在大肠杆菌中高效表达外源蛋白的策略

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本世纪60至70年代对大肠杆菌的研究使之成为自然界中最普遍为人们所认识的生物体。大肠杆菌具有两个显著特征：操作简单和能在廉价的培养基中高密度培养，它的这些特征加上十多年外源基因表达的经验使其在大多数科研应用中成为高效表达异源蛋白最常用的原核表达系统。尽管大肠杆菌有众多的优点，但并非每一种基因都能在其中有效表达。这归因于每种基因都有其独特的结构、mRNA的稳定性和翻译效率、蛋白质折叠的难易程度、宿主细胞蛋白酶对蛋白质的降解、外源基因和E.coli在密码子利用上的主要区别以及蛋白质对宿主的潜在毒性等等。但知识的大量积累还是有助于为表达方面某些特定的困难提供一般的解决方法。大肠杆菌作为表达系统的主要障碍包括：不能象真核蛋白那样进行翻译后修饰、缺乏将蛋白质有效释放到培养基中的分泌机制和充分形成二硫键的能力。另一方面，大量真核蛋白在非糖基化的形式下能保存其生物学活性，因而也就可以用大肠杆菌来表达。如何实现外源基因在原核细胞中的有效表达，自60年代以来，对影响外源基因在其表达体系中表达效率的各个因素作了大量试验研究，并有多篇归纳性综述发表[1，2，3]。国内针对外源基因在原核细胞中高效表达的关键因素，构建了高效表达载体[4]，并在此基础上成功表达了一系列细胞因子的基因[5，6，7]。我们在分析了国内外有关在原核系统中表达蛋白的试验资料的基础上，对在大肠杆菌中高效表达外源蛋白的策略所涉及的内容进行全面的总结，以期有助于我国在这方面的研究。

1.有效表达载体的构型

构建表达质粒需要多种元件，需要细心考虑它们的组合，以保证最高水平的蛋白质合成。E.coli表达载体的基本结构[8]。

启动子(以杂和的tac启动子为例)位于核糖体结合位点（RBS）上游10-100bp处，由调理基因（R）控制，调理基因可以是载体自身携带，也可以整合到宿主染色体上。E.coli的启动子由位于转录起始位点上游约35bp的六核苷酸序列（-35区）和一短序列隔开的另一六核苷酸序列（-10区）组成[9,10,11]。有大量启动子可用于在E.coli中的基因表达，包括来源于革兰氏阳性菌和噬菌体的启动子。理想的启动子具有以下特性：作用强;可以严作风控;简单转导入其他E.coli以便筛选大量的用于生产蛋白的菌株，而且对其诱导是简便和廉价的[12]。在启动子下游是RBS，其跨度约为54个核苷酸，两端限定在-35（±2）和mRNA编码序列的+19到+22之间[13]。Shine-Dalgarno(SD)位点[14,15]在翻译起始阶段与16SrRNA的3’端相互作用[16]。SD与起始密码子间的距离约为5-13bp[17]，而且此区的序列在mRNA转录物中应避免出现二级结构，否则将会降低翻译起始的效率[18]。在RBS的5’和3’端均为A丰富区[19]。转录终止子位于编码序列的下游，作为转录终止的信号[20]和组成发卡结构的保护性元件，阻止核酸外切酶对mRNA的降解，从而延长mRNA的半衰期[21]。

除了上述对基因表达的效率有直接影响的元件以外，载体还含有抗生素抗性基因，以便利质粒的筛选和传代。氨苄青霉素是最常用的抗性标记。但在生产人用治疗性蛋白时，最好选择其他抗性标记(如Tet)以避免可能发生的过敏反应[22]。质粒的拷贝数由复制起点决定。在特别状况下，选用失控复制子能够获得大量的质粒拷贝数和较高产量的质粒编码蛋白[23，24]。但在另外一些状况下，

选用超过pBR322的高拷贝质粒似乎并没有好处。而且已有资料说明，增加质粒的拷贝数降低E.coli中胰酶的产量，在高拷贝质粒中，强启动子的存在严重影响了细胞的活性[25，26]。

