天津大学,生物化学,第十二章4-5节-1课件

第四节RNA的生物合成一、DNA指导下的RNA合成－转录二、RNA指导下的RNA合成－RNA复制三、RNA指导下的DNA合成－逆转录一、DNA指导下的RNA合成－转录1转录：在DNA指导下RNA的合成。此过程包括RNA链的起始、延伸、终止等步骤。转录要涉及两方面：一是RNA合成的酶学过程；二是RNA合成的起始信号和终止信号。模板链：转录的模板DNA链，也叫反义链或负链。编码链：与模板链对应的链，也叫有义链或正链。转录的起始是由DNA的启动子（promter）区控制的，而控制终止的部位则称为终止子(ferminafor)。一、DNA指导下的RNA合成－转录2（一）大肠杆菌RNA聚合酶（二）RNA聚合酶催化的转录过程（三）RNA的转录后加工（一）大肠杆菌RNA聚合酶1ACPTPCPGAPP-P-POH5’3’CPGPPPPOHUDNA指导下的RNA合成（二）RNA聚合酶催化的转录过程1．RNA聚合酶与模板DNA结合2．起始3．延伸4．终止1．RNA聚合酶与模板DNA结合1RNA聚合酶结合到模板DNA的特定位置上1．RNA聚合酶与模板DNA结合2这一特定部位有RNA聚合作用的起动基因，即启动子TTGACAAACTGTTATAATATATTA－35（识别位）－10（Pribnow框）＋1起始部位DNA5’3’原核生物启动子结构2．起始1磷酸二酯键的形成12．起始2ACPTPCPGAPP-P-POH5’3’CPGPPPPOHU磷酸二酯键的形成23．延伸2延长阶段2解链区到达基因终端4．终止1终止阶段1RNA和RNA聚合酶从DNA上脱落4．终止2终止阶段2：原核生物转录中止信号及产物AGCCCGCTCGGGCGGCGGGCTCGCCCGATTTTTTTTAAAAAAAA反义链有义链DNAAAAAAAAATTTTTTTTUUUUUUUCGGGCGGCCCGCA5’反义链有义链DNARNA产物（三）RNA的转录后加工在细胞内，由RNA聚合酶合成的原初转录物往往需要经过一系列的变化，包括链的裂解、5’端与3’端的切除和特殊结构的形成，碱基修饰和糖苷键的改变，以及拼接等过程。使其能转变为成熟的RNA分子，此过程总称为RNA的成熟或转录后加工。（三）RNA的转录后加工1．原核生物RNA的转录后加工2．真核细胞RNA的转录后加工1．原核生物RNA转录后加工1（mRNA）原核生物的mRNA大多不需加工，一经转录即可直接进行翻译。1．原核细胞RNA转录后加工2（rRNA2）P16SP23SP5S16S23S5S细菌rRNA的形成1．原核生物RNA转录后加工3（tRNA1）大肠杆菌染色体基因组共有tRNA基因约60个，这个数字远大于按变偶假说所要求的反密码子数。即：某些反密码子可能不只一个tRNA分子，或某些tRNA基因不是一个拷贝。tRNA基因大多成簇存在。tRNA转录时首先成为tRNA前体。1．原核生物RNA转录后加工3（tRNA2）5’ppp转录tRNA前体tRNAOH3’5’pppOH3’OH3’+核苷酸降解产物降解至单核苷酸p成熟的tRNAU→φG→m2GA→i6A等修饰tRNA的形成2．真核生物RNA转录后加工2（rRNA2）18S5.8S28S45S甲基化作用核酸内切酶18SRNA5.8SRNA28SRNA真核生物rRNA前体的加工2．真核生物RNA转录后加工3（rRNA3）真核生物rRNA的生成与成熟45S5S41S→32S5S20S32S5S细胞核核仁细胞质28S5.8S18S5S28S5.8S18S核蛋白体2．真核生物RNA转录后加工6（mRNA1）①两者都为不均一分子②两者碱基组成上有部分相似③两者3’末端都有多聚腺苷酸尾部；5’端连接有GMTP（7-甲基鸟苷）的帽子（1）细胞核中的不均一核RNA（HnRNA）可能是mRNA的前体,因为：2．真核生物RNA转录后加工7（mRNA2）①5’端形成特殊的帽子结构（M7G5’PPP5’NmpNp-）②在链的3’端切断并加上多聚腺苷酸（polyA）尾巴③通过拼接除去由内含子转录来的序列④链内部核苷被甲基化（2）HnRNA转变成mRNA的加工过程：2．真核生物RNA转录后加工8（mRNA3）卵清蛋白基因产生mRNA的过程：转录1234567ABCDEFG卵清蛋白基因(7700个核苷酸)1234567ABCDEFGLL5’3’加帽子和尾巴1234567ABCDEFGL5’3’内含子RNA的除去和拼接作用1234567LCAPPolyA尾成熟的mRNA1872个核苷酸2．真核生物RNA转录后加工9（mRNA4）2．真核生物RNA转录后加工10

