包涵体蛋白的提取与纯化

包涵体蛋白的提取与纯化摘要：随着基因重组技术的发展及越来越多的功能基因被发现和克隆,蛋白质异源表达已被广泛应用。大肠杆菌因遗传背景清楚、成本低、操作简单,且能高效表达外源基因等特点,是基础研究、临床应用及工业生产蛋白和多肽的首选表达系统。然而,重组蛋白在大肠杆菌中表达经常形成无活性的不溶性聚集物即包涵体。包涵体的形成有一定的优势,如具有高蛋白密度、易分离、易于毒性蛋白和宿主细胞致死蛋白表达等特点［1~3］。因此,如何将包涵体蛋白转变为具有活性的可溶蛋白是备受关注的问题。从包涵体中获得天然活性的重组蛋白一般包括三个步骤:包涵体的分离和洗涤、包涵体的溶解、包涵体蛋白的复性。本文综述了近年来包涵体蛋白分离纯化和色谱法复性技术研究进展,期望包涵体蛋白体外折叠这一难题早日解决。正文：1．包涵体的形成重组蛋白不论在原核细胞还是真核细胞中表达时，都可形成包涵体［4］。通常所说的包涵体是指重组蛋白在大肠杆菌中高效表达时形成的无活性蛋白聚集体，一般含有50%以上重组蛋白，其余为核糖体组分、RNA聚合酶，外膜蛋白等杂蛋白，以及质粒DNA、RNA片断、脂质、肽聚糖、脂多糖等成分［5，6］。由于包涵体在相差显微镜下为黑色斑点，所以也称为折射体(Refractilebody)［7］。包涵体形成的原因主要有以下几点:蛋白合成速度太快，以致于没有足够的时间进行折叠。蛋白折叠的动力学模型表明:蛋白质天然构象形成的速率取决于肽链的合成速率、折叠速率和聚集速率几个因素。中间体正确折叠是分子内的一级反应，而中间体的聚集是发生在分子间的二级或高级反应，因此，折叠中间体的浓度对聚集反应影响非常大［8］；:重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白，由于缺少真核生物的翻译后修饰系统(如糖基化等)，致使中间体大量积累，容易形成包涵体［9］；培养条件不佳和重组蛋白所处的环境也可导致包涵体形成，如发酵温度高，胞内pH接近蛋白的等电点等［10］；••二硫键在蛋白折叠中有重要作用，而大肠杆菌胞内的还原环境不利于二硫键的形成［2］；©包涵体不溶可能由于分子间无活性的B-片层含量高于天然结构或盐沉淀蛋白［11］。包涵体蛋白虽然不具有天然结构、没有活性，但在基因工程中生产重组蛋白，包涵体的形成有一定优势，主要表现在:重组蛋白高水平表达，有时候可达细胞总蛋白的30%［2］；；包涵体密度高(约1。3mg/ml)［12］，重组蛋白相对较纯，很容易与细胞成分分离，可减少后续纯化步骤；包涵体结构致密，因而在一定程度上避免了大肠杆菌蛋白酶的降解；易于毒性蛋白和膜蛋白表达［3，8］；包涵体的形成降低了重组蛋白在胞质中的浓度，有利于目的基因的进一步表达。基于这些特点，重组蛋白的包涵体表达已在商业化生产中得到广泛应用。2.包涵体蛋白的溶解和去折叠溶解包涵体目前最常用的方法是用变性剂如尿素(6~8mol/L)或盐酸胍(4~6mol/L)溶解，它们对蛋白质的氢键有较强的可逆性变性作用,可破坏蛋白质高级结构,或伸展肽链分子之间的相互作用,使其去折叠。尿素具有不电离、成本低、可直接进行SDS检测以及溶解的包涵体蛋白可选用多种色谱法纯化等优点被广泛应用,但尿素容易析出,作用时间较长或温度较高时会对蛋白质进行共价修饰。盐酸胍溶解包涵体能力较尿素强,作用快而不修饰蛋白,但成本高,酸性条件下易沉淀,还干扰离子交换色谱等。一般来说,用低浓度变性剂溶解包涵体得到的可溶性蛋白纯度比高浓度变性剂溶解的高,是因为变性剂浓度高时胞质颗粒蛋白也被释放出来[9]。包涵体溶解还可添加去污剂[23,25]、还原剂[15,26]、螯合剂[26]等,或在极端pH、高温条件下进行[18]。各种去污剂如SDS,CTAB,Tween20,NP40,TritionX-100,Sarkosyl月桂酰-N-甲基氨基乙酸钠)等常被用来溶解包涵体是因为其作用比盐酸胍和尿素更温和,溶解的蛋白质具有更多的有序结构,可能已经具有生物活性,避免了复性中的错误折叠。