转录水平调控1.启动子

能在E.coli中发挥作用的启动子好多。这些启动子必需具有适合高水平蛋白质合成的某些特性。首先启动子的作用要强，待表达基因的产物要占或超过菌体总蛋白的的10-30%；其次，它必需表现最低水平的基础转录活性。若要求大量的基因表达，最好选用高密度培养细胞和表现最低活性的可诱导和非抑制启动子。假使所表达的蛋白具有毒性或限制宿主细胞的生长，选用可抑制的启动子则至关重要[27，28]。例如，轮状病毒的VP7蛋白能有效地杀死细胞，因此必需在严格控制的条件下表达[29]。但在某些状况下，启动子的严格性并不合理，由于即使最小量的基因产物也能由于其毒性而杀死细胞。如能灭活核糖体或破坏膜渗透压的分子对细胞来说是致死性的[30]。对宿主的毒性并不仅限于外源基因，某种自身蛋白的过量表达也能造成同样的结果。如编码外膜磷脂蛋白的traT基因[31]。另外，不完全抑制的表达系统会造成质粒的不稳定，细胞生长速度的下降和重组蛋白产量的降低[32，33]。Lanzer和Bujard曾对常用的lac启动子-操纵子系统进行了广泛的研究，证明操纵子放在启动子序列的不同位置会造成70倍差异的抑制。将17bp的操纵子置于-10和-35六聚体区之间所形成的抑制比将其放在-35区的上游或-10区的下游要高50-70倍[34]。启动子的第三个特性是其简便和廉价的可诱导性。大量生产蛋白质最常用的启动子是热诱导（λPL）和化学诱导(trp)启动子。异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导的杂交启动子tac[35]或trc[36]都是强启动子，在基础研究中应用很广。但在大量生产人用治疗性蛋白时用IPTG做诱导剂是不可取的，由于IPTG具有毒性而且价格昂贵[37]。IPTG的这些不足至今仍限制tac或trc强启动子在大量生产人用治疗性蛋白中的应用。编码热敏lac阻遏蛋白[38]的突变lacI（Ts）基因的出现使得目前能够对这些启动子进行热诱导[39，40]。另外，还出现了一些新型载体，它们允许在30℃对trc启动子进行严紧调理。最近还报道了两种不同的lac阻遏蛋白突变体，能够同时允许热

诱导和IPTG诱导[41，42]。尽管野生型lacI基因也能热诱导，但不能对其进行严紧型调理，且不能用于lacIq菌株，由于温度的变化不能遏制由lac阻遏蛋白的过量表达所造成的严紧性抑制[43]。因此，该系统只能用用于生产对宿主菌无害的一些蛋白。

冷反应启动子尽管不象其他启动子那样得到广泛的研究，但已经被证明能在低温条件下进行有效的基因表达。噬菌体λPL启动子的活性在20℃时最高，随着温度的升高，其活性逐渐降低[44]。PL启动子的冷反应由E.coli整合宿主因子，一种与DNA结合的序列特异性多功能蛋白来正调控[45，46]。主要冷应激基因cspA启动子同样也被证明在低温具有活性[47]。对cspA和PL启动子进行分子剖析，鉴定了在较低温度下参与加强转录的特异性DNA区域。从而开发了一系列在20℃低温具有高活性的PL衍生启动子[48]。选用冷反应启动子的基本原理是在15-20℃的条件下，蛋白质的折叠速度只受到微弱的影响，而作为生物化学反应，转录和翻译的速度将被充分降低。这就为蛋白质折叠、产生有活性的蛋白和避免非活性蛋白聚合体即包涵体的形成提供了充足的时间，而目的蛋白的最终产量并未减少。最近新报道的一些启动子具有诸多迷人之处,为选择新的高效表达系统提供了便利。如十分强的pH启动子[49，50],重组蛋白的产量可达总蛋白的40-50%[51]。但表达的水平会因不同的基因而有差异。由于蛋白质的合成不仅依靠于启动子的强弱，而且有赖于转录的效率。

