基因的生物学功能鉴定技术

基础医学院分子生物学教研室基因的生物学功能鉴定技术Strategiesforanalyzinggenefunction1基因：编码RNA或多肽链的核酸片段控制生物性状的基本遗传单位2

上游增强子启动子ATG外显子1外显子2外显子3外显子4内含子内含子内含子终止子

下游增强子TGA5'-非翻译区3'-非翻译区调控区

结构基因前导区终止区基因可以表达有生物学功能的产物mRNAprotein执行生物学功能3人类基因组计划（HumanGenomeProject,HGP）与曼哈顿原子弹计划、阿波罗登月计划并称为三大科学计划。宗旨：测定组成人类染色体（指单倍体）中所包含的30亿个碱基对组成的核苷酸序列，从而绘制人类基因组图谱，并且辨识其载有的基因及其序列，达到破译人类遗传信息的最终目的。4找到每个基因与某种疾病的种种关系，真正对生命进行系统地科学解码，从此达到从根本上了解认识生命的起源、种间、个体间的差异的原因，疾病产生的机制以及长寿、衰老等困扰着人类的最基本的生命现象目的。人类基因组研究的目的不只是为了读出全部的DNA序列，更重要的是读懂每个基因的功能。5人类基因组研究的目的不只是为了读出全部的DNA序列，更重要的是读懂每个基因的功能。如何解读这部天书？目前，在已知的2.5万-3万个人类基因中：大约70%的基因我们还不清楚它们的功能；有90%的基因我们不知道它们在体内的确切生理作用。利用各种技术手段研究基因组中功能未知基因的作用后人类基因组计划——功能基因组学研究的主要内容6基因的生物学功能鉴定技术基本思路：一、将外源基因导入受体细胞或生物体内——获得新基因——获得额外拷贝的基因二、失活或抑制细胞或生物体内原有基因——在DNA水平——在mRNA水平7一、将外源基因导入受体细胞或生物体内相关技术：基因转染

(genetransfection)——在细胞水平上进行研究转基因技术(transgenictechnique)（1）转基因小鼠、转基因羊（2）转基因植物81.基因转染必要条件：目的基因(purposegene)表达载体(expressionvector)宿主细胞(hostcells)真核转染载体的必备元件：目的基因序列起始密码和终止密码Kozak序列：是核糖体识别序列+4G和-3A对于核糖体识别AUG有显著的促进作用，是翻译起始所必需的必要的顺式作用元件如启动子等AACAUGG---------TAA+4-3+1KozaksequenceGenesequence9我们如何区分细胞是否转染成功了呢？在转染质粒中往往都含有一个报告基因，来指示细胞中目标基因是否存在，这样的报告基因一般可以在转染后一两天内检测到。10瞬时转染与稳定转染瞬时转染：外源基因存在于游离的载体上，可表达但不被复制，表达通常仅持续几天，直到外源基因在细胞分裂过程中丢失为止。稳定转染：在少数转染细胞中，外源基因可整合到细胞的基因组中，成为细胞基因组的一部分从而得以复制，这是稳定转染细胞的标志。子代细胞也同样表达外源基因，由此形成稳定转染的细胞系。外源DNA导入哺乳细胞有两种类型：选稳定转染，还是瞬时转染呢？这要看我们打算进行长期研究还是短期实验。11转基因技术（transgenictechnology）：将外源基因导入受精卵或胚胎干细胞（embryonicstemcell，ES细胞），通过随机重组使外源基因插入细胞染色体DNA，随后将受精卵或ES细胞植入假孕受体动物的子宫，使得转基因细胞发育成转基因个体。转基因动物（transgenicanimal）：应用转基因技术培育出的携带外源基因、并能稳定遗传的动物。2.转基因技术（1）转基因小鼠、转基因羊（2）转基因植物（3）转基因斑马鱼其中，转基因小鼠最为常见12（1）转基因小鼠模型的建立将目的基因通过转基因技术整合到小鼠的染色体中，从而获得携带目的基因的转基因小鼠基本流程：转基因载体的构建PtransgenicgeneEnhancerNeoR