但是使用去污剂作为溶解剂可能会干扰后续纯化步骤[9]对于含有半胱氨酸的重组蛋白质,分离到的包涵体中常含有一些链间和链内非活性的二硫键,因此还原剂的使用非常重要。常用的还原剂有DTT、DTE、GSH、B-巯基乙醇，还原剂可以过量，以保证半胱氨酸还原完全。EDTA,EGTA等鳌合剂也被用来阻止金属离子催化的空气氧化反应,硫化物的形成或二硫化物混和物也可保护被还原的半胱氨酸[27]。利用极端pH也可溶解包涵体。Gavit等[18]将低pH([2.6)和高温(85e)相结合,并通过在位溶解的方式溶解抗真菌重组多肽包涵体。3．体外辅助蛋白质复性的方法蛋自折叠是垂组蛋自大规模复性的关键步骤I'SJ。日前,变性蛋白质体外复性的力一法k要有传统的辅助复性法如稀释法、透析法1'“1、超滤法｝'7］以及新发展的液相色谱(Lc)法或称为蛋自质折叠液相色谱法(PFLC),也有在此基础上模拟体内分子伴侣、折异酶、人」二分子伴侣、反胶束的辅助艾性方法。4.传统体外辅助蛋白质的复性稀释法、透析法和超滤法是蛋白质在溶液中直接进行体外蛋自复性的方法。其中稀释法是最简单、使用频率最高的蛋白质复性方法。通过加入复性缓冲液直接的、高倍数的降低变性剂浓度,为蛋自质提供折叠环境。可以说无论是利用模型标汀卜蛋白来研究变性蛋白的复性,还是重组的包涵体蛋自复性的研究,稀释法都是首选的方法。蛋白质折叠是分子内的一级反应过程,而聚集体的生成则为二级以上的反应过程。蛋白质的浓度的降低有利于提高蛋白质复性回收率,而当变性剂的浓度降低到一定程度时,一些抑制剂会失去抑制蛋白聚集的作用，从而导致蛋白重新聚集1'8,'9］。所以稀释复性过程中，稀释倍数也是一个非常关键的参数。但是,在稀释法复性过程,扫,稀释体积大比例的增加为复性蛋白的后处理带来了困难,通常回收率较低。透析法是利用小分子物质在溶液中可通过半透膜,一而大分子物质不能通过半透膜的性质,达到分离效果的方法。在蛋白质复性中可借助于蛋白质分离的同时,在去除溶液中分子量小的杂质而达到复性的目的。此法缺点是抓环费时,且在膜内目标蛋自仍会形成沉淀而聚集,'常被用于其它复性方法之后小分子物质去除。超滤法是一种膜滤法,以多孔的薄膜作为介质,利用薄膜两侧的压力差来分离溶液,不同分子量的物质。稀释法和透析法是常用于实验小量蛋白复性研究的两种方法。5.包涵体蛋白的色谱法体外折叠复性用变性缓冲液将难溶的包涵体溶解后,可根据重组蛋白分子大小、等电点、疏水性、溶解度和与其他物质的亲和性等特征,选择合适的方法进行进一步纯化和体外折叠复性。用于包涵体蛋白质复性的方法有稀释、透析、超滤、色谱、高压等。近年来发展起来的色谱法已成为基因重组蛋白质复性的重要手段[28]。用色谱法进行蛋白质复性可以有效地防止变性蛋白分子聚集,提高蛋白质的活性回收率。更大的优势是实现了蛋白质在复性的同时得到纯化,打破了必须先纯化再复性的限制,这是其他方法无可比拟的。用于蛋白质复性的液相色谱法主要包括尺寸排阻色谱(sizeexclusionchromatography,SEC、)亲和色谱(affinitychromatography,AFC)、离子交换色谱(ion-exchangechromatography,IEC)、疏水相互作用色谱(hydophobicinteractionchromatography,HIC)和扩张床吸附色谱(expandedbedadsorptionchromatography,EBA等。5．小分子添加剂在蛋白体外复性中的作用如上所述,各类的体外辅助蛋白质复性技术都能不同程度地促使蛋白质复性,但是蛋白质复性效率的提高仍然是个难点。当蛋白在体外复性时,蛋自质复性效率实际上取决于正确折叠过程与聚集过程之间的竞争,即天然活性蛋白质形成与聚集体的形成之间的竞争。聚集体的形成常常被认为是有一个“熔球态”的中间态,它的形成是由于疏水基团的暴露,使其自身容易发生聚集的结果。为此发展一些不同添加剂复性的方法,可以通过添加些小分了促进剂来辅助蛋白折叠,抑制聚集体的形成。