蛋白质化学-课件

第一章蛋白质化学

蛋白质的生物学意义蛋白质的元素组成蛋白质的氨基酸组成肽蛋白质的结构蛋白质分子结构与功能的关系蛋白质的性质蛋白质的分类蛋白质是由许多不同的α-氨基酸按一定的序列通过酰胺键（肽键）缩合而成的，具有较稳定的构象并具有一定生物功能的大分子。蛋白质的生物学意义1.生物体的组成成分-结构蛋白,胶原蛋白2.酶-生物催化剂3.运输-血红蛋白,肌红蛋白4.运动-肌球蛋白,肌动蛋白5.抗体-免疫球蛋白6.干扰素7.遗传信息的控制8.细胞膜的通透性9.高等动物的记忆、识别机构第二节、蛋白质的氨基酸组成氨基酸

是蛋白质的基本组成单位。从细菌到人类，所有蛋白质都由20种标准氨基酸（20standardaminoacids)组成。（一）氨基酸的结构通式（组成蛋白质的20种）：19种氨基酸具有一级氨基（-NH3+）和羧基（-COOH）结合到α碳原子（Cα），同时结合到（Cα）上的是H原子和各种侧链（R基）；另一个氨基酸Pro具有二级氨基（α-亚氨基酸）不带电形式

H2N—Cα—HCOOHR+H3N—Cα—HCOO-R两性离子形式Cα如是不对称C（除Gly），则：具有两种立体异构体[D-型和L-型]2.具有旋光性[左旋（-）或右旋（+）]（二）氨基酸的分类(蛋白质氨基酸-20种)根据R的化学结构（1）脂肪族氨基酸：

1）疏水性：Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Met、Cys；

2）极性：Arg、Lys、Asp、Glu、Asn、Gln、Ser、Thr（2）芳香族氨基酸：Phe、Tyr（3）杂环氨基酸：Trp、His（4）杂环亚氨基酸：Pro中性氨基酸氨基酸的结构、代号:根据营养分类必需氨基酸：LeuTrpMetLysValIlePheThr半必需：HisArg非必需氨基酸：

两三家来写一本书非蛋白质氨基酸：鸟氨酸瓜氨酸除了常见的20种氨基酸蛋白质中还含有一些稀有氨基酸，大多数是常见氨基酸的衍生物。如5-羟赖氨酸；4-羟脯氨酸；6-N-甲基赖氨酸；γ-氨基谷氨酸等。硒代半胱氨酸

不常见蛋白质氨基酸（三）氨基酸的构型、旋光性和光吸收

构型：组成蛋白质的氨基酸除Gly以外都有手性碳原子，在三维空间上就有两种不同的排列方式，它们互为镜影，这两种不同的构型分别称为D-型和L-型。

旋光性：

组成蛋白质的氨基酸除Gly以外，都有手性碳原子，

所以都有旋光性。能使偏振光的偏振面的向左或向右旋转，向左旋转的称左旋，用“一”号表示，向右旋转的称右旋，用“＋”号表示。

光吸收：

λ=210nm,所有氨基酸都有吸收峰λ=278nm,色氨酸有最大吸收峰（Trp）λ=274.5nm,酪氨酸有最大吸收峰（Tyr）λ=260.0nm,苯丙氨酸有最大吸收峰（Phe）组成蛋白质的氨基酸中，Trp、Tyr和Phe对紫外光有一定的吸收，这是因为它们分子中含有苯环，是苯环的共轭双键造成的（四）氨基酸的重要理化性质一般物理性质无色晶体，熔点极高（200℃以上），不同味道；水中溶解度差别较大（极性和非极性），不溶于有机溶剂。所以可以用乙醇析出氨基酸沉淀。有不同的味感,有的无味,有的味甜(甘氨酸,胱氨酸)有的味苦,有的味鲜(谷氨酸)。

光吸收性质:Tyr,Phe,Trp在紫外区有光吸收.