人们寻常只考虑E.coli启动子的核心区域，即-10和-35六核苷酸区和一15-19bp的间隔序列。但有人提出核心序列以外的元件也能刺激启动子的活性[52]。大量研究也已证明，核心启动子上游的序列能够在体内提高转录起始的效率[53，54，55]。Gourse等证明，位于E.colirRNA启动子rrnBP1-35区上游的DNA序列即UP元件，能够在体内和体外提高转录效率30倍[56]。UP元件是作为一个独立的启动子组件发挥作用的，由于将其融合到其他启动子如lacUV5中也能刺激转录[57,58]。UP元件与其他启动子融合所表现的这种转录加强子效应，使其有望通用于高效表达系统。尽管已经证明rRNA启动子P1、P2的超强能力[59]，但它们仍未被用于E.coli进行高水平表达，其主要原因是难以对其进行调控。rRNA的体内合成附属于细胞增殖速度的控制。在细胞快速增殖期，P1和P2是活化的，

当细胞处于生长的静息期，则P1、P2被负调理。因此，rRNA启动子在前诱导期将持续活化。在体内快速增殖的细胞中，P2的活性很弱，而且可诱导性差，但若与P1分开，P2启动子的活性明显升高（达到P1的70%），且对应激反应敏感。这说明在自然的串联体中，P2是部分关闭的[60]。Brosius和Holy[61]将lac操纵子序列插入到rrnBrRNAP2启动子的下游，在带有lacIq基因的菌株中成功地抑制了P2的活性。转录活性是以氯霉素乙酰转移酶的产生和4.5sRNA的表达为标准的。然而，P2构建体的活性只相当于tac启动子活性的1/2，而且当rrnBP1启动子被置于P2启动子下游时，不能完全抑制转录。有人试图利用反转启动子的方向来严作风控rRNA启动子。将rRNA启动子克隆于目的基因的上游，但转录方向相反。利用λ整合位点和可调控的λ整合酶来实现启动子的反转，从而达到进行诱导的目的，而且，在高度活化的启动子上游有一强转录终止子将避免在前诱导期可能出现的载体的不稳定性。2.转录终止子

在原核生物中，转录终止有两种不同的机制。一种是依靠六聚体蛋白rho的rho依靠性转录终止，rho蛋白能使新生RNA转录本从模板解离。另一种是rho非依靠性转录终止，它特异性依靠于模板上编码的信号，即在新生RNA中形成发卡结构的一回文序列区，和位于该回文序列下游4-9bp处的dA、dT富含区[62,63]。虽然转录终止子在表达质粒的构建过程中常被忽略，但有效的转录终止子是表达载体必不可少的元件，由于它们具有极其重要的作用。贯穿启动子的转录将抑制启动子的功能，造成所谓的启动子封堵[64]。这种效应可以通过在编码序列下游的适当位置放置一转录终止子，阻止转录贯穿别的启动子来避免。同样地，在启动目的基因的启动子上游放置一转录终止子，将最大限度地减小背景转录[65]。另有资料证明，由强启动子启动的转录会使转录通读到复制区，造成控制质粒拷贝数的ROP蛋白的过量表达，从而导致质粒的不稳定[66]。另外，转录终止加强mRNA的稳定性[67]，从而提高蛋白质的表达水平。假使来源于E.colirrBrRNA操纵子的两个转录终止子T1和T2串联，则效果更好[68]。但其他的大量转录终止子寻常状况下都是十分有效的。3．转录抗终止子

细菌中大量参与氨基酸生物合成的操纵子在其第一个结构基因的5’端含有转录

衰减子。衰减子由特定操纵子的氨基酸产物调理。这样关联的带电荷tRNA的存在就会在核糖体剪切之后引导初始转录本中二级结构的形成。假使没有关联的带电荷tRNA，则会形成抗终止子结构，从而抑制终止子中发卡结构的形成和转录的终止[69]。抗终止元件能使RNA多聚酶越过核糖体RNA操纵子中的rho依靠性终止子即boxA[70,71]。转录抗终止是有一个极其繁杂的过程，其中包含大量已知和未知因子。有关这方面的知识已有详尽的综述。在此我们主要探讨抗终止元件在E.coli中表达外源基因的应用。

