植物原生质体培养与体细胞杂交

植物原生质体培养与体细胞杂交第1页/共70页第2页/共70页第3页/共70页第4页/共70页第5页/共70页第一节原生质体的分离与纯化一、原生质体的分离 （一）分离原生质体的材料来源 （二）分离方法

1．机械分离法

2．酶法分离

（三）技术程序二、原生质体的纯化

第6页/共70页（一）分离原生质体的材料来源

游离原生质体时，植物叶片、花瓣、果实组织、子叶、下胚轴、幼根、茎叶、愈伤组织、悬浮细胞等都可作为材料来源，但常用于分离原生质体的材料为：1、叶片 叶片来源丰富，供应及时，有明显的叶绿体存在时也便于在细胞融合中识别。2、试管苗的子叶、胚轴或茎尖等无菌材料3、愈伤组织或悬浮培养细胞。第7页/共70页（二）分离原生质体的方法1、机械分离法2、酶法分离

酶法分离是利用纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶等酶类降解细胞壁成分，获得原生质体的方法。（1）分离原生质体的酶类（2）酶解分离原生质体的方法

（3）酶解分离原生质体应注意的问题 根据植物材料种类选择所用酶的种类、处理浓度、和处理时间。 酶解分离时应提供适宜的渗透压保护，以防原生质体破裂。第8页/共70页（1）分离原生质体的酶类酶的类型作用常用种类纤维素酶降解细胞壁中纤维素成分，游离原生质体。OnozukaR-10半纤维素酶降解细胞壁中的半纤维素成分。PhozymeHP-150果胶酶降解相邻细胞间的果胶质，使细胞游离。MacerozymeR-10第9页/共70页（2）酶解分离原生质体的方法①两步分离法 这种分离方法是先用果胶酶离析植物组织，使植物细胞从组织中分离出来，然后收集细胞经洗涤后用纤维素酶解离细胞壁，最后获得原生质体。

②一步分离法 即把一定量纤维素酶和果胶酶组成混合酶液，对材料进行一次性处理，处理温度25~30℃，处理的时间根据材料及酶浓度的不同而不同，可为2～24h。

第10页/共70页（三）游离原生质体的技术程序1、材料准备：称重、灭菌与研碎。2、预处理：研磨、切割、暗培养等。3、酶解：加入酶液，保育处理；4、收集纯化：过滤去除组织碎块；离心纯化原生质体。5、活力检测6、原生质体的培养 原生质体再生细胞壁细胞分裂，形成愈伤组织愈伤组织分化成苗第11页/共70页二、原生质体的纯化（一）离心沉淀法

(过滤浓缩法）（二）接口法

选用两种不同渗透浓度的溶液，其中一种溶液的密度大于原生质体的密度，另一种溶液小于原生质体的密度，原生质体经适当速度离心后即介于两种溶液之间。

（二）漂浮法

第12页/共70页（一）离心沉淀法1、方法：先将经酶处理的原生质体悬浮液用400目网筛过滤，滤液经500～1000r/min离心5～6min后，吸去上清液，然后用一般洗涤液重新悬浮，离心沉淀，如此重复2～3次。最后再用原生质体培养液洗1次，收集原生质体备用。2、注意：（1）整个过程用相同的渗透液，渗透压以稍高于原生质体内渗透压，细胞稍微发生质壁分离为好。（2）常用的原生质体清洗介质为CPW溶液；（3）这种方法简便，但不能完全除尽少量脱壁不完全的细胞和破碎的原生质体。第13页/共70页（二）接口法1、方法：先在离心管底加入山梨醇或蔗糖的浓溶液（21%），再小心的加入过滤处理的酶-原生质体混合液，以合适的速度离心，原生质体将聚集于两液面之间。小心取出原生质体转入另一离心管，用清洗介质清洗、离心，重复3次。最后以适当的密度悬浮于液体培养基中。2、优劣该法可收集较纯的原生质体，且原生质体破碎较少。但采用的高渗溶液往往对原生质体伤害较大。用此法的关键是控制好蔗糖或山梨醇的浓度及离心速度，使原生质体漂浮于单一界面，且不影响原生质体的稳定性和活力。第14页/共70页第15页/共70页第16页/共70页第二节影响原生质体产量