蛋白质280nm有光吸收紫外检测。两性解离和等电点氨基酸在水溶液中或在晶体状态时都以离子形式存在，在同一个氨基酸分子上带有能放出质子的—NH3+正离子和能接受质子的—COO-负离子，为两性电解质。氨基酸等电点的确定(以甘氨酸为例)根据pK值（该基团在此pH一半解离）计算：等电点等于两性离子两侧pK值的算术平均数。pH=（pK1+pK2）/2pI=（pK1+pK2）/2谷氨酸组氨酸酸性氨基酸，以Asp为例：等电点等于两个酸性解离基团的pK值的算术平均数。碱性氨基酸，以Lys为例：等电点等于两个碱性解离基团的pK值的算术平均数。3.化学性质（1）与茚三酮的反应：Pro产生黄色物质，其它为蓝紫色。在570nm（蓝紫色）或440nm（黄色）定量测定（几μg）。用于对氨基酸的定性和定量（2）与2,4-二硝基氟苯(DNFB)的反应—sanger反应NO2FO2N+HN—CH—COOHRNO2O2NHN—CH—COOHR+HF弱碱性DNP-氨基酸(黄色)测定氨基酸或肽,蛋白质中游离的氨基(α-氨基,ε-氨基)（3）与苯异硫氰酸（酯）的反应(Edman反应)PITCPTC-氨基酸PTH-氨基酸pH8.3重复测定多肽链N端氨基酸排列顺序，设计出“多肽顺序自动分析仪”1．离子交换层析法

原理：分离氨基酸时，用离子交换树脂作为支持物，利用离子交换树脂上的活性基团与溶液中的离子进行交换反应，由于各种离子交换能力不同，与树脂结合的牢固程度就不同，在洗脱过程中，各种离子以不同的速度移动，从而达到分离的目的。

这种分离主要与各种离子所带电荷有关，在电荷相同时，与极性，非极性有关。五氨基酸的分离分析离子交换树脂：化学本质：是一种人工合成的聚苯乙烯一苯二乙烯组成的具有网状结构的高分子聚合物。

基质是由带有电荷的树脂或纤维素组成。带有正电荷的称之阴离子交换树脂；带有负电荷的称之阳离子交换树脂。例题：利用阳离子交换层析分离下列每一对氨基酸，哪一种氨基酸首先被pH7缓冲液从离子交换柱上洗脱出来。（a）Asp和Lys（b）Arg和Met（c）Glu和Val

答：（a）Asp（b）Met（c）Glu

第四节肽（peptide）

（一）肽的结构和命名

肽是由两个或两个以上的氨基酸通过肽键连接而形成的化合物。Peptidebond二肽三肽四肽低于10称寡肽（oligopeptide）多肽（Polypeptide）氨基酸之间通过肽键连接形成的链称肽链。N端氨基酸残基氨基酸残基C端肽链书写方式：N端→C端用“-”表示肽键肽链有链状、环状和分支状。

左右命名：根据氨基酸组成，由N端→C端命名丙氨酰甘氨酰亮氨酸

Ala－Gly－Leu(orAla•Gly•Leu)（1）谷光甘肽（GSH）H2N-CHCH2CH2CO—COOHγ-GluNHCHCO—CH2SHCys2GSHGSSG（2）催产素和升压素

均为9肽，第3位和第9位氨基酸不同。催产素使子宫和乳腺平滑肌收缩，具有催产和促使乳腺排乳作用。升压素促进血管平滑肌收缩，升高血压，减少排尿。NHCH2COOHGly由于肽中N端自由氨基和C端自由羧基之间的距离比氨基酸中的大，因此它们之间的静电引力较弱。肽与氨基酸一样具有酸、碱性质，它的解离主要取决于肽链的末端氨基、末端羧基和侧链R基。1．两性解离与等电点（二）肽的理化性质

