真核微生物的蛋白质合成与分泌

真核微生物的蛋白质合成与分泌第1页，共65页，2023年，2月20日，星期一一、真菌基因组结构特点（一）真核基因组相对较大哺乳动物基因组DNA约3×109

碱基对编码基因约有10000个，占总长的45%左右基因的外显子数平均为2个真菌基因组DNA约4×107

碱基对3.1蛋白质合成的调节机制第2页，共65页，2023年，2月20日，星期一（二）单顺反子单顺反子(monocistron)

即一个编码基因转录生成一个mRNA分子，经翻译生成一条多肽链。（三）重复序列单拷贝序列（一次或数次）高度重复序列（106

次）中度重复序列（103~104次）多拷贝序列（四）基因不连续性（一般含内含子）第3页，共65页，2023年，2月20日，星期一染色体水平DNA的活化转录的起始hnRNA的剪切和加工mRNA转移到胞浆翻译二、真菌基因表达调控特点第4页，共65页，2023年，2月20日，星期一2.DNA拓扑结构变化天然双链DNA均以负性超螺旋构象存在；基因活化后RNA-pol正超螺旋负超螺旋转录方向1.对核酸酶敏感活化基因常有超敏位点，位于调节蛋白结合位点附近。三、染色体水平DNA的活化与沉默第5页，共65页，2023年，2月20日，星期一第6页，共65页，2023年，2月20日，星期一3.DNA碱基修饰变化真核DNA约有5%的胞嘧啶被甲基化，甲基化范围与基因表达程度呈反比。1.mCpG是真核生物甲基化的唯一形式2.基因表达与CG甲基化程度呈负相关，甲基化以后可加强阻遏蛋白或降低激活蛋白与DNA的结合3.DNA甲基化对转录的抑制主要决定于甲基化CpG的密度和启动子强度第7页，共65页，2023年，2月20日，星期一DNAMethylationandTranscription5`3`5`3`第8页，共65页，2023年，2月20日，星期一WhatAretheFunctionsofDNAMethylation?CpGislandmethylationisrareinnormalcellsDefenseagainstinvading'parasitic'DNA,retrovirusX-chromosomeinactivationInvitrocellculture:lossofcelltype-specificfunctionsSomediseases:lupusIncreasingwithageCancer:tumorgenesandtumorsuppressorgenes第9页，共65页，2023年，2月20日，星期一Sometumorsuppressorgeneswhichcanbecomehypermethylatedandsilencedinhumantumors

TumorsuppressorgeneTumortype(s)pRbRetinoblastomaVHLRenalcarcinomap16INK4aMelanomaandmanyothersp15INK4bHematologicmalignancieshMLH1ColorectalcarcinomaAPCColorectalcarcinomaBRCA1Breastcancer第10页，共65页，2023年，2月20日，星期一4.组蛋白变化富含Lys组蛋白水平降低活性的核小体常缺乏H1，但却结合有非组蛋白HMG－14和HMG－17的存在②H2A,H2B二聚体不稳定性增加组蛋白修饰H1组蛋白磷酸化，对DNA亲和力低核心组蛋白的修饰，乙酰化，磷酸化④H3组蛋白巯基暴露第11页，共65页，2023年，2月20日，星期一第12页，共65页，2023年，2月20日，星期一四、RNApolI和polⅢ的转录调节RNApolI转录产物只有rRNA前体，有2个顺式作用元件（-45~+20bp核心元件，-156~-107bp上游控制元件UCE），需两种转录因子来正确有效地帮助起始转录（上游结合因子1和选择性因子1）。RNApolⅢ对tRNA和5SrRNA基因的转录调节，启动子在转录区内。tRNA有2种转录因子，5SrRNA有3种转录因子，但都只有TFⅢB才识真正的转录起始因子，在定位RNApol方面起重要作用。第13页，共65页，2023年，2月20日，星期一五、RNApolII转录起始的调节1.由10－12个亚基组成2.最大亚基的C末端含有可磷酸化位点的T氨基酸残基（Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser）重复序列，称为CTD（CarboxylTerminalDomain）3.CTD是TFII－H的底物，磷酸化后与RNA链延伸有密切关系第14页，共65页，2023年，2月20日，星期一（一）顺式作用元件1.启动子真核基因启动子是RNA聚合酶结合位点周围的一组转录控制组件，至少包括一个转录起始点以及一个以上的功能组件。TATA盒GC盒CAAT盒第15页，共65页，2023年，2月20日，星期一2.增强子(enhancer)指远离转录起始点、决定基因的时间、空间特异性、增强启动子转录活性的DNA序列。3.沉默子(silencer)某些基因的负性调节元件，当其结合特异蛋白因子时，对基因转录起阻遏作用。第16页，共65页，2023年，2月20日，星期一定义：是能直接或间接地识别或结合在各顺式作用元件核心序列上，参与调控靶基因转录速率的一组蛋白质。结构：含有DNA结合域和转录活性区域。（二）反式作用因子

