色谱指纹图谱评价

主要内容◆

色谱指纹图谱的缘起、属性、特点和作用◆

中药色谱指纹图谱方法学◆

中药色谱指纹图谱试验的规范化◆

中药色谱指纹图谱的定性评价方法◆

应用实践2023/4/121第一页，共39页。◆

色谱指纹图谱的缘起、属性、特点和作用2023/4/122第二页，共39页。中药质量控制现状《中国药典》关于药材所收录的信息【浸出物】【炮制】【性味与归经】【名称】【性状】【鉴别】【检查】【含量测定】【功能与主治】【用法与用量】【贮藏】【来源】宏观特征鉴别微观特征鉴别生药学动物分类学植物分类学矿物学微生物分类学药物分析学经验鉴别定性鉴别含量测定指标成分、对照药材2023/4/123第三页，共39页。齐墩果酸、熊果酸、大黄酸、槲皮素、小檗碱目前中药质量控制的局限●缺乏化学对照品●化学对照品缺乏专属性●物质群体间的量化特征无法体现黄柏、黄连——小檗碱、巴马亭的比例人参、西洋参或三七——几种人参皂苷的比例●中药整体的用药的特色无法体现2023/4/124第四页，共39页。中药色谱指纹图谱的提出●

中药依赖其所含的多种化学成份发挥疗效●

任何单一的活性成份或指标成份都难以有效地评价中药的真伪优劣●

利用现代分析技术分析不同中（成）药的整体特征以提高鉴别的准确性——色谱指纹图谱分析（ChromatographicFingerprintAnalysis）——梁逸增（中南大学）

2023/4/125第五页，共39页。中药色谱指纹图谱的特点及属性

中药指纹图谱同传统鉴别方法的区别在于：它不是从一个“点”，而是从一个二维的“面”（一个在特定条件下的完整色谱的整体特征信息）来鉴别真伪，同时在定量操作的前提下，得到“量”方面的信息还可以估量待测样品之间总体量的差别，从而从量的角度给以动态的质量评价。

色谱指纹图谱不强调个体的绝对唯一性，而强调统一药材群体的相似性，及物种群体内的唯一性2023/4/126第六页，共39页。中药色谱指纹图谱的特点及属性整体性模糊性对照样品与待测样品指纹图谱的相似性，而不是完全相同比较色谱的“完整面貌”，在不同环境的样品色谱中搜索和提取与该药材指纹图谱“面貌”相关的特征，加以区别因此，中药色谱指纹图谱强调的是准确的辨认，而不是精确的计算2023/4/127第七页，共39页。◆

中药色谱指纹图谱方法学2023/4/128第八页，共39页。柱色谱ColumnChromatography平面色谱PlanarChromatography液相色谱LiquidChromatography(LC)气相色谱GasChromatography(GC)薄层色谱ThinLayerChromatography(TLC)毛细管电泳CapillaryElectrophoresis（CE）2023/4/129第九页，共39页。反相高效液相色谱(RP-HPLC)ReversedPhaseHighPerformanceLiquidChromatography●适用范围广●分离性能好●分析速度快●流动相选择范围宽●灵敏度高●色谱柱可多次重复使用●流出组分可以收集●采用多种检测器，可同时获取保留值信息和化合物的光谱、值谱信息对较为复杂的色谱实验条件要求比较苛刻，由此带来不同实验室之间重现性的难度增大2023/4/1210第十页，共39页。薄层色谱ThinLayerChromatography(TLC)●可在同板同时分析多达18个样品，时效高●所用的是正相展开剂，其组成变化灵活，可适应多种成分的分离●离线操作，即可直观比较图谱，又可扫描得到轮廓图和处理数据●占机时间短●具有色彩参数，可获得色彩丰富的色谱图像，直观性强；同时辅以功能团显色剂还可提示成分的类别，提高鉴别的专属性。●展距局限在10cm~20cm

，‘柱效’相对较低，对复杂组分不提高分离度则难以提取指纹特征的药材受到限制。●开放系统，对环境温度、相对湿度要求较高2023/4/1211第十一页，共39页。气相色谱GasChromatography(GC)●分离效能高●分析速度快●适用于植物的挥发油成分及其它易挥发性成分或可转化为可挥发的成分测定●可提供保留值信息，与质谱联用，还可提供更丰富的化学结构信息分辨率高，得到的色谱组份非常复杂，尤其是含挥发油药材，单萜类成分组成很不稳定，样品间差异可能很大，处理数据和判别相似度时一定程度的取舍毛细管电泳CapillaryElectrophoresis●分离效能高●分析速度快●高分辨率●可与紫外、荧光、电化学、质谱、拉曼光谱等联用，可提供更丰富的化学结构信息2023/4/1212第十二页，共39页。◆

中药色谱指纹图谱试验的规范化2023/4/1213第十三页，共39页。中药指纹图谱的建立指纹图的获取方法验证指纹图的校验和复核中药材指纹图谱饮片指纹图谱中药提取物指纹图谱中药生产中间产品指纹图谱中药各类制剂和相关产品指纹图谱中药指纹图谱2023/4/1214第十四页，共39页。指纹图谱的获取指纹图谱建立和辨识指纹图谱试验研究对照品（参比物）供试品收集供试品制备2023/4/1215第十五页，共39页。供试品的收集真实性、代表性；收集量不少于10批原始纪录药材名称供试品来源药材名称收集时间及收集人货源情况调查基原鉴定及鉴定人质量评估供试品的留样、贮藏和标签◆