（帽子结构形成过程）GTPPipppN1N2N3…G5’ppp5’N1N2N3…pppN1N2N3…RNA三磷酸酶PiimRNA鸟苷酸转移酶S-腺苷甲硫氨酸m7G5’ppp5’N1N2N3…S-腺苷高半胱氨酸mRNA(鸟嘌呤-7-)甲基转移酶mRNA(核苷-2’-)甲基转移酶S-腺苷甲硫氨酸S-腺苷高半胱氨酸m7G5’ppp5’N1

mN2N3…S-腺苷甲硫氨酸S-腺苷高半胱氨酸m7G5’ppp5’N1

mN2mN3…mRNA(核苷-2’-)甲基转移酶二、RNA指导下的RNA合成－RNA复制病毒正链（具mRNA功能）pppG5’3’OH5’5’pp3’OH复制中间体5’3’3’新合成的负链病毒正链为模板复制酶5’三、依靠反转录的DNA生物合成11970年Temin和Baltimore同时分别从致癌RNA病毒中发现RNA指导的DNA聚合酶。由于它催化遗传信息从RNA流向DNA，与转录作用正好相反，故称为反转录酶或逆转录酶。病毒感染细胞后，通过逆转录酶生成与病毒RNA碱基序列互补的DNA，并整合到宿主细胞的染色体DNA中。此后，在宿主细胞内，这段插入的DNA经转录生成相应的mRNA，再转译成病毒专一的蛋白质。三、依靠反转录的DNA生物合成2RNA3’5’依赖于RNA的DNA聚合酶RNA3’5’核糖核酸酶H5’3’5’3’cDNA依赖DNA的DNA聚合酶cDNA杂种分子3’5’5’3’双链DNA新合成的双链DNA整合到寄主染色体DNA中第五节基因的重组与DNA“克隆”DNA重组技术是指将不同的DNA片段按人们的设计方案定向地连接起来，并在特定的受体细胞中，与载体一起得到复制与表达，使受体细胞获得新的遗传特性。从某种意义上来说，DNA重组技术也可理解为基因工程，也是使生物基因结构得到改造的技术。第五节基因的重组与DNA“克隆”2一、DNA重组技术的用途

二、重组中所用的酶和载体三、重组的大致步骤一、DNA重组技术的用途1．利用DNA重组技术大量生产一些在正常组织代谢中产量很低的多肽物质，如多肽激素、多肽抗生素、酶类、抗体及各种肽类。2．定向地改造生物基因组结构，使其具有的某些有经济价值的功能得以成百倍地提高。3．将DNA重组技术应用于基础研究。如在基因组结构及基因组功能调节的研究。二、重组中的酶及载体（一）DNA体外重组中常用的酶

（二）载体（一）DNA体外重组中常用的酶1

1．限制性内切酶2．T4DNA连接酶3．大肠杆菌DNA聚合酶I4．大肠杆菌DNA聚合酶大片段（klenow片段）5．T4DNA聚合酶6．T4多核苷酸激酶7．反转录酶8．细菌碱性磷酯酶9．核酸酶S110．脱氧核糖核酸酶I11．polyA聚合酶（一）DNA体外重组中常用的酶2

由同一个限制性内切酶切断得到的任何两个DNA片段的粘性末端都可以互相配对，然后每条DNA链的断开部分再通过DNA连接酶所产生的磷酸二酯键连接起来。1.限制性内切酶1（一）DNA体外重组中常用的酶2

1.限制性内切酶2

酶（产生平头末端）限制和修饰部位来源

HindII5’-G-T-Py-Pu-A-C-3’3’-C-A-Pu-Py-T-G-5’流感嗜血菌

HindI5’-G-T-T-A-A-C-3’3’-C-A-A-T-T-G-5’副流感嗜血菌**（一）DNA体外重组中常用的酶2

酶（产生粘性末端）限制和修饰部位来源

EcoRI5’-G-A-A-T-T-C-3’3’-C-T-T-A-A-G-5’流感嗜血菌EcoRII5’-N-C-C-N-G-G-N-3’3’-N-G-G-N-C-C-N-5’大肠杆菌EcoRIII5’-A-A-G-C-T-T-3’3’-T-T-C-G-A-A-5’流感嗜血菌******（一）DNA体外重组中常用的酶2