第17页，共65页，2023年，2月20日，星期一（二）反式作用因子

1.转录调节因子分类（按功能特性）*基本转录因子(generaltranscriptionfactors)是RNA聚合酶结合启动子所必需的一组蛋白因子，决定三种RNA(mRNA、tRNA及rRNA)转录的类别。第18页，共65页，2023年，2月20日，星期一*特异转录因子(specialtranscriptionfactors)为个别基因转录所必需，决定该基因的时间、空间特异性表达。转录激活因子转录抑制因子第19页，共65页，2023年，2月20日，星期一2.转录调节因子结构DNA结合域转录激活域TF蛋白质-蛋白质结合域（二聚化结构域）

谷氨酰胺富含域酸性激活域脯氨酸富含域第20页，共65页，2023年，2月20日，星期一最常见的DNA结合域

1.锌指(zincfinger)C——CysH——His常结合GC盒第21页，共65页，2023年，2月20日，星期一ZnCysHis第22页，共65页，2023年，2月20日，星期一

2.α-螺旋常结合CAAT盒第23页，共65页，2023年，2月20日，星期一碱性－亮氨酸拉链

Basic-Leucine-Zipper第24页，共65页，2023年，2月20日，星期一碱性－螺旋－环－螺旋

Basic-Helix/Loop/Helix第25页，共65页，2023年，2月20日，星期一（三）mRNA转录激活及其调节polⅡTFⅡHTAFTFⅡFTAFTAFTFⅡATFⅡBTBP真核RNA聚合酶Ⅱ在转录因子帮助下，形成的转录起始复合物。TFIID是唯一具有位点特异的DNA结合能力的因子。TATADNATBP相关因子是细胞特异的，与转录激活因子共同决定组织特异性转录第26页，共65页，2023年，2月20日，星期一真核基因转录激活调节是复杂的、多样的*不同的DNA元件组合可产生多种类型的转录调节方式；*多种转录因子又可结合相同或不同的DNA元件。*转录因子与DNA元件结合后，对转录激活过程所产生的效果各异，有正性调节或负性调节之分。第27页，共65页，2023年，2月20日，星期一六、RNApolII转录终止的调节转录终止于poly-A添加点以下0.5-2kb范围内的多处可能位点。HIV基因组转录终止调节病毒蛋白Tat是一抗终止蛋白，它与转录产物5’端特异RNA序列结合，并与宿主蛋白质、RNApolII相互作用，是延长中的RNA形成一定的二级结构，阻止HIV基因组转录提早终止第28页，共65页，2023年，2月20日，星期一七、转录后水平的调节（一）hnRNA加工成熟的调节在核内进行加工修饰，包括加帽、加尾、剪接、碱基修饰和编辑等。（二）mRNA运输、胞浆内稳定性的调节

1.mRNA的自身的特异序列与相关的调节蛋白相互作用

2.小分子RNA（dsRNA），miRNA与siRNA等。第29页，共65页，2023年，2月20日，星期一八、翻译水平的调节主要的调节点：起始阶段和延长阶段（一）翻译起始因子（eIF）活性的调节磷酸化可阻碍eIF的正常功能（二）RNA结合蛋白（RBP）对翻译起始的调节

