氨基糖苷类与四环素类抗生素

氨基糖苷类与四环素类抗生素第1页/共89页氨基糖苷类抗生素氨基糖苷类抗生素的结构特点

本类药物结构中都有以氨基环己醇与氨基糖缩合而成的苷，结构中没有共轭双键所以没有可供分析用的特征的紫外吸收仅有末端吸收，结构中具有不对称碳原子有旋光性。第2页/共89页结构特点第3页/共89页氨基糖苷类抗生素一般均含有两个或多个氨基糖，通过糖苷键与氨基环醇相连接结构特点第4页/共89页分类一,微生物次级代谢产物产生:多组分由链霉菌(streptomyces)产生的抗生素，如链霉素、新霉素、巴龙霉素、卡那霉素、卡那霉素B等；由小单孢菌(Micromonosporae)产生的抗生素，如庆大霉素、西索米星、小诺霉素等；第5页/共89页

分类二.经化学结构修饰得到的半合成制成的一类

阿米卡星、奈替米星、依替米星等第6页/共89页分类按抗菌特点、结构特点及发现或合成先后次序，可分为3个发展阶段，通常称三代第一代氨基糖苷类抗生素

以卡那霉素为代表，其结构特点是完全羟基化的氨基糖与氨基环醇相结合，不抗铜绿假单胞菌，该类品种还有新霉素、巴龙霉素、链霉素和核糖霉素等，除链霉素、新霉素外，其余均已少用；第7页/共89页分类第二代氨基糖苷类抗生素以庆大霉素为代表，其结构中均含有脱氧氨基糖，具有抗铜绿假单胞菌的特点，其他常用品种还有妥布霉素、西索米星和小诺霉素等，此类药物抗菌谱更广,对第一代品种无效的假单孢菌和部分耐药菌也有较强的抑杀作用。第8页/共89页

分类第三代氨基糖苷类抗生素以奈替米星为代表，均为氨基环醇上氮位取代衍生物，常见品种还有阿米卡星、阿贝卡星、阿司米星和由我国自主研发的新药依替米星等；其特点是保留了母体的抗菌活性，但耳肾毒性减小，抗耐药性增强等第9页/共89页氨基糖苷类抗生素的理化特性

氨基糖苷类抗生素的分子量较小，一般在300～800amu之间，由于其来源于微生物发酵或半合成，大多数为多组分复合物，故无特征性熔点，大多呈白色或类白色粉末状。由于都含有易溶于水的氨基糖碱性苷，故均能以分子中的碱性基团（-NH2基）与无机酸结合成可溶于水、但几乎不溶于有机溶剂的盐类，本类抗生素相对其他类抗生素而言稳定性较好，制剂主要为注射液。第10页/共89页2010品种收载情况14个原料,妥布霉素,硫酸小诺霉素,硫酸巴龙霉素,硫酸卡那霉素,硫酸西索霉素,硫酸庆大霉素,硫酸阿米卡星,阿米卡星,硫酸奈替米星,硫酸依替米星,硫酸核糖霉素,硫酸链霉素,硫酸新霉素,盐酸大观霉素;9个注射液,4个滴眼液(其中新增1个妥布霉素滴眼液),4个片剂,口服液,缓释片,颗粒各1个,第11页/共89页品种收载情况

原料制剂注射液注射用滴眼液口服液片缓释片颗粒妥布霉素√√*硫酸小诺霉素√√√硫酸巴龙霉素√硫酸卡那霉素√√√硫酸西索霉素√硫酸庆大霉素√√√√√硫酸阿米卡星√√阿米卡星√硫酸奈替米星√硫酸依替米星√√硫酸核糖霉素√硫酸链霉素√硫酸新霉素√√盐酸大观霉素√总计149641411*为新增品种第12页/共89页2010版关键检测项目方法一览：

