【高中生物】基因工程的基本操作程序课件 高二下学期生物人教版选择性必修3

新课程标准核心素养1.阐明基因工程的原理和基本操作程序。2.针对人类生产或生活中的某一需求，选取适当的基因工程的技术和方法，尝试设计获得某一转基因产品的方案。3.尝试进行PCR的基本操作并用电泳鉴定PCR的产物。1.科学思维——结合生产实例，举例说出基因工程的基本操作程序。2.科学探究——针对人类生产和生活的某一需求，尝试提出初步的基因工程构想，完成初步设计。第2节基因工程的基本操作程序

1997年，我国政府首次批准商业化种植转基因抗虫棉。到2015年，我国已育成转基因抗虫棉新品种100多个，减少农药用量40万吨，增收节支社会经济效益450亿元。你知道转基因抗虫棉抗虫的机制是什么吗？

从社会中来转基因抗虫棉(使棉铃虫死亡，左)与非转基因抗虫棉(右)培育转基因抗虫棉一般需要哪些步骤？与载体拼接

普通棉花（无抗虫特性）棉花细胞抗虫棉

（有抗虫特性）导入抗虫基因重组DNA分子培育转基因抗虫棉的简要过程1.目的基因的筛选与获取2.基因表达载体的构建3.将目的基因导入受体细胞4.目的基因的

检测与鉴定从社会中来目的基因的筛选与获取Screeningandacquisitionoftargetgenes第一部分DNA基因1基因2基因3放大终止子非编码区非编码区编码区编码区上游编码区下游启动子原核基因终止子编码区非编码区非编码区内含子外显子启动子编码区上游编码区下游真核基因1.基因的结构一.目的基因的筛选与获取——原核VS真核基因的结构具有遗传效应的DNA片段

（1）

非编码区①组成：编码区上游+编码区下游②功能：不编码蛋白质，含有能调控遗传信息表达的DNA序列(如启动子、终止子）。

（2）编码区：编码蛋白质的合成1.基因的结构一.目的基因的筛选与获取——原核VS真核基因的结构典型的原核细胞基因的结构示意图典型的真核细胞基因的结构示意图原核细胞真核细胞不同点编码区是_____的编码区是间隔的、_____的相同点都由能够编码蛋白质的_______和具有调控作用的_______区组成的连续不连续编码区非编码（连续的）（不连续）基因=非编码区+编码区RNA聚合酶识别并结合的位点，驱动转录启动子本质：位置：作用：是一段特殊序列结构的DNA片段；位于基因上游；终止子本质：位置：作用：是一段特殊序列结构的DNA片段；位于基因下游；终止转录原核细胞基因的结构示意图真核细胞基因的结构示意图1.基因的结构一.目的基因的筛选与获取——原核VS真核基因的结构启动子

与

终止子VS起始密码子

与

终止密码子

密码子：mRNA上决定一个氨基酸的三个相邻的碱基翻译起始与终止转录起始与终止①定义：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状的或获得预期表达产物的基因。目的基因受体细胞目的基因主要是指编码蛋白质的基因抗逆性基因生产药物基因毒物降解基因工业用酶基因一.目的基因的筛选与获取1.目的基因转基因抗虫棉目的基因——Bt基因苏云金芽孢杆菌产生Bt基因伴胞晶体蛋白(Bt抗虫蛋白)表达破坏鳞翅目昆虫的消化系统杀死棉铃虫棉花细胞导入抗虫棉培育一.目的基因的筛选与获取目的基因的筛选与获取当Bt抗虫蛋白被分解为多肽后，多肽与害虫肠上皮细胞的特异性受体结合，导致细胞膜穿孔，最后造成害虫死亡。1.Bt抗虫蛋白的抗虫原理？2.抗虫棉中的Bt抗虫蛋白会不会对人畜产生危害？Bt抗虫蛋白只有在某类昆虫肠道的碱性环境中才能表现出毒性，而人和牲畜的胃液呈酸性，肠道细胞也没有特异性受体，因此，Bt抗虫蛋白不会对人畜产生上述影响。基因海洋目的基因如何筛选相关的已经结构和功能清晰的基因筛选①筛选方法之一一.目的基因的筛选与获取3.筛选合适目的基因2、目的基因的筛选一、目的基因的筛选与获取（1）

