生物化学第九

生物化学第九第1页，共58页，2023年，2月20日，星期一Reversetranscription第2页，共58页，2023年，2月20日，星期一第一节DNA的生物合成一、DNA的半保留复制复制时期

1.半保留复制的证明第3页，共58页，2023年，2月20日，星期一2.DNA生物合成的基本问题

模板引物

dNTPDNA聚合酶

Mg2＋在5’-3’方向延伸二、原核细胞DNA的复制合成

1.原核DNA聚合酶2.复制的复杂性第4页，共58页，2023年，2月20日，星期一5’5’3’3’第5页，共58页，2023年，2月20日，星期一

酶作用DNA聚合酶Ⅰ5‘－3’聚合酶及外切酶作用，3‘－5’外切酶酶作用，可校正/修复DNA链，还可切除引物DNA聚合酶Ⅱ5‘－3’聚合酶及3‘－5’外切酶酶作用，可校正/修复DNA链DNA聚合酶Ⅲ与酶Ⅰ作用类似，酶活高，是主要的链延伸酶（聚合酶replicase）第6页，共58页，2023年，2月20日，星期一

冈崎片段与半不连续复制（okazaki1968年）第7页，共58页，2023年，2月20日，星期一

复制方向：单起点、双向或单向复制引物（primer）及引物酶(primase)

引物的切除与连接

5’－3’外切酶切除引物（DNA聚合酶Ⅰ

）

DNA连接酶

（大肠杆菌DNA连接酶/T4连接酶）复制的起始辨识起点（富含AT区）解旋（拓扑异构酶）解链单链结合蛋白（SSB）第8页，共58页，2023年，2月20日，星期一第9页，共58页，2023年，2月20日，星期一三、真核DNA的复制合成

真核DNA的合成的基本过程类似于原核DNA，不同之处：

多复制起点至少有五种聚合酶αβγδε

端粒的复制依赖于端粒酶真核生物DNA聚合酶

αβγδε亚基数44425分子量（KD)＞25036-38160-300170256细胞内定位核核线粒体核核5′→3′聚合活性＋＋＋＋＋3′→5′外切活性－－－－－

功能复制、引发修复复制复制复制第10页，共58页，2023年，2月20日，星期一第11页，共58页，2023年，2月20日，星期一DNA复制过程第12页，共58页，2023年，2月20日，星期一真核生物DNA复制叉结构示意图第13页，共58页，2023年，2月20日，星期一四、反转录作用（RNA指导下的DNA合成）1970年，Temin和Baltimore在致癌RNA病毒中发现了反转录酶（ReverseTranscriptase）

1.DNA聚合酶特性

需引物（tRNA）、dNTP、模板（RNA、DNA）、5’-3’方向聚合2.杂交分子H键断开

常由核糖核苷酶H（RNAaseH）专一切除RNA-DNA分子中的RNA,全部或部分去除RNA3.前病毒DNA

合成的DNA链称负链,然后由依赖DNA的DNA聚合酶催化下,以负链为模板合成一正链这样形成的DNA称前病毒DNA,前病毒DNA可嵌入宿主细胞DNA中(称整合)或潜伏于宿主细胞用其负链(依赖DNA的RNA聚合酶)出RNA,合成外壳蛋白.1第14页，共58页，2023年，2月20日，星期一五、DNA的损伤与修复1.DNA的损伤与突变

损伤可造成突变或致死突变（mutation）：指一种遗传状态，可以通过复制而遗传的DNA结构的任何永久性改变。携带突变基因的生物称为突变体，未突变的称为野生型。损伤原因物理（紫外（见下页）、高能射线、电离辐射）化学（烷基化试剂、亚硝酸盐、碱基类似物）生物因素（碱基对置换、碱基的插入/缺失造成移码）第15页，共58页，2023年，2月20日，星期一当DNA受到大剂量紫外线（波长260nm附近）照射时，可引起DNA链上相邻的两个嘧啶碱基共价聚合，形成二聚体，例如TT二聚体。第16页，共58页，2023年，2月20日，星期一2.DNA损伤修复光复活切除修复重组修复SOS修复第17页，共58页，2023年，2月20日，星期一光复活（photoreactivation）可见光（最有效波长400nm）激活生物界广泛分布（高等哺乳动物除外）的光复活酶，该酶分解嘧啶二聚体。是一种高度专一的修复形式，只分解由于UV照射而形成的嘧啶二聚体。第18页，共58页，2023年，2月20日，星期一切除修复（excisionrepair）即在一系列酶的作用下，将DNA分子中受损伤的部分切除掉，并以完整的那一段为模板，合成出切去的部分，从而使DNA恢复正常。这是一种比较普遍的修复机制。细胞的修复功能对于保护遗传物质DNA不受破坏有重要意义。第19页，共58页，2023年，2月20日，星期一重组修复（recombinationrepair）又称复制后修复（postreplicationrepair）受损伤的DNA在进行复制时，跳过损伤部位，在子代DNA链与损伤相对应部位出现缺口。通过分子间重组，从完整的母链上将相应的碱基顺序片段移至子链的缺口处，然后再用合成的多核苷酸来补上母链的空缺，此过程即重复修复。并非完全校正。第20页，共58页，2023年，2月20日，星期一SOS修复指DNA受到严重损伤、细胞处于危急状态时所诱导的一种DNA修复方式，修复结果只是能维持基因组的完整性，提高细胞的生成率，但留下的错误较多，又称倾错性修复（Error-ProneRepair）。第21页，共58页，2023年，2月20日，星期一3.基因重组与DNA克隆（基因工程）限制性内切酶