肽的等电点定义：肽所带净电荷为“零”时，溶液的pH值。

例：已知末端α-COOH，pK3.6，末端α-NH3+pK8.0ε-NH+3pK10.6。计算Ala-Ala-Lys-Ala的等电点。pI=(8.0＋10.6)/2=9.3pI=1/2(8.0+10.6)=9.3今有一四肽甘氨酰谷氨酰赖氨酰丙氨酸,其pKα-COOH=3.7,pKα-NH2=7.8,pK侧链COOH=4.6,pK侧链NH2=10.2求该四肽的等电点?作业:2．肽的化学性质肽的化学性质与氨基酸相似，如两性解离、等电点等，但肽有与氨基酸不同的特殊反应.（1）双缩脲反应双缩脲＋碱性CuSO4溶液紫色蛋白质分子结构：是指蛋白质分子中所有原子在三维空间中的排布蛋白质结构层次一级结构PrimaryStructure二级结构SecondaryStructure超二级结构SupersecondaryStructure结构域Domain三级结构TertiaryStructure四级结构QuarternaryStructure第五节蛋白质的结构蛋白质的一级结构又称初级结构，二级结构、三级结构、四级结构的三度空间排列称蛋白质的空间结构/高级结构/三维结构或构象。（一）蛋白质的一级结构（化学结构）1、

定义:就是蛋白质分子中氨基酸残基的排列顺序，即氨基酸的线性序列。一级结构中包含的共价键（covalentbonds）：

肽键（peptidebond）二硫键（disulfidebond）HPhe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr–Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-AlaOHB链15710151920212530HGly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Ala-Ser-Val-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-AsnOH15102015A链711621SSSS牛胰岛素的化学结构—S————S——原则：将大化小，逐段分析，制成两套肽片段，找出重叠位点，排出肽的前后位置，最后确定蛋白质的完整序列。2、关于蛋白质一级结构序列的测定问题序列测定前的准备工作：样品的纯度相对分子质量肽链的数目氨基酸组成一级结构的测定主要用小片段重叠的原理（1）末端分析：包括N端分析，C端分析（2）肽链的拆开和分离（3）肽链的部分水解（4）肽段的分离和氨基酸序列测定（5）找重叠肽从而推断整个肽链的氨基酸序列

（1）末端分析：包括N端分析，C端分析1)二硝基氟苯法（DNFB法或FDNB法）2)苯异硫氰酸(酯)法（PITC法/Edman降解法）

3)氨肽酶（aminopeptidase,Apase）法识别氨基端，并从氨基端开始逐个水解N端分析N端氨基封闭的几种情况1.焦谷氨酰环化-焦谷氨酸氨肽酶2.乙酰化3.环状肽C端分析

2)肼解法：也称联氨法

1)羧肽酶（carboxypeptidase,Cpase）法

（2）肽链的拆开和分离共价键(二硫键)非共价键-用变性剂来破坏非共价键,如8mol/L的尿素或6mol/L的盐酸胍

过氧甲酸巯基化合物（3）肽链的部分水解化学方法－－溴化氰（CNBr）裂解法:甲硫氨酸酶解方法氨基酸序列测定:Edman降解法酶解法用测定核酸的顺序来反推蛋白质的顺序是当前很有发展前途的一种方法.（5）找重叠肽从而推断整个肽链的氨基酸序列例子:氨基末端H羧基末端S第二套肽段SEOWTOUVERLAPSHO第一套肽段OUSPSEOVERLAHOWTHOWTOUSEOVERLAPSHOWTOUSEOVERLAPS二硫键位置的确定对角线电泳法

近年来由于DNA序列的测定发展很快，可将相应于蛋白质的DNA序列测定出来后，推出蛋白质的序列，为蛋白质一级结构的测定带来了新的曙光。一级结构测定展望HPhe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr–Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-AlaOHB链15710151920212530HGly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Ala-Ser-Val-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-AsnOH15102015A链711621SSSS牛胰岛素的化学结构—S————S——（二）蛋白质的空间结构（构象、高级结构）

