浙江大学生物化学甲实验实验6酶的基本性质实验-底物专一性、激活剂和抑制剂、最适温度2课件

实验七

用正交法测定几种因素对蔗糖酶活性的影响（半自主性设计实验）一、实验目的和要求

1.初步掌握正交试验设计法的使用。2.运用正交法测定底物浓度、酶浓度、温度和pH值这四种因素对酶活力的影响。二、实验基本原理酶的催化作用是在一定条件下进行的，它受多种因素的影响，如酶浓度、底物浓度、温度、pH值、抑制剂和激活剂等都能影响酶催化的反应速度。通常在其他因素恒定的条件下，通过某一因素在一系列变化条件下的酶活性测定求得该因素的影响，这是单因素的试验方法。对于多因素的试验可以通过正交试验设计法来完成。正交法是借助于正交表，简化的表格计算，正确分析结果，找到实验的最佳条件，分清因素的主次，这样就可以通过比较少的实验次数达到好的实验效果。实践证明正交法是一个多、快、好、省的方法。目前已广泛用于工农业生产和科学实验中。本实验运用正交法测定底物浓度、酶浓度、温度、pH值这四个因素对酶活性的影响，并求得在什么样的底物浓度、酶浓度、温度和pH值时酶的活性最大。三、实验材料与试剂1、实验材料纯化的蔗糖酶（样品Ⅳ）2、实验试剂⑴5%蔗糖（A.R.）溶液（W/V）；⑵0.2mol/L乙酸缓冲液，pH3.6、4.6、5.6；⑶3,5－二硝基水杨酸试剂；甲液：溶解6.9g结晶酚于15.2ml10％NaOH溶液中，并用水稀释至69ml,在此溶液中加6.9g亚硫酸氢钠。乙液：称取255克酒石酸钾钠加到300ml10%NaOH溶液中，再加入800ml1%3,5-二硝基水杨酸溶液.甲,乙二溶液相混合即得黄色试剂,贮于棕色瓶中备用,在室温放置7-10天以后使用。四、实验器材与仪器1.试管及试管架；2.吸量管；3.恒温水浴箱（37℃、50℃、65℃、100℃）；4．可见光分光光度计。⑵、选择合适的正交表

合适的正交表，是指要考察的因素的自由度总和，应该不大于所选正交表的总自由度。正交表Ln（tq）L——正交表的代号n——处理数（试验次数）t——水平数q——因素数试验次数n=q(t–1)+1=4（3－1）+1＝9总自由度V总=n-1各列自由度V列=K（该列水平数）–1例如本实验选用四个因素，每个因素选三个水平，四个因素各占一列，那么四个因素的自由度分别为：V1=3–1=2，V2=3–1=2，V3=3–1=2，V4=3–1=2。四个因素的自由度总和=V1+V2+V3+V4=8因为各因素自由度总和是8，它没有超过L9（34）的总自由度=9–1=8。所以选择正交表L9（34）是适合的。3.在所选的正交表上进行表头设计由于本实验是一项四因素各三水平的试验，这样将四个因素依次放在L9（34）的第1，2，3，4列上，这项把因素放入正交表头的工作，叫做表头设计。见表2。正交表都应具有以下两个特性：（1）在每一列中，各水平出现的次数相等。即在任何一列中，数字1和数字2和数字3都出现三次（几个水平就均出现几次）。（2）任何两列中，横行组成的数对出现次数相等，均出现一次（这里有9个不同的数对，均出现一次）（1，1）、（1，2）、（1，3）、（2，1）、（2，2）、（2，3）、（3，1）、（3，2）、（3，3），各出现一次。以上这些特点保证了用正交表安排的试验计划是均衡搭配的，因此分析数据比较方便，可进行综合比较，结果比较可靠。在所选的正交表上进行表头设计，见表2。

水平因素实验号1[S]2[E]3温度4pH111112122231333421235223162312731328321393321L9表表2表头设计2、试验安排将本实验的四个因素依次填入L9表的因素1，2，3，4中；再将各列的水平数用该列因素相应的水平写出来，便可得到下面的试验安排表（表3）。表中试验号共9个，表示要做9次试验，每次试验的条件如每一纵行所示。如做第一个试验时[S]是0.5ml，[E]是1.0mL，温度50℃，pH为3.6。第二个试验[S]是0.5ml，[E]是0.6mL，温度37℃，pH为5.6，余类推。六、试验结果及分析实验做好后，把9个数据填入表4试验结果栏内，按表中数据计算出各因素的一水平试验结果总和、二水平试验结果总和、三水平试验结果总和，再取平均值（各自被3除）。最后计算极差。极差是指这一列中最好与最坏的之差，从极差的大小就可以看出那个因素对酶活力影响最大，那个影响最小。找出任何条件下酶活力最高。最后作一直观分析的结论。以OD值为纵座标，因素的水平数为横座标作图。实验的典型结果与异常分析

试验确定的最佳条件与理论很吻合。如出现与理论明显不一致的现象可能是试验过程中如加样及时间控制等出现较大误差所致。水平因素实验号1[S](ml)2[E](ml)3温度(℃)4pH值试验结果A520110.511.015013.6210.520.623725.6310.530.236534.6420.211.023734.6520.220.636513.6620.230.215025.6730.811.036525.6830.820.615034.6930.830.223713.6Ⅰ(一水平试验结果总和)Ⅱ(二水平试验结果总和)Ⅲ(三水平试验结果总和)Ⅰ/3Ⅱ/3