能识别DNA特定核苷酸序列的核酸内切酶分布：主要在微生物中。特点：特异性，即识别特定核苷酸序列，切割特定切点。结果：产生黏性未端（碱基互补配对）。举例：大肠杆菌的一种限制酶能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开。第22页，共58页，2023年，2月20日，星期一一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并在特定的切割点上将DNA分子切断。目前已发现的限制酶有400～500多种。第23页，共58页，2023年，2月20日，星期一运载体种类：质粒、噬菌体和动植物病毒。质粒的特点:细胞染色体外能自主复制的小型环状DNA分子；质粒是基因工程中最常用的运载体；最常用的质粒是大肠杆菌的质粒；存在于许多细菌及酵母菌等生物中；质粒的存在对宿主细胞无影响；质粒的复制只能在宿主细胞内完成。第24页，共58页，2023年，2月20日，星期一

DNA重组与克隆①从细胞中分离出DNA①②③④⑤⑥②限制酶截取DNA片断③分离大肠杆菌中的质粒④DNA重组⑤用重组质粒转化大肠杆菌⑥培养大肠杆菌克隆大量基因⑦重组体的筛选第25页，共58页，2023年，2月20日，星期一PCR(polymeraseChainreaction)聚合酶链式反应PCR也称体外酶促基因扩增，原理类似天然DNA复制。靶DNA分子变性后解链，两条单链DNA分别与两条引物互补结合，在4种dNTP存在和合适和条件下，由耐热的TaqDNA聚合酶催化引物由5’

－3’

扩增延伸，形成两条新的双链DNA分子，并作为下一循环的模板。每经过一个变性、复性、延伸循环，模板DNA增加一倍。经过30～50个循环，可使原DNA量增加106～109倍。PCR的主要步骤：•模板DNA的变性一般选用95℃左右1min，使DNA双链解为单链•

复性按引物实际情况确定适当温度，时间一般30s至1.5min•

延伸一般72℃1min•

循环数按初始模板浓度确定，一般25－45之间第26页，共58页，2023年，2月20日，星期一第27页，共58页，2023年，2月20日，星期一PCR的引物设计

PCR扩增产物的特异性主要由引物决定，引物的设计是PCR成功的关键，•

引物位置和产物长度根据不同目的和要求确定，长度一般在200～800bp之间•

引物的长度一般为18～25bp•

末端核苷酸

3’端不得有任何修饰•G＋C含量和Tm值一般在40－60%之间，两条相差2－3℃第28页，共58页，2023年，2月20日，星期一第二节RNA的生物合成DNA携带的遗传信息（基因）传递给RNA分子的过程称转录（transcription

）。在生物界，RNA合成有两种方式：一是DNA指导的RNA合成，此为生物体内的主要合成方式。另一种是RNA指导的RNA合成，此种方式常见于病毒。转录产生的初级转录本是RNA前体（RNAprecursor），需经加工过程（processing）方具有生物学活性。

第29页，共58页，2023年，2月20日，星期一反应体系：DNA模板,NTP,酶，Mg2+,Mn2+，合成方向5'→3'。连接方式--3',5'磷酸二酯键。转录特点：不对称转录--DNA片段转录时，双链DNA中只有一条链作为转录的模板，这种转录方式称作不对称转录。模板链(templatestrand)及反意义链(antisensestrand):指导RNA合成的DNA链为模板链，又称反意义链。

编码链(codingstrand)及有意义链(sensestrand)：不作为转录的另一条DNA链为编码链，又称有意义链。由于基因分布于不同的DNA单链中，即某条DNA单链对某个基因是模板链，而对另一个基因则是编码链。原料：四种磷酸核苷NTP,DNA中的T在RNA合成中变为U合成过程:连续，方向：5‘→3’从头合成,5´—末端的起始核苷酸常为GTP或ATP一、转录基本特点第30页，共58页，2023年，2月20日，星期一第31页，共58页，2023年，2月20日，星期一第32页，共58页，2023年，2月20日，星期一不对称转录“转录单位”（transcriptionunit）