原料有关物质（包括特定杂质）组分硫酸盐含量测定TLCHPLC-ELSDHPLC-UVHPLC-ELSDHPLC-ELSD滴定妥布霉素√微生物（Ⅰ、Ⅱ）硫酸小诺霉素√√微生物（Ⅰ、Ⅱ）硫酸巴龙霉素√无微生物（Ⅰ、Ⅱ）硫酸卡那霉素卡B√HPLC-ELSD硫酸西索霉素√√微生物（Ⅰ、Ⅱ）硫酸庆大霉素√√√微生物（Ⅰ、Ⅱ）硫酸阿米卡星√√HPLC-UV阿米卡星√HPLC-UV硫酸奈替米星√√微生物（Ⅰ、Ⅱ）硫酸依替米星√√HPLC-ELSD硫酸核糖霉素√微Ⅰ硫酸链霉素√√微生物（Ⅰ、Ⅱ）硫酸新霉素新霉胺√微生物（Ⅰ）盐酸大观霉素√微生物（Ⅱ）第13页/共89页增修订情况概要第14页/共89页分子式与分子结构

硫酸庆大霉素BP\EP收载了5个组分，分别是庆大霉素C1、C1a、C2、C2a和庆大霉素C2b。CHP2005没有规定分子式庆大霉素C组分控制C1、C1a、C2和C2a的量，起草发现硫酸庆大霉素原料中除了规定的四个组分峰以外，还存在小诺霉素和西索米星两个较大的组分第15页/共89页含量限度

由于有些品种含量测定方法改变由微生物检定法修改为HPLC,含量单位由效价单位改为百分含量.如阿米卡星2005版含量限度每1mg不得少于910单位,2010版改为95.0%-102.0%,在限度单位修改的同时,下限提高了4%.(BP:96.5％～102.0％；对阿米卡星的含量限度规定为)第16页/共89页

含量限度

2005版硫酸阿米卡星含量限度为每1mg的效价不得少于690阿米卡星单位(n=1.8)或不得少于674阿米卡星单位(n=2)。

2010版修改为含阿米卡星(C22H43N5O13)应为73.0%-78.4%(N=1.8)

或71.1%-76.4%(N=2)

下限提高

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鉴别

一般采用TLC法与硫酸盐反应，含量测定或组分采用HPLC-ELSD的方法时也采用HPLC作为鉴别，个别品种也有用IR作为鉴别反应，少数品种采显色反应鉴别。在鉴别试验中提供TLC和HPLC两个色谱鉴别项，可根据实验室条件任选其中之一，便于灵活操作。第18页/共89页举例:组合鉴别1.硫酸依替米星

【鉴别】（1）TLC

（2）HPLC

（3）硫酸盐鉴别反应。以上（1）、（2）两项可选做一项。第19页/共89页举例:组合鉴别例2.硫酸阿米卡星

【鉴别】（1）TLC

（2）HPLC

（3）IR

（4）硫酸盐鉴别反应。以上（1）、（2）两项可选做一项。第20页/共89页检查

供无菌分装的原料标准正文中增加了:(1)可见异物

(2)无菌

(3)不溶性微粒第21页/共89页例1.硫酸阿米卡星无菌取本品，加0.9％无菌氯化钠溶液制成每1ml中含阿米卡星8mg的供试液，经薄膜过滤法处理，用pH7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液分次冲洗（每膜不少于500ml），以金黄色葡萄球菌为阳性对照菌，依法检查（附录XIH），应符合规定。（供注射用）。第22页/共89页例1.硫酸阿米卡星可见异物

取本品5份，各0.6g，分别加微粒检查用水5ml使溶解，依法检查（附录IXH），应符合规定。（供注射用）不溶性微粒取本品3g，加微粒检查用水100ml，制成每1ml中含30mg的溶液，依法检查（附录IXC）。每1g供试品中，含10μm以上的微粒不得过6000粒，含25μm以上的微粒不得过600粒。（供注射用）第23页/共89页渗透压摩尔浓度

05版药典首先在抗生素类滴眼液硫酸卡那霉素滴眼液标准中列入渗透压检查，10版本类药将其扩大为4个滴眼液，两种表示方法并列:妥布霉素滴眼液、庆大霉素滴眼液和硫酸卡那霉素滴眼液（均为渗透压摩尔浓度为260-320mOsmol/kg）硫酸新霉素滴眼液（渗透压摩尔浓度比为0.95-1.15）。第24页/共89页

