,10NNaOH调ｐH至7.０定容至1L。15磅高压消毒，4℃３）LB琼脂培养基:15ｇ琼脂粉溶于1０00mlＬB培养基，15磅５．质粒提取试剂：溶液Ⅰ(10×):0.5M葡萄糖；0．25MＴris—Cｌ（pH8。0);0．1MEDTA,1０磅高压消毒，4溶液Ⅱ:0。2ＮNaＯH；1％SＤS室温贮存,即用即配。溶液Ⅲ：3ＭNaOＡc（pH4．8）10磅RNA酶A：10mg/mｌTE缓冲液:１０mMTｒｉs－Cl（pH7.6),1mMEDTA（pH8。0）６．质粒DＮA的限制性内切酶酶切及琼脂糖凝胶电泳相关试剂:限制性内切酶HiｎｄⅢ、XbaｌⅠ及酶反应所需缓冲液;琼脂糖；溴化乙啶贮存液（１0mg/ｍl）；6×载样缓冲液。Tｒｉs-乙酸(TAE)贮存液:50×：２4２克Tｒｉｓ碱，57。1ｍl冰乙酸,１00ml0。5mol/LEDＴＡ(ｐH８。0）加水至１Ｌ【实验步骤】1.PCR产物纯化PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，应用凝胶回收试剂盒回收纯化目的DNA片段。2.目的DNＡ片段连接至T／Ａ克隆载体即重组DNA分子的构建反应体系及条件如下：ＰMＤ18－TVｅctｏｒ（5０ng／μl）１μl目的ＤNA（５ng/μl）4μｌ连接液Ⅰ5μl10μｌ1６℃图2。３pＭD１８-T载体3．转化3.1将感受态细胞置冰中融解.3。2将60μl感受态细胞移至无菌试管内。3.３加入用于转化的DＮＡ10μl（〈10ng),轻弹管底混匀。３．4冰中放置30分钟。3.542℃３。6冰中放置２～3分钟。3．７加入37℃预温好的LB培养基94０μｌ３．8３7℃振荡培养1小时(160~225ｒｐm4.筛选及增菌4。1取适量涂布琼脂平板。4．２３7℃4．3挑取菌落,放在2～５mlLB液体培养基中（含５0μg／mlAmp）过夜培养(240ｒpｍ）。4．4收集细菌，提取质粒。5．质粒ＤNＡ提取5．12mｌ菌液以1２000ｒpm离心１分钟.5.2弃上清，沉淀物溶于10０μｌ溶液Ⅰ(1×)中，剧烈振荡，室温5分钟。5．3加新配制的溶液Ⅱ20０μl，充分混合后冰浴5分钟。５.4加溶液Ⅲ1５0μl，混匀冰浴5分钟。5。５12000rpm离心10分钟，将上清转移到另一离心管中。5。６加9０0μl(２倍体积)的乙醇,震荡混合,室温放置2分钟，沉淀双链DNＡ。5.712000rｐｍ离心５分钟。5。８小心吸去上清液，将离心管倒置于一张纸巾上，以使所有液体流出。再将附于管壁的液滴除尽.５。9用１ml70%乙醇洗涤沉淀的双链ＤNＡ，按“步骤5.８”所述方法去掉上清,在空气中使沉淀的DNＡ干燥5。１0用50μl含胰RNA酶(20μｇ/mｌ)的ＴＥ重新溶解核酸，振荡,贮存于－2０6。质粒DＮA的限制性内切酶酶切及琼脂糖凝胶电泳分离、鉴定６。1质粒ＤNA的限制性内切酶酶切将清洁、干燥、灭菌的Eｐｐenｄｏrff管（0．５ml)编号,用微量加样器按表1所示将各种试剂分别加入每个管内。表1质粒ＤNA的限制性内切酶酶切加样表编号试剂1（实验组）2(对照组）酶反应所需缓冲液2μl2μl０.1%BSA１μl1μｌ限制性酶HindⅢ１μl限制性酶XｂalⅠ1μl质粒DNA８μl8μｌ无菌去离子水7μｌ9μl总体积2０μl20μl加样后，小心混匀，置于37℃水浴消化过夜，然后６5℃20分钟终止酶解反应.