以操纵子（operon）为转录的功能单位,结构上包括四个功能区：多顺反子（结构基因区）、启动子、操作子、终止子和调节基因。原核RNA聚合酶转录过程二、原核细胞RNA转录合成特点第33页，共58页，2023年，2月20日，星期一调节基因启动子操纵基因lacZlacYlacACAPcAMPCAP-cAMP复合物mRNA+-半乳糖苷酶-半乳糖苷透过酶-半乳糖苷乙酰基转移酶酶forward第34页，共58页，2023年，2月20日，星期一

大肠杆菌的RNA聚合酶全酶由5种亚基α2ββ’σ

组成，σ因子与其它部分的结合不是十分紧密，它易于与β’βα2分离，没有σ、亚基的酶称为核心酶——只催化链的延长，对起始无作用。五种亚基的功能分别为：

α亚基：与启动子结合功能。

β亚基：含催化部位，起催化作用，催化形成磷酸二酯键。

亚基：在全酶中存在，功能不清楚。

β’亚基：与DNA模板结合功能。

σ亚基：识别起始位点。

第35页，共58页，2023年，2月20日，星期一识别解链起始延伸终止第36页，共58页，2023年，2月20日，星期一1.起始位点的识别

σ识别正确的启动位点，启动子的结构至少由三部分组成：-35序列提供了RNA聚合酶全酶识别的信号；-10序列是酶的紧密结合位点（富含AT碱基，利于双链打开）；第三部分是RNA合成的起始点。3’5’+1转录起始点AACTGTATATTATTGACATATAAT5’3’－35序列

Sextama框

－10序列Pribnow框2.转录起始加入的第一个核苷三磷酸常是GTP或ATP。所形成的启动子、全酶和核苷三磷酸复合物称为三元起始复合物，第一个核苷三磷酸一旦掺入到转录起始点，σ亚基就会被释放脱离核心酶。第37页，共58页，2023年，2月20日，星期一-35-10pppG或pppA5‘5‘3‘3‘模板链E3.链的延伸以NTP为原料和能量,DNA模板链为模板，靠核心酶的催化，核苷酸间通过3´,5´-磷酸二酯键成核糖核酸链(RNA)第38页，共58页，2023年，2月20日，星期一4.转录终止转录终止信号有两种情况弱终止子：依赖ρ因子（终止因子，terminators）的终止

NusA蛋白识别DNA链上的终止信号，在ρ因子帮助终止。

强终止子：（1）在终止点之前具有一段富含G-C的回文区域。（2）富含G-C的区域之后是一连串的dA碱基序列，它们转录的RNA链的末端为一连串U（连续6个）。第39页，共58页，2023年，2月20日，星期一三、真核生物的转录作用酶类分布产物活性分子量(KDa)反应条件ⅠⅡⅢ核仁核质核质rRNA（5.8S、18S、28S）mRNAtRNA、5SrRNA50～70％20～40％10％500～700～700低离子强度要求Mg2+或Mn2+高离子强度高Mn2+浓度1.真核RNA聚合酶2.转录真核RNA转录基本过程与原核类似，但其产生的mRNA为“单顺反子”，只编码一条肽链。第40页，共58页，2023年，2月20日，星期一四、转录过程的选择性抑制剂放线菌素D利福平α－鹅膏蕈碱原核抑制抑制不抑制真核抑制不抑制抑制RNA聚合酶Ⅱ第41页，共58页，2023年，2月20日，星期一五、转录产物的“加工”（成熟过程）

在细胞内，由RNA聚合酶合成的原初转录物（primarytranscript）往往需要一系列的变化，包括链的裂解、5和3末端的切除和特殊结构的形成、核苷的修饰、以及拼接和编辑等过程，才转变为成熟的RNA分子。此过程总称为RNA的成熟或称为RNA的转录后加工。原核生物的mRNA转录后一般不需要加工，转录的同时即进行翻译（半寿期短）。rRNA前体的转录后加工tRNA前体的加工真核mRNA前体的加工