Transgenicmouse13将目的基因通过转基因技术整合到小鼠的染色体中，从而获得携带目的基因的转基因小鼠基本流程：转基因载体的构建将重组转基因导入受体细胞核内TransgenicmousepronucleiEScells两种方法：胚胎干细胞法前核法（1）转基因小鼠模型的建立foreignDNAisincorporatedintogenomebyrandomintegration14将目的基因通过转基因技术整合到小鼠的染色体中，从而获得携带目的基因的转基因小鼠基本流程：转基因载体的构建将重组转基因导入受体细胞核内将转基因ES细胞或受精卵细胞移植胚泡中TransgenicmouseBlastocyst（1）转基因小鼠模型的建立小鼠“基因手术室”15将目的基因通过转基因技术整合到小鼠的染色体中，从而获得携带目的基因的转基因小鼠基本流程：转基因载体的构建将重组转基因导入受体细胞核内将转基因ES细胞或受精卵细胞移植胚泡中将转基因胚泡移植入假孕小鼠的子宫腔中TransgenicmousePsuedopregnantmouse（1）转基因小鼠模型的建立16将目的基因通过转基因技术整合到小鼠的染色体中，从而获得携带目的基因的转基因小鼠基本流程：转基因载体的构建将重组转基因导入受体细胞核内将转基因ES细胞或受精卵细胞移植胚泡中将转基因胚泡移植入假孕小鼠的子宫腔中鉴定并筛选转基因小鼠Transgenicmouse转基因纯合子小鼠的几率为1/4一般认为，转基因是随机整合到染色体上，因此，转基因杂合子的几率在10-20%以下Heterozygoustransgenicmice（1）转基因小鼠模型的建立17问题：用什么方法可以鉴定转基因小鼠？最简单常用的方法是什么呢？要求明确：转基因是否存在转基因整合到染色体的拷贝数转基因是否可以传递给后代18方法：SouthernblotqPCR几个问题需要考虑：酶切基因组DNA以获得不同长短的DNA片段核酸探针的序列选取(转基因序列？阳性筛选标记基因序列?)交配后代转基因鉴定Smearbands云雾状条带19

1982年，美国哈佛大学的一个科学家小组将大鼠的生长激素（rGH）基因与小鼠的金属硫蛋白基因的启动子顺序连接，再引入质粒中。科学家把这种重组的质粒直接注射入小鼠受精卵中，经过充分发育后终于分娩出了21小鼠，其中有七只带有融合基因，六只生长迅速，每只体重平均可达44g，超过同窝无融合基因小鼠（平均体重29g）的1.5倍，这就是闻名于世的“超级小鼠”。转基因小鼠可用于基因功能的研究Thefirsttransgenicanimal:theGiganticmouse20Transgenicsheep:Productionofapharmaceuticallyimportantproteininthemilkofthetransgenicsheep21（2）转基因植物的建立PlantswhosegenomeisintegratedwithforeignDNA*Tiplasmid

—细菌质粒的一种*ExistinginAgro.,T-DNAinTiplasmidcanbeintegratedintoplantchromosome*Agrobacteriumtumefaciens

（致瘤农杆菌）感染植物后引起冠瘿病(crowngall)IntegratedT-DNATiTiplasmidT-DNAplantchromosomeGenesinducecrowngall

Infectcauseplanttumor冠瘿瘤22PlantgeneengineeringusingT-DNAvector-transgenicplant23转基因动/植物可能存在的问题：随机插入，可能产生插入突变，破坏宿主基因组功能；外源基因整合到宿主染色体上的拷贝数不确定；(3)外源基因的丢失；……GenemodifiedAnimalorplantWhatdoyouthinkaboutit?24基因敲除(geneknock-out)条件性基因敲除(conditionalgeneknock-out)TALENCRISPER/Cas9反义RNA

(anti-senseRNA)RNA干涉(RNAinterference)二、失活或抑制生物体内原有基因25美国犹他大学Eccles

人类遗传学研究所

马里奥·卡佩奇Mario

R.