其主要以促进蛋白折叠过程中正确的天然结构的稳定性、促进折叠中间产物的溶解性以及减少错误折叠，增加复性蛋白的稳定性为目的。小分子添加剂有以下6类:①表面活性剂或去垢剂:早期用3-(3-胆胺丙基)二甲氨基-1-丙磺酸、Tritionx-100、磷脂、脱氧胆酸钠等一类小分子作为添加剂。实验的结果显示,这类小分子试剂在一定程度上可以促进蛋白质的折叠,但是有一个非常难以克服的困难是这些试剂难以除去。助溶剂:聚乙醇系列(PEG6000—200)。添加此类小分子,可以和蛋折叠中间产物特异结合,形成非聚集形式的化合物,同时这些化合物的存在大大少减少了蛋白分子之间的结合机会,从而更进一步的减少蛋自聚集形式的形成。6.亲和色谱(AFC)亲和色谱是基于固定相的配基与生物大分子之间生物亲和能力的不同来进行生物大分子相互间分离的方式。金属螯合色谱是近年来发展起来的一种通用型配体亲和技术,它将金属离子Cu2+、Zn2+、Ni2+等结合到固定相上，这些离子可与组氨酸、半胱氨酸形成配位键,因此含有这些氨基酸的蛋白质将吸附到亲和色谱的固定相上。目前在重组蛋白研究中应用比较普遍的是在目的蛋白的N-端或C-端增加6个组氨酸的标签,在高浓度变性剂存在的情况下,组氨酸仍可吸附在金属亲和介质上,所以可直接在柱上进行复性与纯化。Ito等[33]采用IMAC对E.coli表达的(His)6-LECT2进行了复性，以Ni-NTA为固定相降低脲浓度-向溶液中加入GSH/GSSG使二硫键交换-空气中将巯基完全氧化的三步复性方法,使单体的浓度增加到81%。Yin等［34］以重组牛朊病毒的八肽重复序列为天然的亲和标签,采用Ni-NTAIMAC柱对重组牛朊病毒进行了柱上复性，得到了结构正确的目标蛋白，其质量回收率为11%°Lemercier等［35］用IMAC对外用聚磷酸酶进行了复性,并研究了不同变性剂去除速率对其复性的影响。Al-Samarrai等［16］利用IMAC对拟南芥转录因子RGL3包涵体进行了成功复性。7.离子交换色谱变性蛋白质与离子交换介质有分子间的电荷作用,从而被吸附到固定相表面,在洗脱除去变性剂时蛋白质进行吸附-解吸附-再吸附的复性。刘红妮等［36］采用弱阳离子交换色谱法对溶菌酶进行了复性,并详细研究了多种因素对复性的影响。Langenhof等［37］采用强阴离子交换色谱对含17对二硫键的变性牛血清白蛋白进行了复性,并证实延长进样后放置时间可提高回收率。Machold等［38］研究了离子交换色谱填料种类、柱几何形状和进样量等对A-乳白蛋白的复性影响，并采用两种不同的色谱复性模式对A-乳白蛋白进行了复性:一种是将变性蛋白洗脱下来后,向其中加入氧化/还原试剂对,使其完全复性;另一种是在流动相中加入氧化/还原试剂对,在洗脱过程中完成复性。Lu等［39］用弱阴离子交换色谱法,以DEAESepharoseFF为固定相，对重组双重人干细胞因子（rdhSCF）进行了复性并同时纯化，所得复性率为19.46%,纯度为90%。Machold等［20］利用离子交换色谱有效分离了重折叠的A-乳清蛋白与聚集蛋白。并将离子交换色谱和超滤、稀释操作相结合，对紧密聚集的A-乳清蛋白进行循环收集复性,产率可从25%提高到30%。8.疏水相互作用色谱(HIC)疏水色谱是在不带电荷的载体上偶联疏水基团,不同蛋白质的疏水区与这些疏水基团作用,从而将蛋白质分离的一种色谱技术。变性蛋白表面的疏水氨基酸残基有与疏水色谱固定相颗粒相互作用的倾向,二者之间的疏水相互作用能够抑制变性蛋白分子间的相互聚集,同时疏水色谱固定相还能在分子水平上给变性蛋白分子提供高的能量,使其瞬时脱水并折叠成天然构象或不同的折叠中间体。疏水色谱柱形成局部疏水环境以利于蛋白质分子形成疏水核,并由此开始折叠复性。耿信笃等［40］利用自己设计的疏水色谱柱对重组人干扰素-C进行纯化和柱上复性,所得纯度大于95%,比活大于107U/mg。参考文献[1]LilieH,SchwarzE,RudolphR.Advancesin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