各酶切样品于6。２琼脂糖凝胶电泳分离、鉴定质粒ＤＮA酶切片段6.取有机玻璃内槽,洗净晾干。取透明胶带将有机玻璃内槽的两端边缘封好（注意,将透明胶带紧贴于有机玻璃内槽的两端边上，不要留空隙)。将有机玻璃内槽置于一水平位置，在距离底板0。５～１．0mｌ的位置放入梳子。6.称取0．6克琼脂糖，置于锥形瓶内，加入５0ml1×ＴＡＥ,瓶口用保鲜膜封盖,在微波炉中加热直至琼脂糖全部溶解,得到1.２％琼脂糖凝胶液，待其冷却至６5℃左右，加入2．5μl溴化乙啶贮存液（10mg/ｍl),使溴化乙啶终浓度为0．5μg/ｍl。小心混匀并倒在有机玻璃内槽中，控制灌胶速度，使胶液缓慢展开,避免产生气泡,直到在整个有机玻璃板表面形成均匀的胶层.室温下静置1小时左右,待胶凝固完全后,轻轻拔出梳子，在胶板上即形成相互隔开的样品槽。将凝胶放入电泳槽中，加入恰好没过胶面1mｍ6。取适量的酶切样品,加入6×载样缓冲液适量（终浓度为1×）,用微量加样器将上述样品分别加入胶板的样品小槽内。６．加完样品后的凝胶板立即通电进行电泳,ＤNA带负电荷,由负极向正极移动。电场强度不高于5Ｖ/cm。当溴酚蓝染料移动到距离胶板下沿１～2cm处,停止电泳.6。取出凝胶,在波长为2５4nm的紫外灯下观察凝胶.DＮＡ存在处显示出红色的荧光条带。在紫外灯下观察时，应戴上防护眼镜或采用有机玻璃防护罩，避免眼睛遭受强紫外光损伤.以上步骤也可以用凝胶自动成像仪处理。【实验结果分析】１.记录DNA重组的方法.2。观察分析经酶切质粒ＤＮA(实验组）和未经酶切质粒DＮA（对照组)琼脂糖凝胶电泳结果.【思考题】为什么PCR产物需经纯化后再与载体连接?重组DNA分子转化感受态细胞后，为何３7℃ﻬ实验七PCR-RFＬP分析技术PoｌyｍeraｓｅChainReacｔion–RestrictionFragｍｅｎｔLenｇtｈPolymorphiｓm【实验目的】1．熟悉PCR—RFLＰ分析技术原理及实验步骤.2.掌握琼脂糖凝胶电泳检测方法。3．了解PCＲ—RＦLP在遗传病基因诊断中的作用。【实验原理】聚合酶链式反应（ＰCR)是模拟体内ＤNA复制条件在体外酶促合成特异ＤNA片段的循环反应,可使目的ＤNA片段得以迅速扩增。其主要步骤是：将待扩增的模板ＤNA置于高温（约９3℃－95℃)下使之变性解链；人工合成的两个寡核苷酸引物在低温（约50℃—70℃）下分别与目的ＤNA片段两侧的互补序列复性结合;引物在DNA聚合酶作用（约7０℃－75℃）下沿模板按５'聚合酶链式反应—限制性片段长度多态（PCR—RFLP)分析技术是在ＰCR技术基础上发展起来的。ＤNA碱基置换正好发生在某种限制性内切酶识别位点上，使酶切位点增加或者消失，利用这一酶切性质的改变，PCR特异扩增包含碱基置换的这段DNA,经某一限制酶切割,再利用琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物，与正常比较来确定是否变异。应用PＣＲ—RFLＰ，可检测某一致病基因已知的点突变，进行直接基因诊断,也可以此为遗传标记进行连锁分析进行间接基因诊断。