Capecchi英国卡迪夫大学卡迪夫生命科学学院马丁·埃文斯Martin

J.

Evans美国北卡罗来纳州大学教会山分校医学院奥利弗·史密斯Oliver

Smithies1.基因敲除小鼠模型的建立1989年成功对一只老鼠进行基因打靶

TheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine2007MarioR.Capecchi

SirMartinJ.Evans

OliverSmithies

26Whatisgeneknockout?利用DNA同源重组的原理，在活体内将特定基因从染色体上剔除的过程GenomicDNA:TargetingDNAfragment:GenomicDNAknockedout:LostitsoriginalfunctionHomologousarmsequence2728基本流程：构建基因敲除载体载体的基本特点：待敲除基因的同源臂序列阳性筛选标记基因序列阴性筛选标记基因序列PTargetingvectorTargetingvector位于同一条染色体上的基因连在一起的伴同遗传的现象称为连锁由于同源染色体相互之间发生交换而使原来在同一染色体上的基因不再伴同遗传的现象称为交换29>基因敲除载体的构建过程：待敲除基因PCloningvectorPRecombinantcloningvectorPRecombinantcloningvectorNeoRgenePRecombinantcloningvectorPRecombinantcloningvectorTkgenePTargetingvector30HowtomakesurehomologousrecombinationbutnotrandomintegrationhappensinthecellsPneortkTargetingvectortk,agenethatencodesthymidinekinase,anenzymethatphosphorylatesthenucleosideanalogGancyclovir.Ganciclovirkillscellsthatcontaintk

genePositiveselection+NegativeselectionExchange

31细胞死亡细胞的培养基含单核苷酸类似物(gancyclovir)细胞生长良好单核苷酸类似物是无毒的阴性筛选标记基因（HSV-Tk）的筛选原理但如果细胞中如果有HSV-TK基因的表达，即存在TK(thymidinekinase)，单核苷酸类似物将被其磷酸化成有毒的产物…用打靶载体转染ES细胞时，我们只需要同源部分重组入EScell的genome,而Tk基因等载体的其它部分是不可以进入EScell的genome(by随机重组)。用单核苷酸类似物筛选转染后的细胞，存活的细胞基本上不含载体的非目的序列32基本流程：构建基因敲除载体建立杂合基因敲除胚胎干细胞Embryonicstemcell(EScell)EScellsPTargetingvectorBrownmouse33Positive-negativeselectionTransfectionHomologousrecombinantsG418