防腐剂本版药典对氨基糖苷类抗生素滴眼液中常用防腐剂如羟苯乙酯、羟苯丙酯、苯扎氯胺等进行检查,限度参照USP制定为80%-120%第25页/共89页防腐剂例1.硫酸新霉素滴眼液检查羟苯乙酯方法为HPLC（限度：80%-120%）例2.妥布霉素滴眼液检查羟苯乙酯、羟苯丙酯、苯扎氯铵，方法为HPLC（限度：同上）例3.庆大霉素滴眼液

检查羟苯乙酯、羟苯丙酯、苯扎氯铵，方法为HPLC（限度：同上）卡那霉素未检查防腐剂第26页/共89页有关物质、组分

有关物质、组分、特定杂质检查方法修改较大，绝大部分采用HPLC法控制,但有些品种如新霉素、盐酸大观霉素由于时间关系,没有充分验证，仍采2005版方法用TLC法。第27页/共89页HPLC-ELSD方法扩大应用05版药典除硫酸卡那霉素，硫酸庆大霉素两个原料及其制剂共4个品种的组分、特定杂质检查方法为HPLC-ELSD方法，2010版药典有7个原料及其制剂共23品种采用HPLC-ELSD方法检查有关物质、组分、特定杂质。第28页/共89页HPLC-ELSD方法扩大应用组分测定小诺霉素,巴龙霉素,庆大霉素有关物质妥布霉素,卡那霉素,西索霉素,庆大霉素,奈替米星,依替米星,核糖霉素,

链霉素第29页/共89页注意1、方法建立的背景：1)2005年版药典TLC测定有关物质，属于半定量方法，只能对杂质进行限度检查，不能准确测定样品中单个杂质和总杂质量，2)氨基糖苷类只有紫外末端吸收，不能采用紫外检测器，3)已有柱前衍生化、电化脉冲安培电化学检测器检测等文献报道，操作复杂,重现性不好。第30页/共89页注意2,与方法相关的条件和参数：

流动相：氨基糖苷类抗生素分子结构中含有多个氨基和羟基，极性很大，在C18柱上不保留，可通过与挥发性酸形成离子对或采用碱性流动相使氨基糖苷类抗生素游离成碱,降低极性以增加在色谱柱上的保留第31页/共89页例1依替米星

酸性条件下(0.2mol/L三氟乙酸溶液-甲醇(84:16)为流动相)，峰形均佳，硫酸根峰、依替米星峰、奈替米星及其他有关物质峰均能完全分离，依替米星与主要其中间体、酸、碱、热、氧化降解产物也均能有效分离，第32页/共89页硫酸依替米星含量和有关物质测定用系统适用性试验色谱分离图1.硫酸根；2.奈替米星;3.依替米星

硫酸依替米星有关物质测定典型的色谱分离图第33页/共89页实验中应注意以下几个方面

(1)、色谱柱：需要使用耐酸性条件的色谱柱(流动相的pH在1左右)，现在商品化的耐酸或宽pH范围的色谱柱较多，实验中曾使用过下列规格的色谱柱：AngilentZORBAXSBC18(4.6*250mm，5μm)，AngilentZORBAXSBC18(4.6*150mm，3.5μm)，PhenomenexGeminicNXC18(4.6*150mm，5μm)，均可满足实验要求，但3.5μm粒径的色谱柱有更高的灵敏度和良好的分离效果第34页/共89页实验中应注意以下几个方面

(2)、检测器：检测器的灵敏度影响有关物质测定结果，现今国内主流的几款ELSD检测器如Alltech2000(不分流型)，SEDEX75(分流型)等，在合适的色谱条件下，对常见的氨基糖苷类抗生素定量检测限均能达到10μg/ml左右，实验中考察了Softa300S及Alltech500等型号的检测器，灵敏度无法满足检测要求，在实验中要加以注意。第35页/共89页实验中应注意以下几个方面

