菌种筛选方法

(完整(完整word版)菌种筛选方法菌种筛选方法在实际工作中,为了提高筛选效率,往往将筛选工作分为初筛和复筛两步进展。初筛的目的是删去明确不为主，测定的准确性还在其次。初筛的手段应尽可能快速、简洁。复筛的目的是确认符合生产要求的菌株，所以，复筛步骤以质为主,应准确测定每个菌株的生产指标，测得的数据要能够反映将来的生产水平。将变异菌株筛选出来。尽管相当多的突变菌株并不存在这种相关性，但是在筛选工作中应尽可能捕获、利用这些直接的形态特征性变化.固然，这种鉴别方法只能用于初筛。有人曾统计过3,484个产维生素B2的阿舒假囊酵母〔Eremotheciumashbyii〕的变异菌落，觉察高产菌株的菌落形态有以下特点：菌落直径呈中等大小〔8-10毫米〕，凡过大或过小者均为低产菌株;色泽深黄色，凡浅黄或白色者皆属低产菌株。又如，在灰黄霉素产生菌荨麻青霉〔Penicilliumurticae〕在赤霉素生产菌藤仓赤霉〔Gibberellafujikuroi〕中，却觉察菌落的紫色加深者产量反而下降。平皿快速检测法平皿快速检测法是利用菌体在特定固体培育基平板上的生理生化反响,将肉眼观看不到的产量性状转化成可见的“形态“变化.具体的有纸片培育显色法、变色圈法、透亮圈法、生长圈法和抑制圈法等，见图5.6。1。这些方法较粗放,一般只能定性或半定量用，常只用于初筛，但它们可以大大提高筛选的时会造成两者的结果不全都。图56.1平皿快速检测法示意图平皿快速检测法操作时应将培育的菌体充分分散,形成单菌落，以避开多菌落混杂一起，引起“形态“大小测定的偏差。1〕纸片培育显色法将饱浸含某种指示剂的固体培育基的滤纸片搁于培育皿中,用牛津杯架空,下放小团浸有3指示剂也可以是能与特定产物反响产生颜色的化合物。变色圈法将指示剂直接掺入固体培育基中，进展待筛选菌悬液的单菌落培育，或喷洒在已培育成分散单菌落的固体培育基外表，在菌落四周形成变色圈。如在含淀粉的平皿中涂布肯定浓度的产淀粉酶菌株的菌悬液，使其呈单菌落,然后喷上稀碘液，发生显色反响。变色圈越大，说明菌落产酶的力量越强。而从变色圈的颜色又可粗略推断水解产物的状况.透亮圈法在固体培育基中渗入溶解性差、可被特定菌利用的养分成分，造成浑浊、不透亮的培育基背景。将待筛选在菌落四周就会形成透亮圈,透亮圈的大小反映了菌落利用此物质的力量。在培育基中掺CaCO3生长圈法利用一些有特别养分要求的微生物作为工具菌,假设待分别的菌在缺乏上述养分物的条件形成围绕菌落生长的生长圈。该法常用来选育氨基酸、核苷酸和维生素的生产菌。工具菌往往都是对应的养分缺陷型菌株。抑制圈法待筛选的菌株能分泌产生某些能抑制工具菌生长的物质,或能分泌某种酶并将无毒的物质水解成对工具菌有毒的物质，从而在该菌落四周形成工具菌不能生长的抑菌圈。例如：将培育后的单菌落连同四周的小块琼脂用穿孔器取出,以避开其它因素干扰，移入无培育基平皿，连续培育4—5天，使抑制物积存2厘米，生菌的筛选，工具菌常是抗生素敏感菌。由于抗生素分泌处于微生物生长后期，取出琼脂块可以避开各菌落5.6.2。摇瓶培育法摇瓶培育法是将待测菌株的单菌落分别接种到三角瓶培育液中，振荡培育，然后，再对培育液进展分析测定。摇瓶与发酵罐的条件较为接近，所测得的数据就更有实际意义。但是摇瓶培育法需要速检测法等方法检测时，摇瓶培育法也可用于初筛。初筛的摇瓶培育一般是一个菌株只做一次发酵测定，从大量菌株中选出10—20%较好的菌株，淘汰80—90％的菌株；而复筛中摇瓶培育一般是一个菌株培育33-5特别变异菌的筛选方法上述一般的筛选菌株方法的处理量仍是很大的,为了从存活的每毫升106左右个单细胞中并不肯定能筛选到,所以，建立特别的筛选方法是极其重要的.例如养分缺陷型和抗性突变菌株的筛选有它们的特别性,养分缺陷型或抗性突变的性状就象一个高效分别的“筛子”，以它为筛选的条件，可以大大加快筛选的进程并有效地防止漏筛。在现代的育种中,常有意以它们作为遗传标记选择亲本或在DNA中设置含这些遗传标记的片段，使菌种筛选工作更具方向性和预见性。本节还将简洁介绍其它一些特别变异株的筛选方法。41细胞发生分别，防止消灭表型延迟现象，筛选出不纯的菌株。养分缺陷型的筛选一般包括浓缩、进一步检出和鉴别养分缺陷型等步骤。浓缩养分缺陷型菌株诱变后的细胞群体中大局部存活菌是野生型，而养分缺陷型占的比例相当小,这对分别是很不利的，所以,应当淘汰大量的野生型，以到达浓缩养分缺陷型的目的.常用的浓缩方法有抗生素法、菌丝过滤法、差异杀菌法和饥饿法等。