Neomycin(positiveselection)killsthenon-insertions;Gancyclovir(negativeselection)killstherandominsertionsInsurvivalcells,targetgeneisreplacedbyNeo.MediumwithG418&GancyclovirNormalEScells34???A.基因敲除ES细胞注射入胚泡B.嵌合胚泡植入假孕小鼠子宫中C.嵌合体小鼠的繁育，获得杂合子小鼠利用ES细胞发育的全能性，将一条染色体上特定基因失活的ES细胞发育成特定基因敲除的小鼠D.杂合子小鼠交配，获得基因敲除的纯合子小鼠35基本流程：构建基因敲除载体建立杂合基因敲除胚胎干细胞获得等位基因敲除小鼠AllelicgenesEScellsBlastocystBlackmousePsuedopregnantblackmouseMate¼几率=纯合子36小鼠基因剔除技术是指利用细胞内染色DNA可以和导入细胞的外源DNA在相同序列的区域内发生同源重组(HomologousRecombination)现象，在小鼠胚胎干细胞(ES细胞)中定点破坏内源基因(SpecificGeneLocusDisruption)，然后利用ES细胞发育的全能性(EScellPluripotency)，获得从ES细胞发育而来的带有预定基因缺陷的杂合子小鼠，通过遗传育种最终获得目的基因纯合的缺陷小鼠个体。37FunctionalanalysisofFGF5gene应用举例：Geneknockoutmice“alivetesttubes”38应用举例：GeneknockoutmiceAnimalModelsforHumanDisease人类很多疾病是由基因决定的，构建相应的基因敲除动物模型对疾病的发病机制和治疗研究具有重要的意义，同时也成为药物筛选的动物模型,为医药的研发做了前期准备。39MouseIggeneswereknockedoutHumanIggeneswereknockedinProducehumanizeantibodies应用举例：GeneknockoutmiceBiologicalPharmacy40TyphoidTyphoidtoxinencodinggeneGeneknockoutbacteriumAttenuatedalivetyphoidvaccineImmunizationforpreventingtyphoidinfectionHomologousRecombination应用举例：Geneknockoutbacterium41有些基因是胚胎生长发育过程中非常重要的基因，一旦被敲除可导致胚胎发育受损甚至不能发育为一个个体问：针对这类基因如何采用基因敲除技术进行研究呢？422.条件性基因敲除Conditionalgeneknockout利用可诱导性启动子和Cre重组酶特异性识别位点构建基因敲除载体，通过诱导剂实现可控性基因敲除两个要素：Cre重组酶诱导型启动子Cre:是一种蛋白质名字来源于causerecombination从噬菌体P1提取获得特异性识别DNA序列(34bp)—LoxP(locusofcrossingoverinP1)介导两个LoxP位点之间的特异性重组，从而删除两个LoxP位点间的序列43Cre/LoxP重组系统：基本策略：使待敲除基因位于两个LoxP位点之间Cre重组酶的可控性表达44基本流程：条件性基因敲除载体的构建基因敲除载体的结构是：4NeoLoxPLoxPLoxPTK如果基因组序列是：1234待敲除基因使待敲除基因位于两个LoxP位点之间45基本流程：条件性基因敲除载体的构建在ES细胞中进行第一次常规性基因敲除12344NeoLoxPLoxPLoxPTK1234NeoLoxPLoxPLoxPHomologousrecombinationGenomicDNA:使待敲除基因位于两个LoxP位点之间46使待敲除基因位于两个LoxP位点之间基本流程：条件性基因敲除载体的构建在ES细胞中进行第一次常规性基因敲除在ES细胞中敲除Neo基因1234NeoLoxPLoxPLoxPCreexpressiongenewastransientlyintroducedintotargetedEScellsCre1234LoxPLoxP47Cre重组酶的可控性表达构建可诱导性表达-组织特异性基因敲除系统Systemofinducibleexpression-tissue-specificgenetargeting使Cre基因位于可诱导性启动子下游：TRECreCreinducerONCreCreCre1234LoxPLoxPCreCreCreCre123LoxP48四环素开关系统(tetracyclineswitch-onsystem)：rtetRTissue-specificpromoterrtetRtetTRECreON1234LoxPLoxPCreCreCreCre49融合受体诱导系统(fusionreceptorinduciblesystem)：CreTissue-specificpromoterERm雌激素RCreERmCre-fusionestrogenreceptor(Cre-ERm)Hsp90CreERmHsp90InactivatedCre-ERmTamoxyfen他莫昔芬(选择性ER调节剂)CreERmActivatedCre-ERm1234LoxPLoxPCreERmCreERm50条件性基因敲除:在ES细胞上：——基因敲除(目的基因的替换及Neo基因敲除)——转基因(Cre基因的稳定转染)在载体构建上：——打靶载体(同源臂内侧是LoxP—目的基因—LoxP)——转基因载体(可诱导启动子下游是Cre基因)细胞特异性组织特异性51基因敲除小鼠工程2006年，美国NIH推出knockoutMouseProject(KOMP)将系统敲除或破坏小鼠的2万个基因计划投入5200万美元建立小鼠基因组突变基因数据库此计划将与加拿大NorthAmericanConditionalMouseMutagenesisProject(NorCOMM)及EuropeanConditionalMouseMutagenesisProgram(EUCOMM)合作，以避免重复工作设想：各种基因缺陷小鼠将成为解释人类疾病的模型新物种意外诞生？能吗？——个人认为：条件性基因敲除不会出现意外物种，为什么呢？523.TALEN（TranscriptionActivator-LikeEffectorNucleases）近年来，TALEN已广泛应用于酵母、动植物细胞等细胞水平基因组改造，以及拟南芥、果蝇、斑马鱼及小鼠等各类模式研究系统。2011年《自然•方法》（NatureMethods）将其列为年度技术，而2012年的《科学》（Science）则将TALEN技术列入了年度十大科技突破，针对该文的评论更是给予它基因组的巡航导弹技术的美誉。TAL效应因子（TALeffector,TALE）最初是在一种名为黄单胞菌（Xanthomonassp.）的植物病原体中作为一种细菌感染植物的侵袭策略而被发现的。这些TALE通过细菌III类分泌系统（bacterialtypeIIIsecretionsystem）被注入植物细胞中，通过靶定效应因子特异性的基因启动子来调节转录，来促进细菌的集落形成。由于TALE具有序列特异性结合能力，研究者通过将FokI核酸酶与一段人造TALE连接起来，形成了一类具有特异性基因组编辑功能的强大工具，即TALEN。