和活力的因素一、材料来源

（一）植物叶片（二）培养细胞二、预处理

三、酶处理四、渗透压

第17页/共70页（一）植物叶片

当从植物叶片分离原生质体时，植株的生长环境、植株年龄等对原生质体的分离和培养影响较大。１、植株年龄 对一年生草本：生长40-60天的幼叶； 对多年生木本：幼龄且充分展开的叶片。２、母株生长环境 母株生长在低光强（10001x）、短日照、温度20℃~25℃、相对湿度60％～80％的条件下，以及较高的氮肥供应。３、采用离体苗叶片第18页/共70页（二）培养细胞

由培养细胞分离原生质体，其产量取决于培养细胞的生长速率和生长时期。 频繁继代可促进细胞的旺盛分裂，生长时期以处于对数生长早期的细胞为好。即：

频繁继代（每2~3天继代1次）的悬浮培养物以及处于对数生长早期的细胞是最适宜的供体材料。

利用培养细胞分离的原生质体往往容易实现细胞壁的再生和细胞的分裂和分化。第19页/共70页不同植物适宜于分离原生质体的材料

不同科属的植物其材料特性存在差异，适宜于游离原生质体的供体材料也异。（1）茄科 一般选择生长旺盛、生理状态一致的刚展开的幼嫩叶片。（2）十字花科 种子萌发4-5天的无菌苗的下胚轴为材料，具有原生质体得率高、活力强、再生频率高等优点。（3）豆科 以未成熟种子的子叶为材料。（4）禾本科 用幼胚、幼穗、花药或成熟胚为外植体建立胚性愈伤组织及其胚性悬浮细胞系分离原生质体。第20页/共70页二、预处理1、依据材料特性进行表面灭菌2、促使酶液渗入组织细胞内的措施 （1）撕去叶片的下表皮，将无表皮的一面向下漂浮在酶溶液中。

（2）将叶、胚轴、嫩茎等切成小块或薄片，投入到酶溶液中。 （3）真空渗入促使酶液渗透。 （4）酶处理期间进行搅拌或振荡。

第21页/共70页三、酶处理1、原生质体分离在很大程度上取决于所用酶的性质和浓度，因此要做好酶种类、处理浓度的选择。2、酶处理的适宜条件 （1）pH值 酶的活性与pH有关，用于分离原生质体的大多数酶适宜的PH为4.7-6.0。 （2）温度对用来分离原生质体的酶类来说，最适温度是40~50℃，但分离原生质体时以25~30℃为宜。 （3）光照 通常在黑暗或在低光强下分离原生质体。第22页/共70页1、酶种类、处理浓度、处理时间

（1）对于胚性愈伤组织、悬浮培养细胞 常用活性较强的酶的组合，如CellulaseRS、PectolyaseY-23、RhozymeHP150，并且酶处理浓度应高些，用量应大些。 （2）对于叶片、子叶、下胚轴等材料 常用CellulaseR-10、MacerozymeR-10、Hemicellulase等活性属一般的酶，酶处理浓度可低些，用量少一些。 （3）酶解时间 视材料、酶性质、处理浓度而定，30min-24h。一般不宜超过24小时，以免游离的原生质体解体。第23页/共70页四、渗透压

离体原生质体的一个基本属性是它们的渗透破碎性。所以在原生质体分离和最初培养阶段，应给予渗透压保护，以代替细胞壁对原生质体机械维持的压力。 （一）渗透压保护剂 （二）应注意的问题第24页/共70页（一）渗透压保护剂

原生质体分离及培养过程中渗透压的调节通常利用糖或糖醇来控制， 常用的渗压剂有甘露醇、山梨醇、葡萄糖和蔗糖，其中甘露醇和山梨醇或其组合最常用。叶原生质体分离时最常用的为甘露醇（浓度为0.23~0.90M）。 有效的渗透浓度决定于原生质体分离期间叶细胞的渗透压。内源细胞渗透压明显地受环境条件的影响，并且能够用暗处理植株和幼叶组织等措施加以控制。第25页/共70页（二）应注意的问题 1、在酶处理液、原生质体清洗介质及原生质体培养基中必须加入合适的渗透压保护剂。