在E.coli表达系统中作用比较强、应用较广的一个启动子是噬菌体T7晚期启动子[72,73]。该系统的活性依靠于提供T7RNA多聚酶的转录单元。RNA多聚酶的严格阻遏对防止T7启动子的渗漏是必需的。有大量用于调理T7多聚酶表达的途径，但每一种方法都有其各自的缺陷。Merten等通过构建一基于λPL调理的反转衰减T7RNA多聚酶表达盒说明了这一问题。可以通过在启动子和编码T7多聚酶的基因之间插入三个串联排列的转录终止子来减弱T7多聚酶的基础表达水平。在诱导的状况下，噬菌体λ来源的nutL依靠的抗终止功能也可以协同来阻止转录终止[74]。来源于E.colirrnBrRNA操纵子的转录抗终止区已被用于某些表达载体如pSE420。该载体应用trc启动子[75]。其基本原理是使得转录通过重度二级结构区，从而减少宿主RNA多聚酶引起的转录提前终止的可能性。但是rrnB抗终止子在这种状况下似乎并不十分有效。4．严紧型调理表达系统

可严紧调理的启动子的优点使得我们能够设计大量巧妙、可高度抑制的表达系统。这在表达那些产物对宿主的生长不利的基因时特别有用。所用的策略包括“铺平板〞法[76]；提高抑制基因和操纵基因的比例[77]；用突变的噬菌体感染诱导[28]；致弱高拷贝数载体上的启动子活性[78]；利用转录终止子和抗终止子[79]；在拷贝数可控的质粒中使用可诱导的启动子[80]；使用“交织调理〞系统[81]；共转导使用SP6RNA多聚酶的质粒[82]；利用与克隆基因mRNA互补的反义RNA[31]。最终一个巧妙的方法是反转启动子：在启动子两侧为两个λ整

密码子的使用

原核和真核生物的基因对同义密码子的使用均表现非随机性[171，172]。对E.coli中密码子的使用频率进行系统分析得到以下结论[173]：（1）对于绝大多数的简并密码子中的一个或两个具有偏好；（2）某些密码子对所有不同的基因都是最常用的，无论蛋白质的含量多少，例如CCG是脯氨酸最常用的密码子；（3）高度表达的基因比低表达的基因表现更大程度的密码子偏好；（4）同义密码子的使用频率与相应的tRNA含量有高度相关性。这些结果示意,富含E.coli不常用密码子（表1）的外源基因有可能在E.coli中得不到有效表达。已经证明[174]，微精氨酸tRNAArg(AGG/AGA)是多种哺乳动物基因在细菌中表达的限制因子。由于AGA和AGG在E.coli中不常用。假使共表达编码tRNAArg(AGG/AGA)的argU(dnaY)基因，就会高水平表达目的蛋白[174]。但利用同方法所进行的另外几项研究的结果却不一致[175，176]。其他的研究说明,通过用常用密码子替换稀有密码子或与“稀有〞tRNA基因共表达可以提高外源基因在E.coli中的表达水平[177，178]。大量研究者对有关密码子使用模式的进化意义和密码子使用效果的机制进行了研究，但至今尚未找到协调密码子的使用和转录本翻译的确切规则。似乎在转录本5’末端附近存在稀有密码子将会影响翻译效率。另外，基因5’编码区中GC含量似乎也影响其表达。这在人胸苷酸激酶（TS）中已经得到证明[179]。在不改变所编码蛋白的前提下，将TScDNA的第三、四、五密码子的嘌呤碱基变成胸腺嘧啶，使得TS基因的表达占到E.coli中总蛋白量的25-30%。综上所述，有大量可变因素可能影响试验结果，如位置效应、稀有密码子的群集和mRNA的二级结构等等。