(3)、杂质对照品：目前还无法提供杂质对照品，有关物质测定时仍采用自身对照法，即采用含量测定用的依替米星对照品测定有关物质，各杂质与依替米星之间的校正因子还无具体数据。第36页/共89页实验中应注意以下几个方面（4）计算方法：响应值(峰面积)与对应的质量呈对数线性关系，实验中需要配制不同浓度依替米星对照品制备随行双对数标准曲线，三点浓度进行，并且回归系数值要求不小于0.99，尽管有人认为要求较低，但验证结果显示，该计算方法可以满足要求，按外标法计算，需要先分别计算出各单个杂质的量再相加，第37页/共89页例2庆大霉素C组分、及有关物质庆大霉素C组分

色谱条件C18柱（pH值适应范围0.8～8.0）；以0.2mol/L三氟醋酸－甲醇（92：8）为流动相；蒸发光散射检测器（参考条件：漂移管温度110℃，载气流量为每分钟2.8L），限度不变。第38页/共89页例2庆大霉素C组分、及例2庆大霉素C组分、及有关物质有关物质取西索米星、小诺霉素标准品各适量，精密称定，用流动相制成每1ml中约含西索米星和小诺霉素各25ug、100ug和250ug限度：如有西索米星、小诺霉素峰分别用相应的回归方程计算西索米星、小诺霉素的百分含量。含西索米星不得过2.0%，小诺霉素百分含量不得过3.0%。其他杂质，除硫酸峰外各杂质峰按小诺霉素回归方程计算，单杂不得过2.0%总杂不得过5%。”第39页/共89页HPLC-UV柱前衍生化应用柱前衍生化方法首次在氨基糖苷类抗生素中有关物质检查项中得到应用，如阿米卡星和硫酸阿米卡星。第40页/共89页阿米卡星有关物质色谱条件与系统适用性试验

C18柱；以0.27%磷酸二氢钾溶液（用2.2%的氢氧化钾溶液调节pH值至6.5）－甲醇（30：70）为流动相；流速为每分钟1ml；检测波长为340nm。2,4,6-三硝基苯磺酸为衍生化试剂，阿米卡星峰与杂质A峰之间的分离度应不小于3.5；理论板数按阿米卡星峰计算不低于3500。(参照BP修订)第41页/共89页有关物质限度供试品溶液色谱图中按外标法以峰面积计算，以阿米卡星计，杂质A不得大于1.0％，其他单个杂质不得大于1.0％，其他杂质的和不得大于3.0％。供试品溶液色谱图中峰面积小于对照品溶液主峰面积0.1倍的色谱峰、空白溶液中出现的色谱峰以及主峰之前的色谱峰可忽略不计。第42页/共89页阿米卡星和硫酸阿米卡星:

柱前衍生HPLC法可以在同一色谱条件下同时检出卡那霉素(BP杂质D)、杂质B、杂质A以及其它杂质，并可参考BP2009阿米卡星项下系统适用性色谱图定位，且药厂出口采用此法，对本法的可行性已有数据可证明。第43页/共89页阿米卡星混合溶液的分离色谱图第44页/共89页BP2009阿米卡星项下系统适用性色谱图第45页/共89页

TLC法检查有关物质硫酸新霉素(USP电化学)盐酸大观霉素(EP.BP电化学)第46页/共89页HPLC-ELSD测定新霉素有关物质以中检所提供的色谱条件为基础，170mMTFA为流动相，TSKgelODS-100v柱(流速为0.4ml/min)，可以将结构相似的新霉素C、新霉素B、巴龙霉素及新霉胺有效分离，

优化后新霉素B及其结构类似物的色谱分离图1.硫酸根，2..新霉胺，3.巴龙霉素，4.新霉素C,5.新霉素B第47页/共89页HPLC-ELSD测定大观霉素有关物质第48页/共89页有关物质计算方法HPLC-ELSD 与对照品主成分对照线性回归方程计算HPLC-UV柱前衍生化法已知杂质定位,与对照品主成分对照TLC与不同浓度对照斑点比较第49页/共89页硫酸盐除部分品种仍采用原滴定方法，本版药典首次采用HPLC-ELSD方法对其进行测定。2005版中测定硫酸盐含量采用的是容量法与传统的重量法测定相比，有其先进性，但滴定终点突跃不明显，本版药典建立的HPLC-ELSD方法测定硫酸盐含量，采用硫酸滴定液作为对照品，解决了对照品的问题，该方法方便、准确。第50页/共89页例如：2010年版药典中硫酸西索霉素、硫酸庆大霉素、硫酸奈替米星和硫酸依替米星均采用HPLC-ELSD方法外标法测定硫酸盐含量。其他品种可以进一步做工做。第51页/共89页含量测定方法多样性1）硫酸卡那霉素，硫酸依替米星及其制剂共七个标准的含量测定为HPLC-ELSD方法。（2）阿米卡星和硫酸阿米卡星及其制剂共4个标准的含量测定采用柱前衍生化HPLC-UV方法。（3）硫酸新霉素硫酸核糖霉素及其制剂共4个标准的含量测定采用微生物管碟法（4）盐酸大观霉素及其制剂共4个标准的含量测定采用微生物检定法浊度法（5）其他23个标准的含量测定均采用微生物检定法管碟法和微生物检定法浊度法两法并列，可任选一方法。第52页/共89页含量测定