2、原生质体在轻微高渗溶液中比在等渗溶液中稳定。较高水平的渗透压虽可阻止原生质体破裂，但影响细胞的代谢、分裂和生长。

3、在分离原生质体时，可以使用电解质渗压剂，但在原生质体培养时一般不用。

4、当用非电解质为渗压剂时，在酶液中加入某些盐类，如Cacl2、KH2PO4、葡聚糖硫酸钾，可以提高质膜的稳定性。第26页/共70页第三节原生质体的培养一、影响原生质体培养的因素 （一）基本培养基 （二）渗透压 （三）植物激素 （四）氮源 （五）复杂有机物二、培养方法三、培养密度四、培养条件第27页/共70页（一）基本培养基1、所使用的培养基一般是改良的细胞培养基，并且培养基的基础成分多采用B5或MS培养基的配方。如

KM8P和K8P培养基： 以B5培养基为基础

NT培养基： 以MS培养基为基础2、不同植物常采用的培养基 禾本科植物： MS、N6、KM； 十字花科和豆科： B5、KM8P、K8P、KM； 茄科： MS、NT、K3第28页/共70页（二）渗透压

原生质体再生细胞壁之前，必须在培养过程中提供适宜的渗透压保护。1、在原生质体培养中，一般常用的渗压剂有甘露醇、山梨醇、蔗糖、葡萄糖及麦芽糖等。2、在原生质体培养中不宜使用电解质渗压剂。3、原生质体再生细胞壁后应使培养基的渗透压逐步降低。第29页/共70页（三）植物激素1、不同植物原生质体培养对激素的种类和浓度的要求存在较大的差异。2、生长素中常用的是2,4-D、NAA，在细胞分裂素中最常用的是BAP、KT、2-IP。3、在不同的生长发育阶段（起始分裂、细胞团形成、愈伤组织形成与器官分化、胚状体发生与成苗），需要不断对培养基中激素的种类和浓度进行适时调整。第30页/共70页

（1）在原生质体培养中，加入2,4-D对于原生质体再生细胞壁，启动分裂，持续分裂直至形成愈伤组织是很有效的，如禾谷类植物。 （2）一般细胞分裂素和生长素以一定配比结合使用。 （3）由活跃生长的培养细胞分离的原生质体要求较高的生长素/分裂素配比才能进行分裂； 由高度分化的细胞如叶肉细胞得到的原生质体，常需要较高的分裂素/生长素配比才能进行脱分化。第31页/共70页（四）氮源

许多研究指出，适当浓度的谷氨酰胺对原生质体的细胞壁再生、细胞分裂和生长都有明显的作用。 NH4+浓度太高的培养基不宜用作原生质体培养基。铵对许多植物（如烟草、马铃薯）的原生质体有毒害作用，抑制原生质体的生长。降低培养基中NH4+浓度对原生质体的存活、细胞再生及持续分裂都有利。 还有很多实验发现硝酸盐对原生质体可产生毒害作用，因此使用时应特别注意其用量。第32页/共70页（五）复杂有机物

在原生质体培养中，常加入一些复杂有机物，可以不同程度的提高再生细胞分裂频率，促进细胞团的形成。 常用的有机物有谷氨酰氨、水解乳蛋白、水解酪蛋白、肌醇、椰乳、酵母浸出物等。第33页/共70页二、培养方法原生质体培养一般采用液体培养的方法，因为： （一）液体浅层培养

（二）平板法培养 （三）悬滴法培养 （四）固液结合培养法第34页/共70页原生质体培养一般采用液体培养 1、有些物种的原生质体不能在固体培养基上分裂。

2、采用液体培养有利于调整培养基成分。

3、采用液体培养可将经过几天高密度培养之后的细胞密度降低，也可将感兴趣的细胞分离出来。第35页/共70页（一）液体浅层培养 1、方法 把原生质体以一定的密度（约2×105个/mL）悬浮在液体浅层培养基中（浅层的厚度以1mm为宜），用石蜡膜封住平皿后，放在适宜条件下培养。

2、优劣

优点是：操作方便，对原生质体的伤害也小；培养基与空气接触面大、通气好；原生质体的代谢物易扩散，防止了有害物质积累过多而造成毒害；便于转移培养物或添加新鲜培养基。

缺点是：原生质体分布不均，易造成局部密度过高或原生质体粘聚而影响其再生细胞的分裂和进一步的生长发育；难以实施定点观察和跟踪观察。第36页/共70页（二）平板法培养