53基于TALEN的靶向基因修饰技术本质是一个人工合成的核酸酶，主要有两个结构域：特异性识别靶核酸序列的结合功能域TALE；切断DNA序列的核酸酶功能结构域FokI。54诱发DNA损伤修复机制：非同源末端连接

同源定向修复554.CRISPR-Cas9(ClusteredRegularlyInterspacedShortPalindromicRepeatsequences,CRISPR-associatedgene9)Cas9内切酶必须在向导RNA分子的引导下对DNA进行切割，因为这些向导RNA分子含有与靶DNA序列互补的序列，称之为PAM序列。Cas9内切酶的HNH核酸酶结构域剪切互补链，其RuvC-like结构域剪切非互补链。56PAM:protospaceradjacentmotif

CRISPER:规律成簇的间隔短回文重复序列57585.反义RNA(anti-senseRNA)定义：与mRNA互补的RNA链，称作反义RNA。用途：封闭特定mRNA的翻译，从而使基因失活。实例：

BCL-2癌基因的anti-

senseoligonucleotide，通过与细胞内mRNA互补，封闭该基因的表达，从而治疗B淋巴瘤。591995年，康奈尔大学Su博士的实验：用反义RNA(anti-senseRNA)转染线虫可以阻断par-1基因的表达；惊讶地发现：在正义RNA(senseRNA)的对照组中没出现预期的增强基因表达的现象，却出现了基因表达受抑现象。有趣的实验现象客观地呈现这一现象

Why？这与传统上对反义RNA技术的解释正好相反，他们一直没能给这个意想不到的结果作出合理解释。601998年:

Fire和Mello的实验揭开这个悬疑之谜：AndrewZ.FireStanfordUniversitySchoolofMedicineCraigC.MelloUniversityofMassachusettsMedicalSchool用纯化后的单链RNA注射线虫，基因抑制现象是非常微弱的！将双链RNA给线虫注射，出现了高效、特异性的基因抑制效应。

解释：

SuGuo博士在转染正义RNA时污染了微量反义RNA，“十分错误”地将双链RNA(dsRNA)导入了细胞。双链RNA比单链RNA的基因抑制现象的要高效的多。61将dsRNA去除后，再将正义的ssRNA