HPLC-ELSD法柱前衍生化HPLC-UV法微生物检定法(管碟法)微生物检定法(浊度法)微生物检定法(管碟法和浊度法)744423第53页/共89页展望

电化学分析法电化学分析法在氨基糖苷类抗生素中应用主要涉及极谱分析、修饰电极、电位滴定分析法等方面。1直接电化学分析法直接电化学分析法是基于一些抗生素自身带有的可氧化还原基团在电极上产生氧化还原信号，在信号的强弱与抗生素浓度的线性关系上建立起来的一种分析方法。第54页/共89页1、直接电化学分析法如有报道根据链霉素中的链霉胍结构可在滴汞电极上发生氧化还原反应产生阴极波的性质，将一阶导数差示脉冲极谱法(FDPP)用于链霉素及其制剂的定量分析。用差示脉冲极谱(DPP)法测定了庆大霉素浓度，在pH5~10范围内，庆大霉素浓度在0.5~10μg/mL范围内与峰高成线性关系。第55页/共89页2、间接电化学分析法间接电化学分析法是抗生素在自身没有氧化还原信号的情况下，与金属离子络合或与一些物质反应或在修饰电极上产生的电化学信号与其浓度成线性关系而建立起来的方法。第56页/共89页2、间接电化学分析法在硼砂-氢氧化钠介质中，将卡那霉素和甲醛反应，得到能产生灵敏还原波的席夫碱。卡那霉素浓度在2.0×10-7~3.0×10-5mol/L范围内与波高成正比,用于注射液中卡那霉素含量的测定,检出限1.98×10-7mol/L。利用卡那霉素与Cu2+在NH3-NH4Cl缓冲溶液中形成络合物[11]的原理,建立方波伏安法测定卡那霉素注射液的方法。卡那霉素浓度在1.5×10-5~6.5×10-4mol/L之间与峰电流呈良好的线性关系,回归方程为:Ip=-0.0993c+20.47(I/μA,c/(10-5mol·L-1)),r=0.996。第57页/共89页色谱法

高效薄层色谱(HPTLC)

有报道建立了测定庆大霉素中C1、C1a、C2、C2a及奈替米星的含量的HPTLC法，用C8或C18反相薄层板，以甲醇-0.1mol/L氯化锂的32％氨水溶液（5：25）为展开剂，以2,2-diphenyl-l-oxa-3-oxonia-2-boratanaphthalene(DOOB)为显色剂。用HPTLC测定了新霉素中3个组分新霉素A、B和C的百分含量。通过使用衍生化试剂4-氯-7-硝基苯-2-氧杂-1,3-二唑(NBD-CL)及荧光光密度分析法,用HPTLC测定了血浆和尿中庆大霉素的含量,其定量限相当于血浆中20~100μg·mL-1,尿中10~50μg·mL-1。第58页/共89页色谱法高效毛细管电泳（HPCE）分析高效毛细管电泳由于具有高效、快速、进样体积少和消耗溶剂少等优点,得到了迅速发展,在化学、生命科学和药学领域都有了广泛的应用。氨基糖感苷类抗生素具有极好的水溶性,并带正电荷,故较适宜用毛细管电泳进行分析，但由于其分子结构中不具有合适的生色团,故选择适当的检测手段十分重要。第59页/共89页高效毛细管电泳（HPCE）分析Ackermans[28]最先报道采用毛细管区带电泳（CZE）测定13种氨基糖苷类抗生素，采用间接检测方法，即通过在电解质中添加在214nm有较强吸收的0.01mol/L醋酸咪唑作为共存物，使检测器在整个分离过程中都有一定的背景信号输出，而此波长下无吸收的氨基糖苷类抗生素经过检测时信号输出降低，从而得到检测（负峰）。第60页/共89页色谱法HPLC法UV检测器：末端吸收，衍生化ELSD通用型检测器电化学检测器：有安培检测器、库仑检测器、极谱检测器和电导检测器等四种。BP2008和EP6.0中有庆大霉素、新霉素、奈替米星和妥布霉素四个品种、USP中有阿米卡星、链霉素和卡那霉素三个品种采用电化学检测器进行含量测定和有关物质检查第61页/共89页质谱及LC-MS技术