原料药材2023/4/1216第十六页，共39页。◆

半成品原始纪录半成品名称混批前批号日期提取方法（关键技术）混批后批号中药指纹图谱供试品的留样、贮藏和标签2023/4/1217第十七页，共39页。◆

成品原始纪录供试品批号生产单位供试品数量供试品的留样、贮藏和标签2023/4/1218第十八页，共39页。供试品制备取样称样制备定容放置标签避光、低温、密闭容器条件下短期放置标示浓度溶剂萃取、固相萃取、其他方法供试品与选样1:10具有代表性与药材标号一致2023/4/1219第十九页，共39页。对照品（参照物）◆

对照品（参照物）的作用

考察指纹图谱的稳定程度和重现性有助于指纹图谱的辨认◆

对照品（参照物）的选择供试品种的活性成分或指标成分指纹图谱中的稳定的指纹峰内标物◆

对照品（参照物）溶液制备2023/4/1220第二十页，共39页。色谱方法选择的原则♦

专属性

建立的指纹图谱必须能够表达该品种的特征♦

重现性

同一品种同一样品指纹图谱中构成指纹特征的各特征峰（或斑点）作为整体（峰位、峰数、峰的丰度、各峰的大致比例）在不同实验室和不同操作者之间得到的色谱整体特征应有较高的相似度♦

普遍适用性

色谱方法和实验条件应易于推广和便于操作指纹图谱的实验研究2023/4/1221第二十一页，共39页。中药指纹图谱实验研究的基本要求♦

实验室基本要求●实验室应具备承担指纹图谱测定的总体能力●

试验设备通过检验证明符合指纹图谱实验研究的需要●

技术人员具备从事指纹图谱实验研究的能力●

对实验室的技术能力评价应由定期的内部独立检查●试验数据有可追溯，与其它实验室有可比性●实验室应有质量保证体系，以确保各种措施的透明与一致2023/4/1222第二十二页，共39页。♦

仪器

性能能够满足指纹图谱实验需要需经校验♦

试验方法和试验条件优选的目的

选取相对简单易行的方法和条件，获取足以代表品种特征的指纹图谱，以满足指纹图谱的专属性、重现性和普遍适用性的需要2023/4/1223第二十三页，共39页。试验需考察的内容♦

液相色谱

●

色谱柱：比较试验加以选择2023/4/1224第二十四页，共39页。●

流动相：至少用三种不同组成比较流动相1流动相2流动相32023/4/1225第二十五页，共39页。●

适宜的柱温和检测波长2023/4/1226第二十六页，共39页。♦

薄层色谱

●

展开剂系统：至少需作三种进行比较●

考察湿度和温度的影响2023/4/1227第二十七页，共39页。♦

气相色谱

●色谱柱：选择适宜色谱柱●升温程序设定样品的预处理不同提取方法比较样品预处理前后比较2023/4/1228第二十八页，共39页。中药指纹图谱的方法验证♦

目的

考察和证明采用的指纹图谱测定方法具有可靠性和可重复性，符合指纹图谱的要求。♦

验证内容

●

专属性

●准确度（结果准确度和系统准确度）

●精密度（重复性、中间精密度、重现性）

●范围

●稳健性（耐用性）2023/4/1229第二十九页，共39页。●

专属性（Specificity）

指纹图谱的测定方法对中药样品的分析鉴定能力专属性的考察参数

＆峰纯度＆总峰响应值

＆容量因子分布＆最难分离物质对的分离情况

＆总分离效能

此外，还需评价有关样品（药材、中间体、制剂和相关产品）见的相关性，并尽可能显示出样品中特征响应2023/4/1230第三十页，共39页。●

准确度（Accuracy）

测定系统所的指纹图谱与“对照用指纹图谱”之间的相近程度

系统准确度仪器的操作指标与波动范围样品在分析系统中的残留和对基线的响应色谱分离情况（峰纯度、再现程度、峰型变化描述）指标成分的定量内容结果准确度

多批次（10批以上）样品测定结果的相似度2023/4/1231第三十一页，共39页。●

精密度（Precision）

规定条件下对均质样品多次取样进行一系列检测结果有相近程度（离散度）

重复性（Repeatability）

同样的操作条件下在较短的时间间隔的精密度线性范围内至少测定9次或100％的试验浓度下测定6次

中间精密度（IntermediatePrecision）

实验室内部条件改变测定的精密度

重现性（Reproducibility）

不同实验室间的精密度2023/4/1232第三十二页，共39页。●

范围（Range）

样品中被分析组分的较高浓度和较低浓度的一个区间，并已证实在此区间内，该方法具有合适的准确度和精密度

相似度维持在0.9以上的浓度范围位指纹图谱测定范围●

稳健性（Robustness）

不同条件下分析同一样品所得结果的变化程度，是中药指纹图谱测定方法耐受环境变化的显示2023/4/1233第三十三页，共39页。指纹图谱实验操作规程◆

高效液相色谱指纹图谱实验操作规程◆薄层色谱指纹图谱实验操作规程◆气相色谱指纹图谱实验操作规程◆毛细管电泳指纹图谱实验操作规程2023/4/1234第三十四页，共39页。◆

中药色谱指纹图谱的定性评价方法2023/4/1235第三十五页，共39页。中药指纹图谱整体评价方法面临的难题?没有足够的标样，能否进行可靠的中药多组份的定性定量分析？能否建立起基于中药的色谱指纹图谱中要质量的评价标准？?如何对待色谱峰保留时间的漂移？?如何对待色谱分析仪器的背景与基线的漂移？?如何选取合适的内标化合物？如果难于选取，是否存在其他的方法来解决此问题??如何处理色谱图中大量的未知成分2023/4/1236第三十六页，共39页。中药指纹图谱的信息意义

表达中药复杂混合体系中各种不同化学成分浓度分布的整体状况中药指纹图谱的标准建立与矢量相似度量原理相关系数：反应的是变化趋势