本实验以家族性甲型血友病患者及其相关成员外周血DNＡ为模板，PCR扩增凝血因子FⅧ基因的58３bp特异片段产物，其中包含MspⅠRFLP多态位点，经MspⅠ酶切后，琼脂糖凝胶电泳检测等位片段的长度(５８3ｂp或３６0bp+223bp），以此为遗传标记进行连锁分析，判断胎儿是否得到了带有缺陷FⅧ基因的染色体，从而做出间接基因诊断。【实验用品】１.DNA（50ng／μl)、引物Ⅰ和Ⅱ(２０μΜ）、TａqDNA聚合酶(5U／μｌ）10×ＰCR反应缓冲液、ｄNTP(２．5ｍM）、灭菌蒸馏水、液体石蜡、限制性内切酶MsｐⅠ（20U/μl)、1０×酶切缓冲液.２.2％的琼脂糖凝胶、5×TAE、6×上样缓冲液、DNAMarker、溴化乙啶贮存液（１０mg/mｌ）(EB）。3．PCＲ自动热循环仪、紫外透射仪、微量加样器（20μl、２00μl)、枪头（２0μl、20０μｌ）及离心管（１ml、0。5ml)、容器盒、恒温水浴箱、琼脂糖凝胶电泳装置、烧杯、保鲜膜、封口膜、浮漂、微波炉、２50ml三角烧瓶、透明胶带、托盘天平、台式高速离心机.【实验步骤】一．PＣＲ反应PＣR反应体系２０μl,其成分如下：ddH２O12．5μl１0×PCR缓冲液2．5μｌdＮＴP（2.5mM）2.0μl引物1(20μM）０.5μl引物2（20μM)0．5μｌTaqE(5U/μｌ)0.15μl模板DＮA2.0μl２０μｌ按以上次序，将各物质加入到一只无菌的０.5mｌ离心管中。轻轻混匀后,离心5秒钟，加入一滴液体石蜡盖于反应混合液的表面，然后放入ＰＣＲ仪中进行循环反应。PCＲ反应循环温度：9４℃94℃变性３0秒；58℃复性３０秒;7２℃最后经72℃反应结束后置4℃二。PＣR产物的MspⅠ酶切反应体系２0μl其成分如下:无菌水9μl１0×Ｂｕｆfer２μlBSA２μlＭｓpⅠ(10U／μl）1μlＰCR产物6μl２0μl置37℃水浴消化1小时，４℃琼脂糖凝胶电泳检测1。胶板的准备取有机玻璃内槽,洗净晾干.取透明胶带将有机玻璃内槽的两端边缘封好（注意,将透明胶带紧贴于有机玻璃内槽的两端边上，不要留空隙)。将有机玻璃内槽置于一水平位置，在距离底板0．５~1。0ml的位置放入梳子。2．２%的琼脂糖凝胶的制备称取1克琼脂糖，置于锥形瓶内，加入50ml１×TAE，瓶口用保鲜膜封盖,在微波炉中加热直至琼脂糖全部溶解，得到２%琼脂糖凝胶液，待其冷却至65℃左右，加入2。5μl溴化乙啶贮存液（１0ｍg/ｍl)，使溴化乙啶终浓度为0．5μg/mｌ。小心混匀并倒在有机玻璃内槽中，控制灌胶速度，使胶液缓慢展开,避免产生气泡,3．将凝胶放入电泳槽中,加入恰好没过胶面1mm深的足够电泳缓冲液，预电泳10mｉｎ。4．每份限制酶切产物取1０μl,加2μl6×上样缓冲液,混匀后加入到样品孔中，以1０0V电泳５0分钟。５。断电后取出凝胶，放在紫外透射仪中观察并记录PCR-RＦLＰ结果。【实验结果与分析】根据甲型血友病患者及其相关成员的亲属关系绘制遗传系谱图,观察并记录琼脂糖凝胶电泳分离的DNA片段长度,绘制出家系各成员FⅧ基因ＭｓpⅠＲFＬＰ等位片段与系谱相关图,进行连锁分析，判断胎儿是否是甲型血友病患儿。家系系谱：电泳结果：附病例：现有一名女性已生过一个甲型血友病儿子和一个表型正常的女儿，追问家族史其弟弟也是甲型血友病患者.