1.限制性内切酶3（一）DNA体外重组中常用的酶3

2．T4DNA连接酶：是从噬菌体T4感染过的大肠杆菌中分离出来的。此酶由一条肽链组成，分子量6800，催化DNA上的3’-OH与5’-P末端之间的磷酸二酯键的形成，既可催化粘性末端又可催化平头末端间的连接。催化过程需ATP和Mg2+3．大肠杆菌DNA聚合酶I：5’-3’聚合酶活力4．大肠杆菌DNA聚合酶大片段（klenow片段）：将大肠杆菌DNA聚合酶用枯草杆菌素来降解，形成的产物中有一个分子量为76,000的多肽，即为此酶。它失去了5’-3’外切酶活力，其它功能与DNA聚合酶相同，此酶用途很广。（一）DNA体外重组中常用的酶4

5．T4DNA聚合酶：它存在于噬菌体T4中，与klenow片段相似，5’-3’聚合酶活力比大肠杆菌DNA酶多200倍。6．T4多核苷酸激酶：此酶是从T4感染过的大肠杆菌中分离出来的，它催化ATP上的γ-P转移到DNA或RNA的5’-OH上，所以可用来标记DNA或RNA。7．反转录酶：合成cDNA的第一条链，具有5’-3’DNA聚合酶活力。（一）DNA体外重组中常用的酶5

8．细菌碱性磷酯酶：十分耐热，可将DNA或RNA的5’-P除去，反应常在600C以上进行，以抑制反应中其他内切酶。9．核酸酶S1：催化单链DNA降解，产生5’-P结尾的单核苷酸或寡核苷酸，用以切除双链cDNA上的发夹形结构上的单链凸环。10．脱氧核糖核酸酶I：是一种内切酶，降解双链或单链DNA，产生以5’-P结尾的单核苷酸及寡核苷酸的混合物。11．polyA聚合酶：催化将AMP加到RNA的3’-OH末端，形成3’-polyA的反应。（二）载体（总）

1．定义2．载体必须具备的条件

3．目前常用的载体1．定义

外源DNA片段要进入受体细胞，并在其中进行复制与表达，必须有一个适当的运载工具将其带入细胞内，并载着外源DNA一起进行复制与表达，这种运载工具称为载体。2．载体必须具备如下条件

（1）在受体细胞中，可以独立进行复制，所以其本身必须是一个复制单位，而且插入外源DNA后不会影响其本身的复制能力。（2）易于鉴定、筛选。即易将带有外源DNA的重组体与正常的载体区别开。（3）易于引入受体细胞。3．目前常用的载体1（总）

（1）质粒：是比较小的双链DNA环形分子，在细菌和酵母中都存在。（2）噬菌体：包括λ噬菌体、装配型质粒（λ噬菌体改造）及M13噬菌体（是一种含有单链DNA的噬菌体）。3．目前常用的载体1（总）

3．目前常用的载体2（λ噬菌体为载体）

λDNA用限制酶除去中间一段太小不能被包装与外源DNA连接重组DNA分子的体外包装带有外源DNA的λ噬菌体三、重组的步骤1（1）外源DNA与载体的连接，形成重组DNA（2）通过转化（或感染）将重组DNA引入受体细胞（3）筛选出含有重组体的阳性克隆三、重组的步骤1DNA与载体相连接简明P235图12－13、12－14载体外源基因三、重组的步骤2转化与筛选含有不同插入DNA片断的质粒细菌细胞转化并置于有抗生素的介质带有抗药性质粒的细菌才生长鉴定携有DNA片断克隆的的菌落，并扩大培养质粒DNA纯化三、DNA表达的一般步骤11．目的基因的取得2．外源DNA与载体的连接，形成重组DNA3．将重组DNA引入受体细胞4．重组体的筛选5．表达三、DNA表达的一般步骤2待插入的外源DNA质粒载体＋连接重组体DNA经转化作用或病毒感染引入宿主细胞宿主染色体筛选出具有重组体DNA的细胞克隆DNA重组体的构建和克隆1．目的基因的取得－分离法、合成法（1）DNA片段的直接提取（2）用噬菌体或质粒从宿主细胞中将目的基因携出（3）使用相应的mRNA分离基因2．外源DNA与载体连接形成重组DNA1（1）粘性末端连接（2）平头末端连接（3）在DNA片断末端加上均聚寡核苷酸后连接，在3’-OH端由末端核苷酸转移酶添加单核苷酸的反应（4）用接头连接：适用于粘端与平端DNA之间的连接外源DNA与载体的DNA之间的连接方式：2．外源DNA与载体连接形成重组DNA2（1）粘性末端连接TGCATGCAACGTGCATE.coli质粒限制酶TGCAACGTTGCAACGT限制酶ACGTGCATGCAT混合、退火DNA连接酶连接重组体DNATGCATGCATGCATGCA2．外源DNA与载体连接形成重组DNA3（2）平头末端连接＋T4DNA连接酶（DNA浓度低）T4DNA连接酶（DNA浓度很高）T4DNA连接酶（DNA浓度低）2．外源DNA与载体连接形成重组DNA4（3