蛋白质的蛋白酶解

蛋白酶解是一个选择性的、高度调理的过程，该过程参与大量代谢活动。E.coli在细胞质、细胞外周质、内膜和外膜有大量蛋白酶[180，181]。这些蛋白酶参与宿主的代谢活动，如选择性地清除异常和错误折叠的蛋白。到目前为止，蛋白酶解的机制尚未完全明白，但已有一些策略和方法以减少E.coli中异源蛋白的降解。虽然使得蛋白质不稳定的确切结构特点还不明白，但是通过系统研究已经明确了一些蛋白不稳定的决定因素。蛋白酶解途径的“N-末端规则〞在E.coli中能够发挥作用，即蛋白质的稳定性与其氨基端的残基有关[182]。在E.coli中，Ｎ－末端Arg、Lys、Leu、Phe、Tyr和Trp的半衰期为２分钟，而除脯氨酸外的其他氨基酸的半衰期均超过10小时。有研究说明，在多肽的其次位带有较小侧链

的氨基酸有利于甲硫氨酸氨肽酶催化的N-末端甲硫氨酸的去除，从而暴露出位于其次位的亮氨酸，使得该蛋白不稳定[183]。蛋白质的其次个决定因素是位于近氨基端的特异性内源赖氨酸残基[142，143]。该残基是多遍在蛋白链的受体，多遍在蛋白链在真核细胞中有利于遍在蛋白依靠的蛋白酶对蛋白质的降解。好玩儿的是在一个多遍在蛋白中，它的两个决定簇可以位于不同的亚基上，却能靶向同一个蛋白进行加工[184]。氨基酸成分和蛋白质不稳定性的另一个关系表达在PEST假说中[185]。根据对短寿命真核蛋白的统计分析，蛋白质假使富含Pro、Glu、Ser和Thr的区域，且在该区域附近有某些特定的氨基酸，则该蛋白就会不稳定。这些PEST结构域的磷酸化导致钙的结合能力提高，从而利于钙依靠性蛋白酶对蛋白质的降解。这提醒可以在缺乏PEST蛋白裂解系统的E.coli中表达PEST富含蛋白。

减少E.coli中重组蛋白裂解的策略有以下几种：（1）将蛋白质靶向细胞周质或培养基[145，186]；（2）在较低的温度下培养细菌[187]；（3）选用蛋白酶缺陷的菌株[188]；（4）构建N-末端或C-末端融合蛋白[186]；（5）将目的基因多拷贝串联[188]；（6）与分子伴侣共表达[189]；（7）与T4pin基因共表达[190]；（8）替换特定的氨基酸残基以消除蛋白酶裂解位点[191]；（9）改善蛋白质的亲水性[192]；（10）优化培养条件[193]

融合蛋白表达

在E.coli中表达外源蛋白，特别是真核蛋白时，蛋白质的稳定性是经常遇到的问题。最近几年，众多巧妙的蛋白质——融合系统的发展，为E.coli中高效表达和纯化重组蛋白提供了极大便利。融合表达具有多方面的优点：如防止包涵体的形成，促进蛋白质的正确折叠，限制蛋白酶解和利于纯化[159，194]。Uhlen和其同事[195]利用葡萄球菌A蛋白和合成的结构域（Z）开发了一种多功能的融合伴侣，除了能够作为纯化标记外，A蛋白组分还作为一种可溶性伴侣促进蛋白质的折叠，A蛋白信号肽的存在可使表达蛋白分泌到培养基中。另一个融合伴侣是链球菌G蛋白（SPG），它是一种细菌胞壁蛋白，在其氨基端具有分开的白蛋白结合区，在OH端具有免疫球蛋白IgG结合区[196]。最小的白蛋白结合区由来源于SPG的46个氨基酸残基组成，作为亲和纯化标记纯化cDNA编码的蛋白。

假使将A蛋白和SPG结构域联合组成三联融合蛋白，则为纯化提供了更为广泛的选择，可以更进一步防止蛋白酶解。SPG-白蛋白的一个重要应用是其能够稳定哺乳动物外周循环中的短寿命蛋白，这一效应是通过SPG结构域与一种长寿命蛋白——血清白蛋白的结合来介导的[197]。

最近又建立了一种更为繁杂和巧妙的亲和系统[198]。这种多元系统利用了七种不同的亲和标记，从而允许使用多种结合和洗脱条件，为重组蛋白的生产、检测和纯化提供了一个有力的工具。