1、方法 取适量原生质体悬浮液，与热融并冷却至45℃的含琼脂或琼脂糖的培养基等量混合，并迅速轻轻摇动，使原生质体均匀分布。待凝固后，将培养容器置于四周垫有保湿材料的容器内。

2、优劣

有利于原生质体均匀分布；

便于定点观察，可跟踪观察单个原生质体的细胞壁再生、分裂等行为；

也有利于在部分材料污染时抢救未污染的部分。

第37页/共70页（三）悬滴法培养

1、方法 将适宜密度的原生质体悬浮液，用滴管或定量加液器，以50ul/100ul的小滴接种于培养皿盖内，其数量以滴与滴间不相碰为原则，皿底加入液体以保湿。将皿盖稳妥地盖在皿底上，封口培养。

2、优劣

优点是：所用材料较少，培养液用量也少；有利于通气和观察，易添加培养基；不易污染等。适合低密度培养。

缺点是：原生质体分布不均，易集中于小滴中央；液滴与空气接触面大，培养基成分和物理特性易于变动。第38页/共70页（四）固液结合培养法 1、双层培养法 在培养皿底先铺一层固体培养基（含或不含原生质体/细胞），再在其上进行原生质体的液体浅层培养。

2、切块悬浮培养 先将原生质体包埋于固体平板，再将其切成小块，投入到大体积的液体培养基中，并放于摇床上进行振荡培养。

3、琼脂糖珠培养法 即将原生质体与琼脂糖培养基混合后，逐滴滴在培养皿底面，待其凝固后，再在其周围加入液体培养基。采用这种方法可以在液体培养基中加入经辐射处理的细胞。第39页/共70页第40页/共70页三、培养密度 1、原生质体适宜的培养密度一般为1×104-1×105个/ml，但这不利于单细胞无性系的筛选。

2、低密度下培养原生质体，可通过改良培养基组成和改进培养方法入手。 （1）一般培养基成分越复杂越全面，原生质体的培养的植板密度就可以越低。 （2）改进培养方法也可有效降低培养密度。如饲喂细胞层法；不同类型的原生质体混合培养的方法等。 第41页/共70页四、培养条件

（一）光照

1、新分离出的原生质体应在散射光或黑暗中培养。

2、在原生质体对光敏感的情况下，应尽量减少观察的次数，凡经观察过的原生质体不应包括在以后的实验结果中。 （二）温度

1、原生质体培养一般在25-30℃下进行。

2、较高的培养温度往往有利于启动和维持原生质体的分裂。 （三）湿度 在原生质体固体培养和小液滴培养中，应注意培养湿度的保持。第42页/共70页第四节由原生质体再生植株一、原生质体再生细胞壁，形成完整细胞。二、细胞分裂形成细胞团或愈伤组织。三、由愈伤组织分化形成植株。第43页/共70页一、原生质体再生细胞壁

原生质体在培养中能否再生细胞壁并进行持续的分裂是关系到原生质体培养成败的关键因素。

1、一般，原生质体再生细胞壁是其进行正常分裂的前提。

2、新形成的细胞壁是由排列松散的微纤丝组成的，由这些微纤丝组成典型的细胞壁。

3、细胞壁的形成既受原生质体内在因子（如基因型、原生质体来源）的控制，也受培养基组成等外界因素的影响。第44页/共70页二、细胞分裂形成细胞团或愈伤组织

原生质体再生壁后开始第一次分裂的时间，随植物种类、分离原生质体的材料、原生质体的质量、培养基和培养条件而异。 并非所有再生细胞壁的原生质体都能进行分裂，一般凡能分裂的原生质体，在经过第一次分裂并持续分裂后，将形成肉眼可见的愈伤组织。第45页/共70页第46页/共70页第47页/共70页第48页/共70页第四节体细胞杂交一、体细胞杂交及一般步骤二、原生质体融合的一般过程三、原生质体融合方法（一）自发融合（二）诱发融合四、原生质体融合产物的细胞学五、杂种细胞选择六、杂种植株鉴定七、细胞质杂种第49页/共70页一、体细胞杂交及一般步骤1、体细胞杂交指完全不经过有性过程，通过体细胞融合得到杂种细胞，再对杂种细胞培养使其分化形成杂种植株的过程。2、步骤原生质体制备原生质体融合杂种细胞选择杂种细胞培养杂种植株再生杂种植株鉴定第50页/共70页二、原生质体融合的一般过程（一）包含了三个连续的主要阶段：1、凝聚作用；2、细胞质桥的出现；3、细胞质桥的扩展和细胞的融合。（二）注意第51页/共70页利用不同品系的甜菜叶肉细胞进行电融合图中下方的黑带是电极。第52页/共70页