IRE位于铁蛋白和ALA合酶的5’UTR

铁浓度低时，IRE-BP活化时，结合IRE阻碍小亚基与其始点结合，抑制翻译起始；铁浓度高时，IRE-BP不能结合IRE，翻译起始；蛋白质合成的调节结束第30页，共65页，2023年，2月20日，星期一3.2真菌的蛋白质分泌机制一、内质网在分泌途径发挥重要作用真核细胞有一个广泛的膜系统，包括内质网、高尔基体、小泡等，所有这些一起构成分泌系统或分泌途径。除分泌蛋白外，这套系统还有其它功能。对蛋白质进行修饰和组装；运送膜蛋白；储存Ca2+；合成并输送脂类；胞外多糖的合成和分泌。分泌途径与细菌的异同第31页，共65页，2023年，2月20日，星期一（一）核糖体与内质网的结合1)对于几乎所有的蛋白质而言，当合成它的核糖体与内质网结合时就决定了它将要进入分泌途径。在分泌能力强的真核细胞中，粗面内质网的含量非常丰富；反之，粗面内质网相对较少。第32页，共65页，2023年，2月20日，星期一2)粗面内质网由大量平行排列、相互连接的潴泡组成。这些潴泡的腔内空间在拓扑上与细胞质不同，而与胞外空间和液泡内空间等价。蛋白质一旦进入内质网腔后，再运送到胞外空间就不需要穿过膜了。3)大多数输入到内质网腔或膜上的蛋白会进入高尔基复合体，最后通过TGN（高尔基体反面管网）运输。蛋白质在高尔基体中可能会受到糖基化修饰。第33页，共65页，2023年，2月20日，星期一第34页，共65页，2023年，2月20日，星期一（二）蛋白质象货物一样在分泌系统中传送1)蛋白质包裹在从某个潴泡或区室上出芽的小泡中，穿过分泌系统，在下一个位点停泊并融合。2)小泡的形成需要特异的胞质蛋白自组装形成包被。小泡的出芽或融合都需要消耗GTP形式的能量。在停泊或融合时，小泡脱去蛋白包被，露出膜蛋白与目标膜的膜蛋白相互作用，从而结合在目标膜上。这些膜蛋白和包被蛋白都是蛋白质分选机制的一部分，决定了其专一性。指定运输路线第35页，共65页，2023年，2月20日，星期一3)运载蛋白的小泡在分泌系统的区室（如内质网、高尔基体等）间持续移动，而且前向(顺向，charged)运输和反向(逆向，empty)运输的量几乎相等，以保证各区室维持其特定的蛋白组成。4)每个区室自有的可溶性蛋白在小泡携带蛋白质顺向运输离开时必须停留在区室内。这种将区室的内在蛋白和货物蛋白分选的作用由膜蛋白完成。它一侧识别货物蛋白，另一侧(细胞质一侧)识别包被蛋白。确认货物第36页，共65页，2023年，2月20日，星期一第37页，共65页，2023年，2月20日，星期一5)小泡出芽后，与质膜融合，将其中所含的蛋白运送到胞外。第38页，共65页，2023年，2月20日，星期一（三）蛋白质进入分泌途径的依据是信号肽1)分泌蛋白的初生肽链在N端有一段由16-30个氨基酸组成的信号肽(signalpeptide)。由它引导多肽进入内质网膜，开始整个蛋白质转运到内质网腔的过程。所有的分泌蛋白、驻留在分泌系统区室的蛋白、分泌系统的膜蛋白以及液泡蛋白都有信号肽。第39页，共65页，2023年，2月20日，星期一2)信号肽的氨基酸序列不完全相同，但都具有共同的结构特征。典型的信号肽在N末端有一个或几个带正电荷的氨基酸，紧接着6-12个疏水氨基酸和几个附加氨基酸。不同分泌蛋白的信号肽是可以互换的，包括植物之间、植物、动物和真菌之间。分泌途径的元件只识别信号肽，而不管其后连接的氨基酸序列如何。第40页，共65页，2023年，2月20日，星期一蛋白信号肽序列凝集素MKMMSTRALALGAAAVLAFAAATAHAN孢子素MFILTRTTLSKWQRCIATMQPHN植物凝集素MASSNFSTVLSLALFLPLLTHANS第41页，共65页，2023年，2月20日，星期一3)在信号肽与内质网结合之前，它必须为信号识别颗粒(signalrecognitionparticle,SRP)所识别。SRP是一种核糖核蛋白复合体，含一条300个核苷酸的RNA分子，和6种蛋白质。SRP位于细胞质中，当新生肽链翻译到70个氨基酸长，露出核糖体表面的氨基酸序列长40个氨基酸时，SRP与信号肽结合。SRP中直接与信号肽结合的组分是P54蛋白，该蛋白是一种包含成簇的甲硫氨酸的GTP酶，凸出的甲硫氨酸侧链可以与信号肽的疏水核心结合。第42页，共65页，2023年，2月20日，星期一SRP与信号肽结合后新生肽链的合成立即停止，这种抑制作用由SRP上的P9和P14多肽完成。