注入线虫卵中，没有产生基因沉默现象。将正义及反义ssRNA混合，经退火复性后得到的dsRNA注人线虫卵中可以显著地产生基因沉默现象，印证了Fire等提出的RNAi作用是由dsRNA引起的结论。1999年：Hunter等的实验进一步验证了RNAi的存在。62他们将这种由双链RNA引起的特异性基因抑制现象，称作RNA干涉（RNAi）。Fire,A.etal.Potentandspecificgeneticinterferencebydouble-strandedRNAinCaenorhabditiselegans.Nature391,806-811.(1998)美国科学家安德鲁·法尔(左)和克雷格·梅洛(右)：发现了ＲＮＡ干扰机制。AndrewZ.FireStanfordUniversitySchoolofMedicineCraigC.MelloUniversityofMassachusettsMedicalSchool63（一）概念（二）发生机制（三）两种常用策略（四）存在的问题（五）应用6.RNA干涉(RNAinterference)641.

RNAi技术的概念利用双链RNA

介导同源序列的mRNA特异性降解，导致的转录后基因沉默。652.

RNAi技术的作用机制Dicer负责识别并切割dsRNARNaseⅢ家族中成员识别、降解双链RNA产生约21~23nt

bp片段每个片段3端有2个碱基突出66橙色：解旋酶绿色：内切酶灰色：外切酶细胞中存在的一种RNA诱导的沉默复合体(RNA-inducedsilencingcomplex,

RISC)(由核酸内切酶、核酸外切酶、解旋酶等构成，作用是对靶mRNA进行识别和切割）2.

RNAi技术的作用机制67

RISC中的解旋酶将其中的siRNA变成单链,成为activatedRISC。ActivatedRISC与靶mRNA互补结合，利用自身核酸内切酶活性将mRNA切断、降解。细胞内的异常dsRNA被Dicer酶特异识别、切割成长21~23nt的短双链RNA，称为小干扰性RNA(smallinterferingRNA,siRNA)。siRNA与细胞内的某些酶和蛋白质形成复合体，称为RNA诱导的沉默复合体（RISC)。RNA干扰的作用机制（2个阶段)**起始阶段效应阶段68确定目的基因，设计siRNA

序列A.化学合成或体外转录在体外获得

siRNAB.构建shRNA表达载体转染细胞转染细胞在细胞内产生SiRNARNAi效果检测3.RNAi技术的两种常用策略69siRNA的化学合成

按照设计的序列分别合成两条反向互补的单链RNA

然后等比例混合退火即可。siRNA:5’-CGAUUGACAGCGGAUUGCCUU-3’3’-UUGCUAACUGUCGCCUAACGG-5’

SenseRNA:5’-CGAUUGACAGCGGAUUGCCUU-3’AntisenseRNA:5’-GGCAAUCCGCUGUCAAUCGUU-3’A.在体外获得siRNA途径70SiRNAATargetingmRNAcleavagesuppressionSiRNASiRNA特点：将体外获得的siRNA转染到细胞内：通常在3-7天可以维持较高的基因表达抑制效应。大部分RNAi实验可以在此期间获得结果。优点：无需构建载体，节省时间。缺点：（1）效应期的长短主要取决于细胞的增殖速度，无法长期保存转染细胞！（2）转染效率无法保证！A.在体外获得siRNA途径71B.采用shRNA表达载体途径shRNA表达载体的表达框架包括：一个RNApolIII启动子，

一段发夹结构siRNA编码序列，一个RNApolIII终止位点。PromoterterminatorSensesequenceAnti-sensesequenceloopRNApolⅢ启动子(U6)可以在哺乳动物细胞中表达小分子RNA。72shRNA构建shRNA表达载体UU3’5’LoopSensestrandAntisensestrand19nt将重组质粒转染细胞，在细胞内转录持续产生发夹shRNAB.采用shRNA表达载体途径73

shRNA

(shorthairpinRNA，短发夹RNA）策略：

利用shRNA表达质粒，质粒中含有编码正义和反义siRNA序列的DNA序列在细胞中转录出单链RNA，转录物随即形成发夹结构，中间有约9bp的不配对的序列，即为shRNA。shRNA被Dicer加工成siRNA，导致RNAi的发生。B.采用shRNA表达载体途径74通过转染shRNA表达载体，可以长期地抑制基因表达。在长效

