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本文格式为Word版，下载可任意编辑——原生质体制备拟南芥原生质体制备转化方法

选取开花前生长良好状况的拟南芥（Columbia型）叶片，用刀片切成0.5-1mm宽的叶条；浸于配置好的酶解液中（每5-10mL酶解液约10-20片叶子）；暗箱抽真空，30min；转移至室温，继续黑暗酶解3-5h；当酶解液变绿时轻轻晃动培养皿促使原生质体释放；参与等量的W5溶液稀释酶解液；用60-100目筛子（W5溶液润湿）过滤酶解液；将滤液转移至30mLeppendorf管，500-700g离心1-2min，弃上清；参与10mL预冷的W5溶液轻柔重悬原生质体；放于冰上静置30min；保持室温在23℃以下；500g离心8-10min，弃上清；参与1mLMMG溶液重悬原生质体（使其终浓度约在2×105个/mL）；即得到原生质体溶液。用移液器吸取100L的以上原生质体溶液于1.5mLeppendorf管，参与10LDNA（10-20g的质粒DNA），轻柔混合后，参与110LPEG溶液，轻柔拍打eppendorf管使其混合完全；室温下诱导转化5-15min；参与400-440LW5溶液稀释转化混合液，轻柔颠倒，使之混合完好以终止转化反应；500g离心2min，弃上清；参与1mLW5溶液悬浮清洗，500g离心2min，弃上清；再用1mLWI溶液轻柔重悬原生质体；室温（20-25℃）下，诱导载体表达18小时以上。

相关溶液配制

PEG4000溶液（现用现配）

组分PEG40001MCaCl20.8甘露醇

水

纤维素酶解液

试剂15mL酶液体系

1-1.5%CellulaseR10(YaKultHonsha)0.225g纤维素酶0.2-0.4%MecerozymeR10(YaKultHonsha)0.045g果胶酶0.4M甘露醇1.09g甘露醇干粉20mMKCl1mL0.3MKCl20mMMES,pH5.71mL0.3MMES，pH5.7

加水10mL55℃水浴加热10min，冷却至室温后参与以下试剂10mMCaCl20.1%BSA

5mMβ-巯基乙醇

用0.45?m滤膜过滤后即可使用。W5溶液（1000mL）

组分NaClCaCl2·H2O

用量

9g18.4g

1mL0.15MCaCl21mL1.5%BSA1mL75mMβ-巯基乙醇

用量1g0.25mL0.625mL0.75mL

KCl0.37g葡萄糖0.9gMES0.3g

用1MKOH调pH至5.8，高温高压灭菌20min，室温保存。

MMG溶液（500mL）

组分用量MgCl0.71gMES0.5g甘露醇36.5g

用KOH调pH5.6，高温高压灭菌20min，室温保存。

WI溶液（200mL）

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