LC的高分离效能与MS的高灵敏度,高选择性使之成为当代最重要的分离和鉴定分析方法之一,同时也成为药物研究中强有力的工具。在氨基糖苷类抗生素中应用主要以原料药中的有关物质尤其是微量杂质进行结构推定，

第62页/共89页质谱及LC-MS技术依替米星有关物质结构推定的HPLC-ESI-IT-MSn方法，从硫酸依替米星样品中检出18个有关物质，并对14个有关物质的结构进行了推定，推定的基本思路为：对有对照品的有关物质，通过比较有关物质与对照品的色谱保留时间、一级质谱和二级质谱进行结构确证；对无对照品的有关物质，通过分析依替米星、庆大霉素C1a、小诺霉素对照品二级质谱裂解途径，总结出这类物质质谱裂解规律和特征裂解碎片离子，在此规律的基础上，根据关物质的一级、二级质谱进行结构推定，有时还要结合相关文献和实际工艺进行佐证，ZhengCN等将类似的推定过程称为“诊断碎片离子推断策略”

第63页/共89页四环素类抗生素四环类抗生素的基本特点，结构特点四环素类抗生素为四骈苯或萘骈萘的衍生物，是两性化合物。分子中存在酚羟基和烯醇型羟基，显弱酸性；同时含有二甲胺基，显弱碱性，故遇酸及碱，均能生成相应的盐，临床上大多采用盐酸盐。本品分子结构中具有多个不对称碳原子，因此有旋光性。第64页/共89页性状四环类抗生素都是结晶型物质，分子内含有蒽酮类发色团，一般为黄色结晶性粉末，干燥的四环类游离碱和它们的盐类都比较稳定，但在贮存中遇光促使颜色变深，可能有降解物产生。四环类抗生素的游离碱，在水中的溶解度很小，当pH值低于4或高于8时，可以得到高浓度的四环类化合物的水溶液。第65页/共89页

化学性质1差向异构化性质四环类抗生素在酸性（pH2.0～6.0）溶液中，A环上4位手性碳原子构型易发生差向异构化反应，形成差向化合物，四环素、金霉素、去甲环素等很容易差向化，形成4-差向异构体，但土霉素由于5位上的羟基和4位上的二甲胺基易形成氢键，因而较稳定，不易发生差向异构化。四环类抗生素的差向异构化发应，可用下式表示：第66页/共89页结构特点第67页/共89页2,降解反应

(1)酸性条件下四环类在较酸溶液中特别在加热情况下，产生脱水四环类降解产物，脱水产物的共轭双键的数目增多，因此色泽加深。(2)碱性条件下四环类抗生素在碱性溶液中放置一段时间，C环打开，生成无活性的具有内酯结构的异四环类抗生素。在紫外光照射下具有强烈荧光。(3)四环类抗生素能与许多金属离子形成有色络合物。在无菌检查去抑菌作用时可以利用该性质。也可用于四环类抗生素的分析和鉴定。第68页/共89页

2010版药典品种收载情况

原料制剂注射用眼膏胶囊软膏片盐酸土霉素√盐酸四环素√√√盐酸多西环素√√盐酸米诺环素√√盐酸金霉素√√盐酸美他环素√√611415第69页/共89页本版四环类抗生素修订情况概要