这是蛋白质合成中的重要控制步骤，可以避免新合成的蛋白质在细胞内发生错误的折叠。蛋白质的正确折叠需要分子伴侣的帮助，对于分泌蛋白而言，这些分子伴侣位于内质网腔中。许多分泌蛋白要在特定的天冬酰胺残基上进行糖基化，这也发生在内质网腔中，而且是正确折叠必需的。第43页，共65页，2023年，2月20日，星期一第44页，共65页，2023年，2月20日，星期一第45页，共65页，2023年，2月20日，星期一4)蛋白质有细胞质穿过内质网膜进入内质网腔需要SRP、内质网膜上的SRP受体以及转运复合体完成。SRP一方面通过信号肽与正在翻译的核糖体结合，另一方面又可以与内质网膜上的SRP受体结合，从而引导新生肽链和核糖体停靠在内质网膜上。SRP受体是由两条不同的GTP结合多肽组成的膜蛋白。停靠后SRP和受体的两条链之一利用GTP水解的能量与信号肽解离。此后，核糖体和新生肽链就停靠在转运复合体上，这是一种由三个内质网膜蛋白组成的跨膜通道蛋白。第46页，共65页，2023年，2月20日，星期一接着SRP受体就开始了将新生多肽链插入跨膜蛋白通道的过程。整个多肽链的转运需要GTP的进一步水解提供能量以及内质网中分子伴侣的帮助。新生肽链的翻译和转运是同时进行的，当肽链进入内质网腔后，信号肽被一种内质网腔中的酶复合体即信号肽酶切除。第47页，共65页，2023年，2月20日，星期一（四）整合膜蛋白的方向受拓扑序列指引1)内质网和高尔基体复合体膜，液泡膜和原生质体膜读含有现在粗面内质网合成，随后转运到相应位置的膜内在蛋白。那么这些蛋白在膜上的插入方向如何呢？2)只具有一个跨膜结构域的蛋白分为I型膜蛋白和II型膜蛋白。 I型膜蛋白的N端在胞外，C端在胞内；II型膜蛋白则相反。I型膜蛋白具有信号肽，在跨膜运输的中途转运停止，其疏水跨膜序列是“阻止转移子”或膜锚定序列(membraneanchorsequence)。II型膜蛋白不含需要切除的信号肽，其内部的疏水跨膜区域可以起到信号肽的作用，指导蛋白整合到内质网膜上，而且使C端位于内质网腔中。第48页，共65页，2023年，2月20日，星期一3)具有多个跨膜结构域的膜蛋白更为复杂，其跨膜结构域之间的环是亲水的。可能是第一个跨膜结构域的N端起信号肽的作用，第二个膜结构域则是膜锚顶序列，第三个又起信号肽的作用，依此类推。第49页，共65页，2023年，2月20日，星期一第50页，共65页，2023年，2月20日，星期一（五）内质网对蛋白的修饰是正确折叠和后续输送的基础1)内质网的内腔中有相当数量的酶和分子伴侣，它们可以保证蛋白质正确折叠，并可以将不完全的多肽降解掉不输出，这样就形成了一个质量控制系统。保证只有正确折叠和组装的蛋白被输出到目的地。质量控制第51页，共65页，2023年，2月20日，星期一2)内质网可以对新合成的蛋白进行如下修饰：特定氨基酸的修饰，如脯氨酸转变为羟脯氨酸。N糖基化。蛋白质的正确折叠。形成正确的二硫键。蛋白质的降解或重新转运到胞质中再被降解。第52页，共65页，2023年，2月20日，星期一3)并不是所有的蛋白质都要经过所有这些修饰，而且蛋白质在离开内质网后还可能发生其它的修饰。4)很多蛋白都有二硫键，由两个半胱氨酸残基与一种合适的氧化剂如氧化型的谷胱甘肽氧化而成。很多蛋白质并不只含有两个半胱氨酸，因此有可能形成错误的二硫键。这种错误由二硫键异构酶通过催化二硫键的打断与重新形成来纠正。第53页，共65页，2023年，2月20日，星期一第54页，共65页，2023年，2月20日，星期一（六）寡聚化和N-糖基化发生在内质网1)许多蛋白质并不是只由一条多肽链构成的，而是2个以上的亚基组成的寡聚体。蛋白质的寡聚化发生在内质网，而且在寡聚化之前，其单体是不能独自离开内质网的。菜豆蛋白(一种种子贮藏蛋白)三聚体的实验。第55页，共65页，2023年，2月20日，星期一第56页，共65页，2023年，2月20日，星期一2)许多分泌性蛋白和分泌系统的膜内在蛋白都是糖蛋白，含N连接(连在天冬酰胺)和O连接(连在丝氨酸、苏氨酸和羟脯氨酸)的聚糖(寡聚糖)。N糖基化的一部分发生在内质网内。内质网内的一些糖苷转移酶先将单糖逐个添加到焦磷酸多萜醇（长醇）上。然后由oligosaccharideproteintransferase将焦磷酸多萜醇寡聚糖上的糖基转移到多肽上，N糖基化转移的糖基通常为(葡萄糖)3(甘露糖)9(N-乙酰葡萄糖胺)2。