指:蛋白质分子中所有原子在三维空间的排列分布和肽链的走向。构型---在立体异构体中，取代原子或基团在空间的取向构象当单链旋转时，分子中的基团或原子可能形成不同的空间排布，这些不同的空间排列称为不同的构象。

早在20世纪30年代，Pauling和Corey就开始有X-射线衍射方法研究了氨基酸和肽的结构，他们得到了重要的结论:(1)肽键的键长介于C-N单键和双键之间，具有部分双键的性质，不能自由旋转。(2)肽键中的四个原子和它相邻的两个α-碳原子处于同一平面，形成了酰胺平面，也称肽(键)平面。(3)在酰胺平面中C=0与N-H呈反式。Cα—C—N—CαOH—CN—O-H+CαCα多肽链的主链由许多酰胺平面组成，平面之间以α碳原子相隔。而Cα-C键和Cα-N键是单键，可以自由旋转，其中Cα-C键旋转的角度称ψ，Cα-N键旋转的角度称φ。ψ和φ这一对两面角决定了相邻两个酰胺平面的相对位置，也就决定了肽链的构象。1.蛋白质的二级结构——指蛋白质多肽链本身的折叠和盘绕方式，不涉及侧链和整个肽链空间排列。（1）α-螺旋（α-helix）1）螺旋的每圈有3.6个氨基酸，螺旋间距离为0.54nm，每个残基沿轴旋转100°。每个氨基酸残基沿轴上升0.15nm，螺旋上升时，每个残基沿轴旋转100º。2）每个肽键的羰基氧与远在第四个氨基酸氨基上的氢形成氢键（hydrogenbond），氢键的走向平行于螺旋轴，所有肽键都能参与链内氢键的形成。3)α-螺旋有右手螺旋和左手螺旋之分，天然蛋白质绝大部分是右手螺旋，到目前为止仅在嗜热菌蛋白酶中发现了一段左手螺旋。

4)R侧链基团伸向螺旋的外侧。RRRRRRRRR螺旋的横截面影响α-螺旋的稳定性的因素在多肽链中连续的出现带同种电荷的极性氨基酸，α-螺旋就不稳定。●

在多肽链中只要出现pro，α-螺旋就被中断，产生一个弯曲（bend）或结节（kink）。●

Gly的R基太小，难以形成α-螺旋所需的两面角，所以和Pro一样也是螺旋的最大破坏者。●

肽链中连续出现带庞大侧链的氨基酸如Ile，由于空间位阻，也难以形成α-螺旋。●

(2)β-折叠（β-pleatedsheet）也是pauling等人提出来的，它是与α-螺旋完全不同的一种结构。①β-折叠主链骨架以一定的折叠形式形成一个折叠的片层。②在两条相邻的肽链之间形成氢链。β-折叠片中，相邻多肽链平行或反平行（较稳定）。NNCNNCCC平行反平行（3）β-转角（β-turn）为了紧紧折叠成紧密的球蛋白，多肽链常常反转方向，成发夹形状。一个氨基酸的羰基氧以氢键结合到相距的第四个氨基酸的氨基氢上。N—1CH—CC2CHN—HO=C3CHNC—4CH—NRRHOHRROHOβ-转角经常出现在连接反平行β-折叠片的端头。（4）无规卷曲没有一定规律的松散肽链结构。酶的活性部位。2.超二级结构和结构域超二级结构是指若干相邻的二级结构中的构象单元彼此相互作用，形成有规则的，在空间上能辨认的二级结构组合体。是蛋白质二级结构至三级结构层次的一种过渡态构象层次。已知的超二级结构主要有αα,βxβ,β-曲折和β-折叠筒等。