较为有效的方法之一从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选。（2）辅助工具

随着测序技术的发展，以及序列数据库（GenBank）、序列比对工具（如BLAST）等的应用，越来越多的基因的结构和功能为人们所知，为找到合适的目的基因提供了更多的机会和可能。苏云金杆菌制成杀虫剂掌握目的基因的功能掌握目的基因的结构防治棉花害虫发现杀虫作用与Bt基因有关掌握Bt基因的序列深入了解Bt基因的表达产物(Bt抗虫蛋白)Bt基因是培育转基因抗虫棉较为合适的目的基因。实例：Bt基因的筛选一.目的基因的筛选与获取3.筛选合适目的基因测序技术序列数据库(如GenBank)序列比对工具(如BLAST)测定核酸和蛋白质序列以碱基顺序或氨基酸残基顺序为基本内容的分子生物信息数据库把感兴趣的序列跟已经存在的序列数据库进行比较的工具。通过比对识别相关的序列，从而能获得目的基因和蛋白质的功能。③筛选目的基因的技术手段一.目的基因的筛选与获取3.筛选合适目的基因方法：3、目的基因的获取（1）从基因文库中获取（3）利用PCR技术扩增（常用）（2）人工合成一、目的基因的筛选与获取（1）从基因文库中获取目的基因

将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入到受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。基因组文库部分基因文库（包含一种生物的所有基因）（cDNA文库）（包含一种生物的一部分基因）三、目的基因获取方法1基因文库概念2基因文库类型提取某种生物的全部DNA多个一定大小的DNA片段将DNA片段与载体连接，导入受体菌中储存用适当的限制酶切割基因组文库构建3基因组文库的构建某种生物的单链mRNA单链互补DNA双链cDNA片段导入受体菌中储存与载体连接cDNA文库逆转录酶催化DNA聚合酶催化部分基因文库（如cDNA文库）构建构建某生物体内全部DNA许多DNA片段受体菌群体限制酶与运载体连接导入基因组文库某种生物某个时期的mRNAcDNA反转录受体菌群体与运载体连接导入部分基因文库（cDNA文库）

基因文库的构建过程基因组DNA文库与cDNA文库的比较

文库类型cDNA文库

基因组文库

文库大小基因中启动子（具有启动作用的DNA片段）基因中内含子(位于编码蛋白质序列的非编码DNA片段）

基因多少

物种间的基因交流小大无有无有某种生物的部分基因某种生物的全部基因可以部分基因可以内含子、启动子、终止子2101（2）人工合成在我国首批具有较高抗虫活性的转基因抗虫棉的培育过程中，科学家采用的是人工合成的方法。DNA合成仪转基因抗虫棉3、目的基因的获取在已知目的基因核苷酸序列且基因较小的情况下，利用DNA合成仪自动合成一、目的基因的筛选与获取PCR技术：PCR是______________

_的缩写，是一项根据___________的原理，在___

_提供参与DNA复制的___

____与__

_______，对___________________

_进行______

__的技术；聚合酶链式反应DNA半保留复制体外各种组分反应条件目的基因的核苷酸序列大量复制全称聚合酶链式反应DNA半保留复制体外（PCR扩增仪/PCR仪）对目的基因的核苷酸序列进行大量复制可以在短时间内大量扩增目的基因一.目的基因的筛选与获取（3）利用PCR获取和扩增目的基因原理操作环境目的优点：复习：体内DNA复制1.条件：（1）DNA模板：亲代DNA分子的_____条母链（2）原料：4种_____________（3）酶：__________、__________（4）能量：__________2.原则：____________________(A-_____;C-______)2脱氧核苷酸ATP解旋酶DNA聚合酶碱基互补配对原则TG①DNA复制所需的基本条件:参与的组分在DNA复制中的作用