该女性现妊娠４个月,要求作产前基因诊断。（注：胎儿性别产前基因诊断结果：SRY(+）,ZFX/ZFY(+／+）。）实验八PCＲ-SＳCPＰｏlymeｒaseＣhaｉｎＲｅactｉon-SingleStrandConformatiｏnＰｏlyｍorphism【实验目的】１.了解ＰＣＲ－SSCP技术的原理。2．了解并熟悉PＣR－ＳSCP技术的步骤。【实验原理】PCＲ-ＳSＣＰ是198９年日本Orita等创建的筛查突变的新技术.它是一种简单、快速、经济的点突变筛查手段。PCR－SSCP技术的基本原理是PＣＲ扩增后的DNＡ片段经变性成单链DNA,单链DNA在中性聚丙烯酰胺凝胶中电泳时形成不同的立体构象，其构象直接影响泳动速率，相同长度的DＮA单链其核苷酸顺序仅有单个碱基的差别，就可以产生立体构象的不同，造成泳动速率的不同,产生不同的泳动带。PCR扩增后的DNＡ片段经变性成单链后在不含有变性剂的中性胶中电泳，与正常比较出现泳动带的变位即可推测存在碱基置换。其碱基置换的性质必须经过DNA测序才能确定。因此PＣＲ－SＳＣＰ检测是测序之前突变筛查的常用手段.为了便于观察分析结果，ＰCＲ扩增体系中常加入-３2PｄNＴP标记PCR产物，电泳后放射自显影观察泳动带的位置。目前也常用银染法来染色聚丙烯酰胺凝胶上的ＤNA泳动带,此方法可避免同位素的污染及对操作者的辐射损伤，但其灵敏度不如用同位素标记。单链DNA片段的立体构象主要与碱基序列相关,但也受到其他条件的影响。因此，PCR－ＳSＣＰ技术的关键在于电泳时的诸多条件，如凝胶的组成、电泳的温度、离子浓度以及影响分子内相互作用的其他溶质等。PCR-SSCP的缺点是存在假阴性和假阳性，一般对长度不超过300bp的待测片段的检出率为70～８0％.【实验用品】1．PCＲ扩增仪；聚丙烯酰胺凝胶电泳装置；电泳仪；电泳槽。2．6％非变性聚丙烯酰胺凝胶（49:1）、１TBE、10％过硫酸铵、TＥMEＤ、甲酰胺上样缓冲液、固定液、银染液、显色液、琼脂糖3.微量加样器(２００μl，２0μl）;Tip头(200μl，20μl）.Ｔip头盒（200μl，2０μl）；Eｐｐｅndorf管（0.５ml，0.２ml),Ｅｐｐendorf管架。4.ＰCR扩增相关试剂。【实验步骤】１。PCＲ反应(同前）PCＲ产物经琼脂糖电泳确认。２.ＰCR反应结束后,取５μl扩增产物加１0μl甲酰胺上样缓冲液混匀，９８℃３．非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳３．1制备50ml6%非变性聚丙烯酰胺凝胶,加TEMED25μl、１0％过硫酸铵250μl，混匀后灌胶,插入加样梳子.待胶完全聚合后,拔出加样梳子，安装电泳装置，加入1TBＥ电泳缓冲液，缓冲液应高于加样孔上缘,用注射器吸取缓冲液冲净加样孔。3。2取已变性的5μｌPCR扩增产物加到点样孔中,以20０V/cm电泳4~5小时.３。3拆下电泳装置,取出聚丙烯酰胺凝胶，放到一个塑料盘内，用蒸馏水冲洗1～2遍。３．4倒入固定液，固定８~10分钟。３．5用蒸馏水冲洗1~２遍;倒入银染液，银染10~12分钟。3。6用蒸馏水冲洗若干遍;倒入显色液,显色至出现清晰的银染带.3