αα：是两个α-螺旋互相缠绕，形成一个左手超螺旋。ββββcββαββαβαβ

结构域是球状蛋白质的折叠单位。多肽链在超二级结构的基础上进一步绕曲折叠成紧密的近似球行的结构，具有部分生物功能。

对于较大的蛋白质分子或亚基，多肽链往往由两个以上结构域缔合而成三级结构。

有时也称功能域，功能域是指有功能的部分。功能域可以是一个结构域，也可以是两个或两个以上的结构域组成。

对那些较小的蛋白质分子来说，结构域和三级结构往往是一个意思，也就是说是单结构域的。一般来说，大的蛋白质分子可以由2个或更多个结构域组成。3.蛋白质的三级结构——涉及到多肽链上的所有原子（包括主链和侧链）在三维空间的分布。

定义:蛋白质的三级结构是指在二级结构，超二级结构，结构域的基础上，多肽链再进一步折叠盘绕成更复杂的空间结构，三级结构主要靠非共价键来维持。下面以鲸肌红蛋白为例，说明蛋白质的三级结构，1963年Kendrew等通过鲸肌红蛋白的x-射线衍射分析，测得了它的空间结构。肌红蛋白是由一条多肽链折叠盘绕成近似球状的构象。(2)主链的80%左右是右手螺旋，其余为无规卷曲，一条多肽链共有8个螺旋区（A、B、C、D、E、F、G、H），7个非螺旋区（二个在末端，中间有五个）。(3)氨基酸残基的亲水基团几乎全部分布在分子的表面，而疏水基团几乎全部在分子的内部。(4)血红素辅基垂直地伸出分子表面，通过一个His残基和分子内部相连。

它对肌红蛋白的生物活性是必需的（与O2结合）。肌红蛋白是1957年由JohnKendrew用X射线晶体分析法测定的有三维结构的第一个蛋白质。4.蛋白质的四级结构——多个亚基（subunit）的空间排布和相互作用。亚基间以非共价键连接。

四级结构是指蛋白质的亚基聚合成大分子蛋白质的方式（亚基是指一条多肽链或以共价链连接在一起的几条多肽链组成的蛋白质分子的最小共价结构单位）。血红蛋白（hemoglobin）是由四个亚基组成，2个α-亚基，2个β-亚基，每个亚基由一条多肽链与一个血红素辅基组成。４个亚基以正四面体的方式排列，彼此之间以非共价键相连（主要是离子键、氢键）

。

说明:一般来说亚基不具有生物活性，即使有也很小，只有当这些亚基聚合成一个完整的蛋白质分子后，才具有生物活性。球状蛋白质的构象特点(1)在球状蛋白质分子中,一条多肽链往往通过一部分α-螺旋，一部分β-折叠，一部分β-转角和无规卷曲等使肽链折叠盘绕成近似球状的构象。(2)球状蛋白质的大多数极性侧链总是暴露在分子表面形成亲水面，而大多数非极性侧链总是埋在分子内部形成疏水核。(3)球状蛋白质的表面往往有内陷的空穴，空穴周围有许多疏水侧链，是疏水区，这空穴往往是酶的活性部位或蛋白质的功能部位。纤维状蛋白质的构象

（1）角蛋白（keratin）α-角蛋白

纤维状蛋白质角蛋白(keratin)

角蛋白可分为两类，一类是α-角蛋白，另一类是β-角蛋白。α-角蛋白是角蛋白中的优势形式。它主要是由α-螺旋构象的多肽链构成的，多肽链大体上与角蛋白的长向平行。一根毛发大纤维沿轴向排列。毛发具有高度有序的结构。毛发性能就决定于α-螺旋结构以及这样的组织方式。