原生质体的粘连并不一定必然导致膜的融合。如伴刀蛋白A或抗体都能促使原生质体的凝聚，但之后很少发生或不发生原生质体的融合。植物原生质体表面所带的电荷会阻止原生质体的粘连。第53页/共70页三、原生质体融合方法（一）自发融合

相邻的同种原生质体借助胞间连丝可发生融合，形成多核的原生质体，这种不经外界因素诱导就发生的原生质体融合称为自发融合。避免这种自发融合：切断胞间连丝。（二）诱发融合在外加因素诱导下的原生质体融合为诱发融合1、化学融合法2、电融合法第54页/共70页第55页/共70页1、化学融合法NaNO3处理：中和质膜表面负电荷，使之紧密结合；诱导形成异核体的频率低，特别时原生质体来自于高度液泡化的叶肉细胞时。高pH-高浓度Ca2+处理聚乙二醇（PEG）处理聚乙二醇：为一种聚合化合物分子量在1500-6000之间，易溶于水。诱导特点（1）形成的异核体频率较高，特别是双核异核体的比例较高。（2）PEG诱导原生质体融合没有特异性；（3）实验可重复性很高。（4）PEG对大多数细胞类型毒性低，适合于大多数物种的原生质体融合。第56页/共70页诱导方法1）收集原生质体；2）将两种不同来源的原生质体以适当比例混合（如1：1），静置使之沉降，增加触融机会。3）用28%-58%的PEG溶液处理15-30分钟，促使原生质体相互粘连；4）然后用清洗培养基逐步清洗原生质体上的PEG，或用高PH高浓度钙离子溶液清洗。注意清洗应逐步平缓进行，剧烈洗涤会减少异核体的形成。5）融合体的培养。诱导机制第57页/共70页四、原生质体融合产物的细胞学间期核融合的结果并不产生有活力的杂种细胞，只有有丝分裂期间的核融合形成的杂种细胞才能继续进一步的发育。原生质体融合将产生以下杂种细胞：1、亲合的细胞杂种：具有双亲的全套染色体，并能进行正常分裂，形成异源双倍体。2、部分亲合的细胞杂种：

一个亲本的染色体组或全部消失，或其染色体只有部分的保留或重组于另一亲本的染色体组。3、形成非整倍体的混合群体：如粉蓝烟草（2N=24）和南氏烟草（2N=18）获得的体细胞杂种，其染色体数处于56-64之间。4、胞质杂种：包含一个亲本的染色体组，但包含双亲的细胞质。第58页/共70页普通小麦和簇毛麦体细胞杂交获得的杂种细胞染色体(红色荧光者为普通小麦染色体，黄色者为簇毛麦染色体)第59页/共70页五、杂种细胞选择选择的必要性杂种细胞选择方法1、对于在形态上易区分的原生质体及杂种细胞，可在低密度下培养，然后用机械方法将杂种细胞分离出来。2、荧光染料标记选择3、互补选择法

利用两亲本原生质体对培养基成分、抗代谢物或温度等的敏感性存在着的天然的互补性差异，以及隐性突变造成的遗传互补来筛选杂种细胞。第60页/共70页互补选择法利用不同亲本原生质体在遗传上、抗性上和生理上的互补进行选择：白化（aaBB）+白化（AAbb）绿色（AaBb）营养缺陷（aaBB

）+营养缺陷（AAbb

）自养（AaBb）抗性（aaBB

）+抗性（AAbb

）双抗（AaBb）对培养基成分和抗代谢物互补对光照敏感性互补叶绿体缺失突变体光敏突变体融合，高光强下培养只有杂种细胞形成绿色的对光不敏感的细胞团第61页/共70页矮牵牛两个种的原生质体对培养基成分及放线菌素D（抗代谢物）的敏感性存在差异原生质体类型在MS培养基上能否形成愈伤组织对放线菌素D敏感性甲种不能不敏感乙