解旋酶DNA母链4种脱氧核苷酸DNA聚合酶引物提供DNA复制的模板合成DNA子链的原料打开DNA双链催化合成DNA子链使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸（体外用耐高温的DNA聚合酶）（体外用高温代替）（2种）引物是一小段能与__________的一段碱基序列__________的____________DNA母链互补配对短单链核酸3’5’DNA母链3’5’DNA母链3’5’引物3’5’引物（3）利用PCR获取和扩增目的基因子链延伸子链延伸PCR的条件①DNA（含目的基因）模板。②分别与模板DNA相结合的两种引物。③A、T、G、C四种脱氧核苷酸。④耐高温的DNA聚合酶。⑤稳定的缓冲溶液（一般添加Mg2+）。⑥能严格控制温度的温控设备。一小段（20-30个）能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。脱氧核苷三磷酸（dNTP：dATP、dTTP、dGTP、dCTP）耐高温的TaqDNA聚合酶真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2+激活。检测方法完成后，常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定产物。目的基因的筛选与获取目的基因的筛选与获取3’5’DNA母链13’5’DNA母链23’5’引物13’5’引物23’5’DNA母链13’5’DNA母链2引物可以是DNA单链，也可以为RNA单链。细胞内的DNA复制通常以RNA单链为引物细胞外（PCR）一般以DNA单链为引物用于PCR的引物长度通常为20~30个核苷酸。引物结合在模板链的3’端，引导子链从5'端→3'端方向复制。为什么需要引物？因为Taq酶不能从0开始添加核苷酸。01耐高温的DNA聚合酶(Taq酶）4种脱氧核苷酸（DNTP）引物待扩增的DNA片段（模板）5’5’变性复性延伸温度上升到90℃以上，双链DNA解聚为单链当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下合成新的DNA链。（3）PCR反应过程第一轮循环的产物作为第二轮反应的模板，经过变性、复性和延伸三步产生第二轮循环的产物；第二轮循环的产物作为第三轮反应的模板，经过变性、复性和延伸三步产生第三轮的产物；第二轮循环的产物第三轮的产物完成以后，常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物③PCR反应过程一.目的基因的筛选与获取目的基因的筛选与获取PCR的结果由于一个循环得到的产物又可以作为下一个循环的模板，因而每一次循环后目的基因的量可以增加一倍。7.PCR产物的鉴定常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物。【提醒】在PCR过程中实际加入的为dNTP（即dATP、dGTP、dTTP、dCTP），既可作为合成DNA子链的原料，又可为DNA的合成提供能量。脱氧核苷三磷酸（1）若开始只有一个DNA提供模板，则循环n次后获得的子代DNA数目为

个。（2）若开始有N0个DNA提供模板，则循环n次后获得的子代DNA数目为

个。2nN0∙2n一.目的基因的筛选与获取③PCR反应过程比较项目细胞内DNA复制PCR技术区别解旋方式解旋酶催化边解旋边复制DNA在高温下变性解旋全部解旋后在复制场所主要在细胞核内细胞外(主要在PCR扩增仪内)酶解旋酶、DNA聚合酶等耐高温的DNA聚合酶温度细胞内温和条件控制温度，需在不同温度下进行结果合成整个DNA分子扩增特定的DNA片段或基因联系①模板:均需要脱氧核苷酸双链作为模板②原料:均为四种脱氧核苷酸③酶:均需DNA聚合酶④引物:都需要引物，使DNA聚合酶从引物的3‘端合成子链用PCR可以扩增mRNA吗？mRNA不可以直接扩增，需要将它逆转录成cDNA再进行扩增。1.逆转录酶以RNA为模板合成一条与RNA互补的DNA链，形成RNA-DNA杂交分子；2.核酸酶H降解RNA-DNA杂交分子中的RNA链，使之变成单链DNA；3.以单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一条互补的DNA链，形成双链DNA分子，即cDNA(1)用PCR方法扩增目的基因时不必知道基因的全部序列()(2)PCR体系中一定要添加从受体细胞中提取的DNA聚合酶()(3)PCR技术中，DNA模板链上碱基G和C的比例越高，DNA变性解链的温度就越高。()(4)PCR除需要耐高温的DNA聚合酶、解旋酶、4种脱氧核苷酸和DNA模板之外，还需要引物等基本条件。(