共价键次级键化学键肽键一级结构氢键二硫键二、三、四级结构疏水键盐键范德华力三、四级结构（三）蛋白质分子中的共价键与次级键蛋白质中的疏水基团彼此靠近、聚集以避开水的现象称之疏水相互作用（hydrophobic0interaction）或疏水效应（hydrophobiceffect）。多肽链骨架的羰基和酰胺基之间，特别是在球蛋白内部的那些基团之间常常形成氢键。大多数氢键都是N-H……O类型的范德华力包括吸引力和斥力两种相互作用，范德华力只有当两个非极性残基之间处于一定距离时才能达到最大。虽然范德华力相对来说比较弱，但由于范德华力相互作用数量大，并且具有加和性，因此范德华力对球蛋白的稳定性也有贡献。带有相反电荷的侧链之间的离子相互作用也能帮助稳定球蛋白，虽然这种作用很弱。a离子键b氢键c疏水键d范德华引力六、蛋白质分子结构与功能的关系蛋白质分子具有多样的生物学功能，需要一定的化学结构，还需要一定的空间构象。（一）蛋白质一级结构与功能的关系1.种属差异

蛋白质一级结构的种属差异十分明显，但相同部分氨基酸对蛋白质的功能起决定作用。根据蛋白质结构上的差异，可以断定它们在亲缘关系上的远近。2.分子病——蛋白质分子一级结构的氨基酸排列顺序与正常有所不同的遗传病。从患者红细胞中鉴定出特异的镰刀型或月牙型细胞。镰刀状细胞贫血（sick-cellanemia）患者与正常人的血象比较1954年IngramV等人 指纹图谱（fingerprint）水平为电泳,垂直为层析镰刀状细胞贫血（sick-cellanemia）β-链1234567Hb-AVal-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Lys…Hb-SVal-His-Leu-Thr-Pro-Val-Lys…Val取代Glu含氧-HbAO2O2粘性疏水斑点含氧HbS脱氧HbS疏水位点血红蛋白分子凝集（二）蛋白质构象与功能的关系别（变）构作用：含多亚基的蛋白质由于一个亚基的构象改变而引起其余亚基和整个分子构象、性质和功能发生改变的作用。因别构而产生的效应称别构效应。以血红蛋白（Hb)的结构与功能为例α、β链的三级结构与肌红蛋白的很相似，Hb接近于球体，4个亚基分别在四面体的四个角上，每个亚基上有一个血红素辅基。成人：HbA：α2β298%HbA2：α2δ22%胎儿：HbF：α2γ21.血红蛋白的结构亚基与亚基之间通过非共价键缔和在一起2.血红蛋白中血红素辅基的结构任何亚基吸收氧分子后都会牵动骨架3．血红蛋白与氧的结合(氧合曲线/氧解离曲线)YPO2四个亚基之间具有正协同效应，氧合曲线是S型曲线。开始，氧的结合要比肌红蛋白对氧的结合慢（在脱氧血红蛋白中，亚基之间的连接比较紧密），这种构象不利于O2的结合，而当第一亚基与氧结合后，增加了其余亚基对氧的亲和力。反之，当氧分压降低时，从氧合血红蛋白失去一个氧分子，将引起其余的氧分子更易解离，说明各亚基间存在一种协同效应。TformRform氧合作用显著改变Hb的四级结构，血红素铁的微小移动导致血红蛋白构象的转换（从T态→R态）T态（tensestate）紧张态 R态（relaxedstate）松驰态。血红素中的二价铁原子在与氧结合的前后，并不发生价数的改变总之，各种蛋白质都有特定的空间构象，而特定的空间构象又与它们特定的生物学功能相适应，蛋白质的结构与功能是高度统一的。七、蛋白质的性质（一）蛋白质的相对分子量蛋白质相对分子量在10000~1000000之间。测定分子量的主要方法有渗透压法、超离心法、凝胶过滤法、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。最准确可靠的方法是超离心法（Svedberg于1940年设计）：蛋白质颗粒在强大离心力作用下从溶液中沉降下来。沉降系数（s）：单位（cm）离心场里的沉降速度。沉降系数的单位常用S，1S=1×10-13s牛血清清蛋白沉降系数4.4×10-13s，表示为4.4S。（二）蛋白质的两性电离及等电点蛋白质在其等电点偏酸溶液中带正电荷，在偏碱溶液中带负电荷，在等电点pH时为两性离子。电泳：带电颗粒在电场中移动的现象。分子大小不同的蛋白质所带净电荷密度不同，迁移率即异，在电泳时可以分开。1.自由界面电泳：蛋白质溶于缓冲液中进行电泳。2.区带电泳：将蛋白质溶液点在浸了缓冲液的支持物上进行电泳，不同组分形成带状区域。（1）凝胶电泳：用凝胶（淀粉、琼脂糖、聚丙烯酰胺）作支持物。1）圆盘电泳：玻璃管中进行的凝胶电泳。+—2）平板电泳：铺有凝胶的玻板上进行的电泳。-+（三）蛋白质的胶体性质布郎运动、丁道尔现象、电泳现象，不能透过半透膜，具有吸附能力蛋白质溶液稳定的原因：1）表面形成水膜（水化层）；