第57页，共65页，2023年，2月20日，星期一当多糖转移到初生肽链之后，三个葡萄糖残基很快就有两个被切除。内质网中的分子伴侣钙连接蛋白和钙网蛋白可以与这样的寡糖链结合，并帮助糖蛋白折叠。这种结合可以帮助释放出一个正确折叠的蛋白质，并切除最后一个葡萄糖。如果释放的不是正确折叠的蛋白质，则该蛋白在与分子伴侣结合前必须重新在UDP-葡萄糖：糖蛋白糖基转移酶的作用下在寡糖链上重新添加一个葡萄糖分子，直到形成正确的折叠。正确折叠的糖蛋白不能在重新添加葡萄糖残基了。第58页，共65页，2023年，2月20日，星期一第59页，共65页，2023年，2月20日，星期一RepresentationofdifferenttypesofN-linkedglycans:(1)ThecommonprecursoroligosaccharideGlc3Man9GlcNAc2thatistransferredtotheN-glycosylationsiteonanewlyformedpolypeptidechaininalmostalleukaryoticorganisms;(2)thehigh-mannosestructureMan8GlcNAc2(isomerB),asubstrateforGolgi-locatedelongatingmannosyltransferasesinmanyyeastspeciesaswellasastructurethatisalsofoundonsomesecretedmammalianproteins;(3)abiantennary,core-fucosylatedcomplexNglycan,foundonmanymammalianproteins;(4)ahyperglycosylstructure,foundonS.cerevisiaesecretedproteins.Thegrey-shadedsugarresidueswithineachN-glycanrepresentthecommontrimannosyl-chitobiosecore(Man3GlcNAc2).第60页，共65页，2023年，2月20日，星期一（七）更复杂的N-糖基化发生在高尔基体中1)真菌中的N连接多糖主要为高甘露糖多糖，这种糖基化以(Man)6-9(GlcNAc)2结构为前体。也有类似植物中以木糖(Man)3岩藻糖(GlcNAc)2为核心的复杂多糖。或者由前者通过修饰衍生出来，这种修饰是在高尔基体内完成的。第61页，共65页，2023年，2月20日，星期一最初在内质网中与天冬酰胺连接的都是高甘露糖，只有一部分会在高尔基体中受到修饰。决定高甘露糖是否被修饰的因素尚不十分清楚，可能与多糖在蛋白质表面的展示方式以及与高尔基体中的酶促环境有关。哺乳动物中的复杂多糖与真菌中的糖蛋白不同，因此真菌糖蛋白注射到哺乳动物中会产生异常的免疫反应。第62页，共65页，2023年，2月20日，星期一第63页，共65页，2023年，2月20日，星期一第64页，共65页，2023年，2月20日，星期一RepresentationofN-glycosylationeventsintheER(upperpart)andtheGolgi(lowerpart).TheEReventsalsoincludeasimplifiedversionofthequalitycontrolcycle.Afterpartialdeglucosylationofprotein-boundN-glycansbyglucosidasesIandII,theunfoldedproteininteractswiththemembrane-boundlectinchaperonecalnexin(thereisnocalreticulininyeastandfungalsystems)viaitsmonoglucosylatedstructures.UponfinaldeglucosylationviaglucosidaseII,theglycoproteinisreleasedfromcalnexin.Ifincompletelyfolded,itsN-glycansarereglucosylatedbyUGGTsothattheunderlyingglycoproteincaninter