第42页，共58页，2023年，2月20日，星期一rRNA前体的加工

rRNA基因之间以纵向串联的方式重复排列。

加工过程：

1、剪切作用：需核酸酶参与。

2、甲基化修饰：修饰在碱基上。

3、自我剪接：一种核酶的作用。

原核rRNA加工：rRNA含非转录的间隔区，其产物中含tRNA

真核rRNA加工：

1.5S自成体系加工少无修饰和剪接。

2.45S加工中含剪切和甲基化修饰，需核酸酶。第43页，共58页，2023年，2月20日，星期一大肠杆菌rRNA前体加工真核生物rRNA前体加工第44页，共58页，2023年，2月20日，星期一tRNA前体的加工tRNA前体在tRNA剪切酶的作用下，切成一定在小的tRNA分子

3’末端加上CCA碱基的修饰：甲基化、脱氨和还原作用第45页，共58页，2023年，2月20日，星期一第46页，共58页，2023年，2月20日，星期一

真核mRNA前体的加工剪接（Splicing）

去除内含子，连接外显子5’帽端结构的生成（如图）3’端多聚A（polyA）的附加第47页，共58页，2023年，2月20日，星期一第48页，共58页，2023年，2月20日，星期一六、RNA的复制合成（RNA指导的RNA合成）噬菌体Qβ的RNA复制两阶段（1）其单链RNA可充当mRNA，利用寄主中的核糖体合成外壳蛋白和RNA复制酶的β亚基。（2）复制酶的β亚基可与来自寄主细胞的亚基αδ自动装配成RNA复制酶，可进行RNA的复制，以分子中单链RNA为模板（正链），复制出一条新的RNA链（负链），再复制出正链，与外壳蛋白组装成新的噬菌体颗粒。某些RNA病毒可以以自身RNA为模板进行复制。不同的RNA病毒复制方式不同5RNA-533RNA+释放释放353355RNA+RNA+RNA-RNA-及

RNA+的合成方向均为5‘3’第49页，共58页，2023年，2月20日，星期一核酶

1982年Cech发现四膜虫rRNA前体自我剪接作用，RNA有催化作用;1983年发现RNaseP中的RNA可催化tRNA前体的加工。

核酶我切割区内有锤头结构（hammer-headstructure），其中的结构特点是：

（1）三个茎区形成局部的双链结构；其中含13个保守的核苷酸，N代表任何核苷酸。

（2）图中的箭头表示自我切割位点，位于GUX的X外侧，X可表示为C、U或A，不能是G。核酶的生物学意义

1.RNA为生物催化剂，具有重要生物学意义。

2.打破了酶是蛋白质的传统观念。

3.在生命起源问题上，为先有核酸提供了依据。

4.为治疗破坏有害基因，肿瘤等疾病提供手段。第50页，共58页，2023年，2月20日，星期一七、基因表达转录调控方式基因表达调控概述原核生物以操纵子为单元进行表达和调控，特异的阻遏蛋白是控制原核启动序列活性的重要因素。

乳糖操纵子的调节机制色氨酸操纵子的调节机制第51页，共58页，2023年，2月20日，星期一I－调节基因P－启动子O－操作子（操作基因）Z、Y、A－三种结构基因第52页，共58页，2023年，2月20日，星期一阻遏蛋白的负性调节

当无诱导物乳糖存在时，调节基因编码的阻遏蛋白（repressorprotein）处于活性状态，阻止RNA聚合酶与启动基因的结合，则无法启动转录。当有乳糖存在时，lac操纵子（元）即可被诱导。乳糖进入细胞，经β－半乳糖苷酶催化，转变为半乳糖。后者作为一种诱导剂分子结合阻遏蛋白，使蛋白构象变化，导致阻遏蛋白与O序列解离、转录发生。异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）是一种作用极强的诱导剂，不被细菌代谢而十分稳定，因此被实验室广泛应用。

CAP（代谢产物活化蛋白）的正性调节

当没有葡萄糖及cAMP浓度较高时，cAMP与CAP结合，这时CAP结合在lac启动序列附近的CAP位点，可刺激RNA转录活性。葡萄糖的分解代谢产物能抑制腺苷酸环化酶活性并活化磷酸二酯酶，从而降低了cAMP的浓度，CAP不能被活化形成CAP－cAMP复合物，则不能转录。第53页，共58页，2023年，2月20日，星期一lac阻遏蛋白负性调节与CAP正性调节两种机制协调合作：当Lac阻遏蛋白封闭转录时，CAP对该系统不能发挥作用；但是如果没有CAP存在来加强转录活性，即使阻遏蛋白从操纵序列上解聚仍几无转录活性。

lac操纵子强的诱导作用既需要乳糖存在又需缺乏葡萄糖。第54页，共58页，2023年，2月20日，星期一调节基因操纵基因结构基因mRNA酶蛋白调节基因操纵基因结构基因辅阻遏物trp阻遏蛋白原调节基因编码的阻遏蛋白原不与操作基因结合，结构基因转录。Trp或Trp－RNA与阻