2）带相同电荷。一方面由于蛋白质表面的亲水基团会吸引它周围的水分子，使水分子定向排列在它的周围，形成“水化层”。另一方面由于蛋白质在非等电点时带有同种电荷，同种电荷相斥，也使蛋白质分子保持一定的距离而不会聚合。（四）蛋白质的沉淀反应1.盐析：加高浓度中性盐使蛋白质沉淀析出。2.加有机溶剂--乙醇、丙酮等，机理：破坏蛋白质的水化膜。3.加重金属盐--重金属盐加入之后，与带负电的羧基结合。重金属沉淀蛋白质会使蛋白质产生变性，长期从事重金属作业的人应多吃高蛋白食品，以防止重金属离子被机体吸收后造成对机体的损害。在酸性条件下，蛋白质带正电，可以与生物碱试剂的酸根离子结合而产生沉淀。“柿石症”的产生就是由于空腹吃了大量的柿子，柿子中含有大量的单宁酸，使肠胃中的蛋白质凝固变性而成为不能被消化的“柿石”4.加生物碱试剂--单宁酸、苦味酸、钼酸、钨酸、三氯乙酸能沉淀生物碱，称生物碱试剂。

5.加热（五）蛋白质的变性定义：天然蛋白质受物理或化学因素的影响，其共价键不变，但分子内部原有的高度规律性的空间排列发生变化，致使其原有性质发生部分或全部丧失，称为蛋白质的变性。（1）生物活性全部或部分丧失（2）一些侧链基团暴露，可滴定基团增加（3）一些物理化学性质的改变（4）生化性质的改变变性蛋白质的特性

有些蛋白质的变性作用是可逆的，其变性如不超过一定限度，经适当处理后，可重新变为天然蛋白质。－－复性－－变性的可逆性反应名称试剂颜色反应有关基团有此反应的蛋白质或氨基酸双缩脲反应NaOH、CuSO2紫色或粉红色二个以上肽键所有蛋白质米伦反应HgNO3、Hg(NO3)2及HNO3混合物红色

Tyr黄色反应浓HNO3及NH3黄色、橘色

Tyr、Phe乙醛酸反应(Hopking-Cole反应)乙醛酸试剂及浓H2SO4紫色

Trp坂口反应(Sakaguchi反应)α-萘酚、NaClO红色胍基Arg酚试剂反应(Folin-Cioculteu反应)碱性CuSO4及磷钨酸-钼酸蓝色酚基、吲哚基Tyr茚三酮反应茚三酮蓝色自由氨基及羧基α-氨基酸

（六）蛋白质的颜色反应—OHN2、超滤法:是最近几年发展起来的一种新技术，利用分子大小不同，来分离蛋白质。八蛋白质的分离纯化技术1、透析:3、等电点沉淀利用蛋白质在等电点时溶解度最小这一特性，可以调溶液的pH，尽量接近它的等电点，而使蛋白质沉淀。4、盐析法