)解析：PCR不需要解旋酶的参与。(5)PCR的每一个循环都包括变性→复性→延伸三个步骤，延伸后的产物又可以作为下一个循环的模板。(

)√×√×√【基础过关】3.（2021·全国甲卷·高考真题）PCR技术可用于临床的病原菌检测。为检测病人是否感染了某种病原菌，医生进行了相关操作：①分析PCR扩增结果；②从病人组织样本中提取DNA；③利用PCR扩增DNA片段；④采集病人组织样本。回答下列问题：（1）若要得到正确的检测结果，正确的操作顺序应该是_________（用数字序号表示）。（2）操作③中使用的酶是____________________________。PCR反应中的每次循环可分为变性、复性、_____三步，其中复性的结果是________________________________。（3）PCR（多聚酶链式反应）技术是指___________________________________________________________________________________________________________________。该技术目前被广泛地应用于疾病诊断等方面。

一项根据DNA半保留复制的原理，在体外参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术④②③①Taq酶(耐高温的DNA聚合酶）延伸引物通过碱基互补配对与单链DNA结合当堂巩固基因表达载体的构建Constructionofgeneexpressionvector第二部分培育转基因抗虫棉的简要过程：提取棉花细胞(含抗虫基因)苏云金芽孢杆菌抗虫基因与运载体DNA拼接导入普通棉花(无抗虫特性)棉花植株(有抗虫特性)思考：将生物的所有DNA直接导入受体细胞不是更简便吗？如果这么做，效果会怎样？这种方法针对性差，完全靠运气，也无法确定哪些基因导入了受体细胞。基因表达载体是由哪些部分组成的呢？1.构建基因表达载体的目的：2.基因表达载体的组成思考：要各个元件有什么作用？二.基因表达载体的构建——核心步骤（1）使目的基因在受体细胞中稳定存在，且可以遗传给下一代；（2）使目的基因能够在受体细胞中表达和发挥作用。①目的基因：②启动子：③终止子：④标记基因：控制特定性状或表达特定产物。位于基因的首端,是RNA聚合酶结合位点，基因转录的开始。位于基因的末端，终止转录。检测目的基因是否导入受体细胞，筛选含有目的基因的受体细胞。⑤复制原点：DNA聚合酶结合位点。基因表达载体的构建基因表达载体的组成载体≠表达载体的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构。基因表达载体的构建启动子终止子起始密码子终止密码子【区分两组概念】位于基因上位于mRNA上翻译的起始点翻译的终点转录的起始点转录的终点本身不转录决定氨基酸不决定氨基酸①用一定的限制酶切割载体，使其出现一个切口，露出黏性末端。②用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段。③将切下的目的基因片段拼接到载体的切口处，再加入适量DNA连接酶，形成了一个重组DNA分子。基因表达载体的构建过程1、单酶切（同一种酶）：（1）目的（结果）：产生相同的黏性末端，以便进行连接（2）DNA连接酶处理后会出现几种产物：①目的基因——载体连接物②载体——载体连接物③目的基因——目的基因连接物②③分别叫做载体的自身环化和目的基因的自身环化拓展3：限制酶的选择拓展3：限制酶的选择2、双酶切如何防止目的基因和载体的自身环化以及目的基因的反向连接？-G-CTTAA-A-TCTAG使用两种限制酶的优点：①防止目的基因和载体的自身环化②还可以防止目的基因与载体的反向连接将目的基因导入受体细胞Introducethetargetgeneintotherecipientcell第三部分第三步：将目的基因导入受体细胞基因表达载体受体细胞导入转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。动物植物微生物三、将目的基因导入受体细胞导入植物细胞导入动物细胞导入微生物细胞导入受体细胞的方法受体细胞类型（常用）①花粉管通道法②农杆菌转化法（常用）显微注射法Ca2＋处理法（又称感受态细胞法）受精卵或体细胞受精卵原核细胞