进一步检出所需缺陷型浓缩后的菌液中养分缺陷型的比例较大，但并非全部都是。并且养分缺陷型中也有不同的类型,还需要进一步检出所需要的养分缺陷型.这样就需要承受逐个检出法、夹层培育法和限量补给法等方法进一步检出所需要的养分缺陷型。养分缺陷型的鉴定获得的养分缺陷型菌株还应进一步确认其生长的所需物.菌株较少时，可用生长谱法，假设菌株较多时，常承受组合补充培育基法4。210-6频率的突变体存在，就简洁筛选出来。抗性突变株的筛选常用的有一次性筛选法和阶梯性筛选法两种手段。1〕一次性筛选法一次性筛选法就是指在对动身菌株完全致死的环境中，一次性筛选出少量抗性变异株。噬菌体抗性菌株常用此方法筛选.将对噬菌体敏感的动身菌株经变异处理后的菌悬液大量接入含有噬菌体的培育液中，为了保证敏感菌不能存活，可使噬菌体数大于菌体细胞数。此时动身菌株全部死亡，只有变异产生的抗噬菌体突变株能在这样的环境中不被裂解而连续生长生殖.通过平板分别即可得到纯的抗性变异株。耐高温菌株在工业发酵中的应用意义在于它可以节约冷却水的用量,尤其是在夏季，并能削减染菌的时机.耐高温菌株所产生酶的热稳定性较高，适用于一些特别的工艺过程。耐高温菌株也常承受此法筛选.将处理过的菌悬液在肯定高温下处理一段时间后再分别。对此温度敏感的细胞被大量杀死，残存的细胞则对高温有较好的耐受性。耐高浓度酒精的酵母菌的酒精发酵力量较高，也适宜提高发酵醪浓度，提高醪液酒精浓在高浓度酒精或加蔗糖等造成的高渗环境下一次性筛选获得.2)阶梯性筛选法药物抗性即抗药性突变株可在培育基中参加肯定量的药物或对菌体生长有抑制作用的由于药物抗性常受多位点基因的掌握，所以药物的抗性变异也是逐步进展的，时间上是渐进的，先是可以抗较低浓度的药物，而对高浓度药物敏感，经”驯化“或诱变处理后,可能成为抗较高浓度药物的突变株.阶梯菌株，使临时耐药性不高，但有进展前途的菌株不致于被遗漏，所以说，阶梯性筛选法较适合于药物抗性菌株的筛选，特别是在临时无法确定微生物可以承受的药物浓度状况下组成酶变异株的筛选很多水解酶是诱导酶,只有在含有底物或底物类似物的培育环境中，微生物才会合成这些酶类,所以，诱导酶的生产不仅需要诱导物，而且受到诱导物的种类、数量以及分解产物的影响。能快速利用的碳源〔如葡萄糖产本钱提高。假设掌握这些酶合成的调整基因发生了变异，诱导酶就可能转变成组成酶，它的合成与细胞的生产具有重要的现实意义。具体的筛选方法有恒化器法、循环培育法和诱导抑制物法。恒化器法恒化器常被用于微生物的”驯化“。在培育基中添加不能起诱导作用的低浓度底物，接入长速率极慢，而群体中少数组成型变异株则可合成有关的酶，分解利用该底物，生长速率较快。为了提高组渐渐增大组成酶变异株的优势，这样就能够比较简洁地做进一步的纯化分别。循环培育法利用不含诱导物的培育环境和含有诱导物的培育环境进展交替循环培育待分别的菌悬液样能较好地生长，但在此环境中组成型突变株已能合成有关的水解酶，而诱导型菌株就不能合成。进而将它们转接入含诱导物的培育基中时，变异株能快速利用诱导底物进展生长生殖，而诱导型动身菌株需经受一个增大。诱导抑制剂法有些化合物能阻挡某些诱导酶的合成，如α-硝基苯基-β-岩藻糖苷对大肠杆菌的β—半乳糖苷酶的诱导合成有抑制作用，称为诱导抑制剂。当在诱导物和诱导抑制剂同时存在的培育环境中培育待分别菌群时，诱导型菌株不能产生诱导酶,无法正常生长，只有组成型变异株能够利用底物进展生长生殖.些”白色污染“在自然界很难被消化而进入物质循环。设法选育能分解利用这些高分子材料的微生物对于环境保护至关重要。这些高分子材料大多是不溶于水的,直接分别具有分解功能的微生物很困难.为此,有人设计了阶段式筛选法，首先查找能在与聚乙二醇构造相像的含两个醚键的三甘醇上生长的微生物，接着，诱变筛选能分解聚乙二醇的变异株；或者筛选能以乙二醇、丙二醇为碳源的菌株，继而诱变筛选出能利用聚乙二醇等物质的变异株.这种由简洁的聚合物单体入手逐级筛选高分子废弃物分解菌或许是一条有效的筛选思路。无泡沫菌株及高分散性菌株的筛选有些菌在发酵过程中会产生大量的泡沫，从而造成发酵液满溢，为了避开泡沫的产生,常常需通过牺牲发酵液的装量或参加大量的消泡剂来消退泡沫的不利影响.发酵过程产生泡沫是菌体代谢、培育基和发酵工艺等方面的缘由造成的，而菌种是产生泡沫的关键，选育无泡沫或少泡沫菌株可以从根本上解决泡沫问题。有人用气泡上浮法筛选出了无泡沫的酒精酵母。将变异处理后的菌悬液接种入生长培育基中，培育器皿的底部放置无菌压缩空气喷口，培育过程中不断通入无菌空气,形