在蛋白质的抽提液中加入一定量的中性盐，使蛋白质沉淀下来，常用的中性盐为(NH4)2SO4、NH4Cl等。

5、电泳SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS）

SDS（十二烷基硫酸钠）是一种阴离子去污剂，带有很多负电荷，与蛋白质结合以后，蛋白质分子带有足够的负电荷，远远超过了蛋白质分子原有的电荷，蛋白质分子原有的电荷就变得无足轻重了。另外,由于SDS的作用，改变了蛋白质单体分子的形状，均成长椭圆棒状。所以在电场上移动的速度完全取决于蛋白质分子的大小。6、离子交换层析

离子交换层析是根据蛋白质所带电荷的不同进行分离纯化。常用的阳离子交换剂为羧甲基纤维素（CM-C），阴离子交换剂为二乙氨基乙基纤维素（DEAE-C）。7、凝胶过滤也称分子排阻层析、分子筛层析，这是根据蛋白质分子大小不同来分离纯化蛋白质的一种方法。葡聚糖凝胶（商品名Sephadex）

聚丙烯酰胺凝胶(商品名Bio-GelP)琼脂糖凝胶(商品名因生产厂家而不同)常用的凝胶:8、亲和层析这是根据蛋白质能与特异的配体相结合而设计的一种方法。蛋白质＋配体蛋白质配体复合物这种分离纯化方法由于专一性强，理论上可以从复杂的体系中一步提取所需的物质。本章较全面地介绍了蛋白质化学的基本知识，重点阐述了氨基酸和蛋白质的结构、性质和功能间的依存关系。在学习氨基酸的结构时应联系有机化学的羧酸结构，在学习氨基酸的化学性质时应联系氨基酸的结构，再将氨基酸的结构和特性与蛋白质的结构和特性联系起来。认识蛋白质的重要生物学意义。提要某种溶液中含有三种三肽：Tyr-Arg-Ser,Glu-Met-Phe和Asp-Pro-Lys,α-COOH基团的pKa为3.8;α-NH3基团的pKa为8.5。在哪种pH（2.0,6.0或13.0）下，通过电泳分离这三种多肽的效果最好？答：pH=6.0比pH=2.0或pH=13.0时电泳能提供更好的分辨率。因为在pH＝6.0的条件下每种肽都带有不同的净电荷(+1，-1，和0)，而在pH＝2.0的条件下净电荷分别为+2，+1和+2，在pH＝13.0的条件下净电荷分别为-2，-2和-2。下列试剂和酶常用于蛋白质化学的研究中：

CNBr;异硫氰酸苯酯;丹黄酰氯；脲;6mol/LHCl;β-巯基乙醇;水合茚三酮;过甲酸;胰蛋白酶;胰凝乳蛋白酶。

其中哪一个最适合完成以下各项任务？

（a）测定小肽的氨基酸序列。

（b）鉴定肽的氨基末端残基。

（c）不含二硫键的蛋白质的可逆变性。若有二硫键存在时还需加什么试剂？

（d）在芳香族氨基酸残基羧基侧水解肽键。

（e）在蛋氨酸残基羧基侧水解肽键。

（f）在赖氨酸和精氨酸残基侧水解肽键。答：（a）异硫氰酸苯酯。（b）丹黄酰氯。（c）脲；β-巯基乙醇还原二硫键。（d）胰凝乳蛋白酶。（e）CNBr。（f）胰蛋白酶1、在寡聚蛋白质中，亚基间的立体排布、相互作用以及接触部位间的空间结构称之谓()

A、三级结构

B、缔合现象

C、四级结构

D、变构现象2、形成稳定的肽链空间结构，非常重要的一点是肽键中的四个原子以及和它相邻的两个α-碳原子处于()

A、不断绕动状