感受态细胞(能吸收周围环境DNA分子的生理状态)（一）导入植物细胞农杆菌转化法花粉管通道法(常用)

①导入方法1.花粉管通道法：我国科学家独创②受体细胞：体细胞子房花粉柱头花粉管精子卵细胞胚囊三、将目的基因导入受体细胞用微量注射器将含有目的基因的DNA溶液直接注入子房中花粉管通道法子房注射花柱滴加在植物授粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加到花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊。适用生物：开花植物花粉管通道法的过程：三、将目的基因导入受体细胞萌发的花粉管花柱子房胚囊卵细胞方法1花粉管通道法优点柱头①利用植物授粉后形成的天然花粉管通道，将外源基因携带进入胚囊，此时的受精卵未形成细胞壁，且正在进行活跃的DNA复制，容易将外源DNA片段整合到受体基因组中。②操作简单、技术成本低，免去了组织培养以及诱导再生植株的全套人工培养过程。三、将目的基因导入受体细胞①农杆菌特点：a.能在自然条件下侵染___________和_________，而对大多数___________没有侵染能力；双子叶植物裸子植物单子叶植物b.农杆菌细胞内含有______，当它侵染植物细胞后，能将______上的______（___________）转移到被侵染的细胞，并且将其_________________________；Ti质粒Ti质粒T-DNA可转移的DNA整合到该细胞的染色体DNA上

将目的基因插入_____________中，通过农杆菌的_____作用，就可以使目的基因___________②利用农杆菌进行转化的思路：Ti质粒的T-DNA转化进入植物细胞三、将目的基因导入受体细胞方法2农杆菌转化法（最常用）Ti质粒T-DNA农杆菌③农杆菌转化法的过程：T-DNA目的基因构建表达载体含目的基因的重组Ti质粒转入农杆菌含重组Ti质粒的农杆菌导入植物细胞表现出新性状的植物植物细胞将目的基因插入染色体DNA中植物组织培养三、将目的基因导入受体细胞两次拼接：第一次拼接是第二次拼接(非人工操作)指两次导入：第一次导入是将第二次导入(非人工操作)是提醒：农杆菌转化法中的两次拼接、两次导入三、将目的基因导入受体细胞将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上；被插入目的基因的T-DNA拼接到受体细胞染色体的DNA上。含目的基因的Ti质粒重新导入农杆菌；指含目的基因的T-DNA导入受体细胞。

④转化的具体方法：a.可以将新鲜的从叶片上取下的圆形小片_______________，然后_____________，并__________；与农杆菌共培养筛选转化细胞再生成植株b.可以将____直接浸没在________________中一段时间，然后培养植株并获得____，再进行_____、_____等；花序含有农杆菌的溶液种子筛选鉴定三、将目的基因导入受体细胞随着转化方法的突破，用农杆菌侵染水稻、玉米等多种单子叶植物也取得成功。——显微注射法1.受体细胞：受精卵(因为受精卵容易表现出全能性)2.过程：构建基因表达载体并提纯利用显微注射将基因表达载体注入动物的受精卵中早期胚胎培养胚胎移植获得具有新性状的动物（二）导入动物细胞三、将目的基因导入受体细胞——Ca2+处理法1.受体细胞：

常用原核生物作为受体细胞，其中以大肠杆菌最广泛。2.原核生物的优点:

繁殖快、单细胞、遗传物质相对较少、易于培养。3.一般过程:Ca2+处理大肠杆菌使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态将重组的基因表达载体导入其中（Ca2+的作用：增加细胞壁的通透性）（感受态细胞）（三）导入微生物细胞Ca2+感受态细胞吸收三、将目的基因导入受体细胞实例：利用转基因大肠杆菌生产药物注意：原核生物作为受体细胞产生的真核生物的蛋白质通常没有生物活性（无内质网和高尔基体加工），需要在体外进行再加工。三、将目的基因导入受体细胞种类项目植物细胞动物细胞微生物细胞常用方法农杆菌转化法；花粉管通道法显微注射法Ca2＋处理法受体细胞体细胞或受精卵受精卵原核细胞转化过程目的基因插入Ti质粒的T-DNA上→导入植物细胞→整合到受体细胞DNA中→表达目的基因表达载体提纯→取受精卵→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物Ca2＋处理细胞→感受态细胞→表达载体与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA分子【小结】三.将目的基因导入受体细胞目的基因的检测与鉴定Detectionandidentificationoftargetgenes第四部分四、目的基因的检测与鉴定①检测是否插入了目的基因（DNA）②检测目的基因是否转录出了mRNA③检测目的基因是否翻译成蛋白质分子水平个体生物学水平方法：DNA分子杂交、PCR技术方法：分子杂交、PCR技术方法：抗原-抗体杂交技术确定是否具有特性及抗性的程度（即个体是否具有相应性状或产物是否具有功能活性目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性，只有通过检测与鉴定才能知道。四、目的基因的检测与鉴定分子水平的检测（1）借助载体上的标记基因可以检测目的基因是否在受体细胞中稳定地存在并遗传（2）基因探针：一段带放射性标记的、与目的基因互补的特异核苷酸序列。可以是DNA，也可以是由之转录而来的RNA。1、检测是否插入了目的基因（3）核酸杂交：可以用于检测目的基因：将待测DNA与目的基因探针混合，如果发生了核酸杂交，则说明有目的基因。互补的两条核酸单链通过复性形成双链的过程。四、目的基因的检测与鉴定1、检测转基因生物染色体DNA上是否插入了目的基因方法1：PCR扩增DNA半保留复制原理：基本思路：①制作基因探针，并用PCR扩增；②提取受体细胞全部DNA并用PCR扩增，与基因探针置于同一培养液；③高温变性处理，使之全部变为单链，观察是否出现杂交DNA片段。方法2：DNA分子杂交技术碱基互补配对原理：探针与受体中的DNA分子杂交出现杂交带：不出现杂交带：已插入未插入四、目的基因的检测与鉴定2、检测目的基因是否转录出了mRNA方法：PCR扩增或分子杂交技术基本思路：①制作基因探针，并用PCR扩增；②提取受体细胞全部RNA，直接与基因探针置于同一培养液；③高温变性处理，使之全部变为单链，观察是否出现分子杂交片段。探针与受体中的mRNA杂交出现杂交带：不出现杂交带：已转录未转录四、目的基因的检测与鉴定3、检测目的基因是否翻译成蛋白质方法：抗原-抗体杂交技术原理：抗原抗体的特异性结合苏云金杆菌提取Bt抗虫蛋白标记抗体提取蛋白电泳分离抗原抗体杂交抗原转基因生物四、目的基因的检测与鉴定个体生物学水平的检测转Bt基因非转基因没有抗虫基因的棉植株有抗虫基因的棉植株接种棉铃虫虫没有死虫被杀死没有表达目的基因表达类型检测内容方法个体生物学水平的鉴定个体是否具有相应性状或产物是否具有功能活性抗虫、抗病的接种实验产品功能活性比较实例：如何鉴定转基因抗虫棉是否培育成功？个体生物学水平的鉴定具体方法举例转基因生物鉴定方法成功标志抗虫植物抗病毒（菌）植物抗盐植物抗除草剂植物获取目的基因产物的转基因生物饲喂害虫（抗虫接种实验）害虫死亡病毒（菌）接种实验未染病盐水浇灌正常生长喷洒除草剂正常生长提取细胞产物与天然产品进行功能活性比较功能、活性正常四.