使用基因融合表达系统在E.coli中表达外源基因已经越来越受欢迎。这在很大程度上归因于融合系统能够产生大量的可溶性的融合蛋白。谷胱甘肽Ｓ－转移酶（GST）、麦芽糖结合蛋白（MBP）以及硫氧还蛋白（Trx）均已经被证明能十分成功地生产正确折叠、有生物活性的蛋白质，能明显提高在E.coli细胞质中产生的融合蛋白的可溶性，并能抑制包涵体的形成[159，194]。其中每一种都备有便利的纯化方法，可将融合蛋白与细胞污染物分开。已经建立了多种对融合蛋白进行位点特异性裂解的方法，方法的选择寻常由特定蛋白的组成、序列及物理性质决定[199]。可采用诸如溴化氰（Met↓）、羟胺（Asn↓Gly）、等试剂或低pH(Asp↓Pro)来进行融合蛋白的化学裂解。化学裂解的方法较低廉而且有效，甚至往往可以在变性的条件下裂解非变性不能溶解的蛋白质。但有时目的蛋白中存在裂解位点，或因发生副反应而导致对蛋白质进行不必要的修饰，从而阻碍了它们的应用。作为一个备选方案，酶解的方法相对来说其反映条件较温柔，更重要的是，普遍用于此用途的蛋白酶都具有高度的特异性。其中常用的酶有：Xa因子、凝血酶、肠激酶、凝乳酶和胶原酶。所有这些酶都具有较长的底物识别序列，从而降低了蛋白质中其他无关部位发生断裂的可能性。在上述提及的各种酶中，Xa因子和肠激酶应用最多，由于它们切割各自的识别序列的羧基端，使带有自然氨基酸的被融合部分得以释放。

分子伴侣目前已经达成共识，有效的蛋白质翻译后折叠、多肽装配成寡聚体结构以及蛋白质的转位都是由一种被称为分子伴侣的专职蛋白来介导的[200]。原核生物的核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶在E.coli中的有效合成和装配需要GroES和GroEL蛋白的证据，使得利用分子伴侣在E.coli中进行基因高效表达成为近来研究的热点[201]。但是，利用分子伴侣所得到的试验结果并不一致，而且迄今为

止，伴侣分子的共表达对基因表达的影响似乎都具有蛋白质特异性[202]。目前尚不明白在基因过度表达的状况下，分子伴侣的体内水平是否受到限制。正常状况下，蛋白质的折叠最终达到一种热力学的稳定状态。特别不稳定的蛋白即使在伴侣分子存在的状况下，或许也不能正确折叠。因此，多肽链的截断、多亚基蛋白复合物单个结构域的产生、缺乏维持蛋白质正常结构的二硫键的形成以及缺乏翻译后的修饰如糖基化等，都将不可能达到热力学的稳定状态。现在已经明白不同类型的伴侣分子正常状况下是协同发挥作用的[203]。因此，只过度表达单一的伴侣分子可能不太有效。在某些状况下，共表达与靶蛋白来源一致的伴侣分子可能是必要的。还有一个需要考虑的变量是培养温度。例如，在30℃时GroES-GroEL共表达能够提高β-半乳糖苷酶的产量，而在37℃或42℃则不能[204]。最终，伴侣分子的共表达有可能导致表型的改变如细菌丝状生长，这有可能对细菌的生存和蛋白质的产生不利[205]。最近有报道说明，将人或鼠的蛋白质二硫键异构酶（PDI）与靶基因共表达，能提高在E.coli细胞质中正确折叠蛋白质的产量[206，207]。E.coli细胞质中二硫键的形成是由维持氧化还原电势的一组蛋白质来促进的[208]。有人认为DsbA（一种可溶性的细胞外周质蛋白）直接催化蛋白质中二硫键的形成，而DsbB（一种内膜蛋白）则参与DsbA的再氧化。真核生物的PDI能够补充dsbA缺失突变株的表型，但其功能在dsbB突变株中完全丧失。另外，通过额外添加谷胱甘肽可以提高PDI加强靶蛋白产生的能力。这些证据说明，PDI有赖于细菌氧还蛋白来完成自身的再氧化[207]。

培养条件

E.coli中的蛋白质产量可以通过高细胞密度培养系统而获得显著提高。高细胞密度培