RNAi实验（特别是体内试验）时，只能选择shRNA表达载体方法。优点：B.采用shRNA表达载体途径75小结：RNAi实验的两种策略UUSiRNADicerRNaseIII(1)TransfectionA(2)(3)TargetingmRNAcleavagesuppressionSiRNA(4)SiRNAB76[Summary]

比较项目化学合成siRNA表达载体材料需求

21-merRNAoligos(一对)55-60-merDNAoligos(一对)制备的难易简单、快速需要制备重组载体该方法可在胞内持续产生siRNA，适用于长期研究;在体内试验时，只能选择该方法。将siRNA转染到细胞内：通常在3-7天可以维持较高的基因表达抑制效应。效应期的长短取决于细胞的增殖速度无法长期保存转染细胞转染效率无法保证！效应期的长短费用高中等可否进行标记可以不可以774.

RNAi技术存在的问题（1）

siRNA复合物除了预期的靶点，还能潜在地靶向多个基因。这个现象即“脱靶效应(off-targeting)

*”。问：你所设计的RNAi，会不会干涉其它基因的翻译？siRNA的Off-targeting的定义及其产生原因78问：RNAi为什么可能存在在脱靶(off-targeting)效应？正义链与RISC结合79•解决办法：链偏好性（Strandbias）*使RISC只结合SiRNA的反义链。80RNAi技术还需进行不断的完善！siRNA并不能接近所有与其同源的mRNA分子，有些mRNA序列位于RNA的二级结构中，或与蛋白质形成紧密的复合物，碍阻了siRNA对靶序列的识别。因此，往往要经过不断的摸索才能选择出最佳的靶序列。目前虽然可将siRNA高效地导入体外培养的细胞。但，如何高效地、靶向性地导入动物体内特定组织，还是一个急需解决的问题！4.

RNAi技术存在的问题（2）81（1）研究基因的功能5.RNAi技术的应用高效率易于操做可实现多种基因突变RNAi(knockdown)

VS

knockoutRNAi技术的优点：利用RNAi能在短时间内高效特异地抑制靶基因表达的特点，可以很方便地研究基因的功能。82肿瘤细胞（2）基因治疗的新策略肿瘤治疗：由于单一癌基因的阻断不可能完全抑制或逆转肿瘤的生长，而RNAi技术能同时特异性阻断多个癌基因的表达。如何设计实验？1.Dicer功能2.SiRNA的选择3.在体内研究功能83Suppressionofheatshockprotein27induceslong-termdormancyinhumanbreastcancer

抑制HSP27,会诱导人乳腺癌长期休眠----ProcNatlAcadSciUSA.2012May29;基因功能研究的实例

84Humanbreastcancercellline(MDA-MB-436)AngiogeniccellvariantNon-angiogenic

cellvariantTheresearchersestablishedanexperimentalmodelforthestudyofhumantumorangiogenesisanddormancy.DevelopintobigTumorRemaindormantwithoutprogressionintodetectabledisease85Humanbreastcancercellline(MDA-MB-436)AngiogeniccellvariantNon-angiogenic

cellvariantWesternblotanalysisResult1.Heatshockprotein27(HSP27)ishighlyup-regulatedinangiogenicbreastcancercells,comparedwithnonangiogeniccells.86Comparedwiththeoriginalcellline,expressionofHSP27proteinwas20%lowerinHSP27KD-1cells,70%lowerinHSP27KD-2cells,84%lowerinHSP27KD-3cells.AngiogenicbreastcancercellsweretransducedwithlentivirusesencodingthreedifferentshRNAsagainstHSP27(HSP27KD-1,HSP27KD-2,andHSP27KD-3).Result2.

AngiogenicbreastcancercellsHSP27-