目的基因的检查与鉴定筛选和获取目的基因获取质粒、噬菌体等载体构建基因表达载体将含有目的基因的表达载体导入受体细胞检测和鉴定目的基因是否稳定维持和表达其遗传特性基因工程的基本操作流程图筛选和获取目的基因1.利用PCR获取和扩增目的基因2.人工合成目的基因3.通过构建基因文库获取目的基因第一步：目的基因的筛选与获取构建基因表达载体1.用限制酶切割载体和含有目的基因的DNA片段2.用DNA连接酶连接第二步：基因表达载体的构建将含有目的基因的表达载体导入受体细胞1.导入植物细胞：花粉管通道法；农杆菌转化法2.导入动物细胞：显微注射法3.导入原核细胞：用Ca2+处理受体细胞第三步：将目的基因导入受体细胞检测和鉴定目的基因是否稳定维持和表达其遗传特性1.分子水平检测①检测目的基因是否导入（PCR等技术检测）②检测目的基因是否转录（PCR等技术检测）③检测目的基因是否翻译（抗原-抗体检测）2.个体水平检测第四步：目的基因的检测与鉴定DNA片段的扩增及电泳鉴定第五部分探究•实践：DNA片段的扩增及电泳鉴定1.实验原理（1）利用PCR在体外进行DNA片段扩增的原理①PCR利用了DNA的_________原理，通过_________来控制DNA双链的解聚与结合，PCR仪实质上就是一台能够________________的仪器，一次PCR一般要经历___次循环；热变性调节温度自动调控温度30②PCR扩增DNA片段还利用了_________________的原理；DNA半保留复制基因工程的基本操作程序（2）DNA片段电泳鉴定的原理①DNA分子具有_____________，在一定的___下，这些基团可以带上正电荷或负电荷，在_____的作用下，这些________会向着__________________的电极移动，这个过程就是_____；可解离的基团pH电场带电分子电泳与它所带电荷相反②PCR的产物一般通过_______________来鉴定；③在凝胶中DNA分子的迁移速率与___________、________________和_____等有关（迁移速率与之呈负相关）④凝胶中的DNA分子通过_____，可以在波长为________的______下被检测出来。琼脂糖凝胶电泳凝胶的浓度染色300nm紫外灯DNA分子的大小构象基因工程的基本操作程序2.材料用具①PCR仪（自动控温，实现DNA的扩增）②微量离心管（实际上是进行PCR反应的场所）③微量移液器（用于向微量离心管转移PCR配方中的液体）④一次性吸液枪头（微量移液器吸取一种试剂更换一次枪头）⑤电泳装置（包括电泳仪、电泳槽等）基因工程的基本操作程序10倍浓缩的扩增缓冲液（含Mg2+）5μL20mmol/L的4种脱氧核苷酸的等量混合液（实为dNTP）1μL20μmol/L的引物Ⅰ2.5μL20μmol/L的引物Ⅱ2.5μLH2O28～33μL1-5U/μL的TaqDNA聚合酶（即耐高温的DNA聚合酶）1～2U模板DNA（用量为1pg-1μg）5～10μL总体积50μL⑧PCR反应体系的配方⑥4种脱氧核苷酸等量混合液、2种引物、TaqDNA聚合酶、模板DNA、扩增缓冲液、无菌水。⑦电泳缓冲液、凝胶载样缓冲液、琼脂糖和核酸染料等基因工程的基本操作程序3.方法步骤基因工程的基本操作程序PCR反应体系的配方10倍浓缩的扩增缓冲液5μL20mmol/L的4种脱氧核苷酸的等量混合液1μL20μmol/L的引物Ⅰ2.5μL20μmol/L的引物Ⅱ2.5μLH2O28～33μL1～5U/μL的TaqDNA聚合酶1～2U模板DNA5～10μL总体积50μL注：模板DNA的用量为1gp～1μg①移液：用微量移液器按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书，在微量离心管中依次加入各组分（1）DNA片段的扩增3.方法步骤基因工程的基本操作程序循环程序变性复性延伸预变性94℃，5min30次94℃，30s55℃，30s72℃，1min最后1次94℃，1min55℃，30s