鉴别

一般采用TLC/HPLC、IR和氯化物反应，本版部分品种增加了紫外鉴别。由于盐酸多西环素在甲醇中紫外图形有较强的特征增加了紫外鉴别：20ug/ml甲醇溶液在269nm和354nm处有最大吸收，在234nm和296nm处有最小吸收。第70页/共89页检查

项目设置无变化，有关物质测定方法仍以HPLC为主，但测定条件随含量测定色谱条件修订有所改变。第71页/共89页有关物质

色谱条件同修改后含量测定的色谱条件杂质含量计算方法四环素已知杂质含量用校正因子计算，米诺环素、土霉素、多西环素用已知杂质对照品定位，用不加校正因子的自身对照法计算，金霉素用外标法计算已知杂质的含量。第72页/共89页限度的确定

如：盐酸土霉素EP6.0：4-差向土霉素≤0.5%，四环素≤2.0%，2-乙酰-2去酰胺土霉素≤2.0%，其他杂质总和≤2.0%，而国内样品4-差向土霉素和四环素的含量很少，故将其作为其他杂质控制，不再单独规定限度，其他杂质总和≤2.0%；有文献报道2-乙酰-2-去酰胺土霉素的抗菌活性很低[2]，但未见其毒性的相关报道，故本标准规定其限度为3.0%，限度为：供试品溶液色谱图中如有杂质峰，2-乙酰-2-去酰胺土霉素杂质峰面积不得大于对照溶液主峰面积的1.5倍（3.0%），其他各杂质峰峰面积的和不得大于对照溶液主峰面积（2.0%）。第73页/共89页限度的确定如：盐酸多西环素EP6.0盐酸多西环素（DoxycyclineHyclate）中有6个潜在杂质，分别命名为杂质A、B、C、D、E、F，其中杂质A(β-多西环素，又称为6-表多西环素，6-epidoxycycline)，是合成过程中美他环素转变为多西环素时产生的6-差向副产物，杂质B美他环素是合成中间体，杂质E土霉素为合成起始原料，杂质F可能是土霉素中的杂质2-乙酰基-2-脱碳氨基-土霉素在合成多西环素过程的共存物，杂质C、D可能是多西环素在溶液或放置过程中生成的差向异构体。第74页/共89页2005年版药典标准中土霉素作为特定杂质的单独规定限度，因多批原料及片剂中均未检出土霉素，故将土霉素作为其他杂质控制，另增加对其他单个杂质和总杂质的限度控制。第75页/共89页盐酸四环素有关物质限度为：供试品溶液色谱图中如有杂质峰，土霉素、4-差向四环素、盐酸金霉素、脱水四环素、差向脱水四环素按校正后的峰面积计算（分别乘以校正因子1.0、1.42、1.39、0.48和0.62）分别不得大于对照溶液主峰面积的0.25倍（0.5%）、1.5倍（3.0%）、0.5倍（1.0%）、0.25倍（0.5%）、0.25倍（0.5%），其他各杂质峰面积的和不得大于对照溶液主峰面积的0.5倍（1.0%）。第76页/共89页含量测定盐酸多西环素,盐酸美他环素,盐酸四环素,盐酸土霉素统一了色谱条件第77页/共89页修改原因由于2005版药典测定四环素类的流动相中的草酸铵容易结晶析出造成系统堵塞，加之流动相中的二甲基甲酰胺容易吸附在管路和检测池中，影响后续品种的检测第78页/共89页本版流动相作了较大修改对多西环素及其制剂色谱分离的影响因素包括水相缓冲盐的种类和浓度、pH值、扫尾剂、有机相、柱温等进行了系统的考察，确定了新的流动相，用醋酸铵和乙腈替代草酸胺及N,N－二甲基甲酰胺，并在流动相中添加了少量的EDTA，用经于竞争性抑制色谱填料中残留重金属离子与四环素类及杂质的络合，添加了少量三乙胺可以封闭柱调料中部分残余硅羟基的影响，减少拖尾。第79页/共89页流动相配比见下表盐酸土霉素醋酸盐缓冲液[0.25mol·L-1醋酸铵-0.1mol·