(30)-实验：质粒DNA的提取及琼脂糖凝胶电泳

生物化学与分子生物学实验实验学时：8学时实验类型：综合性 每组人数：2-3人／组

实验一 质粒DNA的提取及鉴定

实验目的熟悉碱裂解法提取质粒和琼脂糖凝胶电泳的操作过程了解质粒的其他提取方法及质粒在基因工程中的应用掌握碱裂解法提取质粒和琼脂糖凝胶电泳的原理实验背景

质粒（Plasmid)是细菌细胞内一种自我复制的环状双链DNA分子，能稳定地独立存在于染色体外，并传递到子代，一般不整合到宿主染色体上。大多数来自细菌的质粒是双链、共价闭合环状的分子，以超螺旋形式存在；质粒DNA两条链中有一条链发生一处或多处断裂，称为开环DNA；如果质粒DNA的两条链在同一处断裂，则形成线状DNA。当提取的质粒DNA电泳时，同一质粒DNA其超螺旋形式的泳动速度要比开环和线状分子的泳动速度快。5质粒plasmid是存在于细菌染色体外的小型闭合环状双链DNA分子，在宿主细胞内可独立自主复制并赋予宿主细胞一定的遗传性状质粒DNA1、部位不同：2、大小不同：质粒分子量较小，大小只有普通细菌染色体DNA的百分之一。基因组DNA分子量较大，细菌基因组约含3000个基因质粒DNA与基因组DNA区别pEGFP-N1质粒筛选标记MCS（多克隆位点）复制原点筛选标记

多克隆位点

复制原点质粒提取方法的选择决定使用不同的方法质粒的量质粒的纯度要求质粒的大小大量提取质粒：二次扩增细菌，纯化方法要复杂小量提取质粒：单克隆培养，普通碱裂解法质粒纯度：要求高纯度、无内毒素等等，用不同的纯化方法（满足各种转基因实验的要求）质粒过大：温和裂解法质粒大小适中：碱裂解，煮沸法商业化质粒提取试剂盒11

二、实验原理

高碱细菌的细胞壁破裂，内容物释放①染色体DNA断裂成不同长度的线性双链DNA；②线性双链DNA片段中的氢键断裂，双链解离变性。①质粒DNA不发生断裂，保持双链闭合环状；②双链DNA并不完全分离。高酸中和至中性变性的染色体DNA与变性的蛋白质以及细胞碎片凝聚成网络状大分子不溶性沉淀物质粒DNA又恢复天然构型，溶解在上清液中纯化RNA酶消化除去RNA，并用酚抽提法除去残留的蛋白质碱裂解法提取质粒的原理1、强碱和SDS裂解细菌，细菌中的质粒或基因组DNA在碱性条件下发生变性。2、怎样去除基因组DNA？当加入酸性物质进行中和时，质粒DNA很快复性，染色体DNA则和变性蛋白质等缠绕在一起难以复性而形成沉淀，经离心随细胞碎片一起去除；3、怎样去除蛋白质？留有质粒DNA的上清，经酚和氯仿去除蛋白质后,用乙醇沉淀质粒DNA，即得到质粒DNA.三、仪器、材料与试剂(一)仪器1．恒温培养箱2．恒温摇床3．台式离心机4．高压灭菌锅

(二)材料1．含连接外源基因质

粒的E.coli

2．1.5mLEppendorf管3．吸头、微量移液器SolutionI

50mmol／L

葡萄糖25mmol／LTris·HCl(pH8.0)10mmol／LEDTA(三)主要试剂溶液Ⅰ：由葡萄糖、EDTA、Tris-HCl组成(保护、缓冲)葡萄糖的作用是增加溶液的粘度,减少抽提过程中的机械剪切作用,防止破坏质粒(保护作用)EDTA

的作用是络合掉镁等二价金属离子,防止DNA酶对质粒分子的降解作用（保护作用）Tris-HCl使溶菌液维持溶菌作用的最适PH范围（缓冲作用）SolutionII

0.4mol/LNaOH，2％SDS,用前等体积混合

溶液II：由SDS（十二烷基硫酸钠）与NaOH组成(裂解、变性)SDS的作用是解聚核蛋白并与蛋白质分子结合使之变性（裂解细胞和蛋白质变性作用）NaOH（PH>12）的作用是破坏氢键，使DNA分子变性（DNA变性作用）

SDS是一种阴离子表面活性剂，它既能使细菌细胞裂解，又能使一些蛋白质变性，所以SDS处理细菌细胞后，会导致细菌细胞壁的破裂，从而使质粒DNA以及基因组DNA从细胞中同时释放出来。释放出来的DNA遇到强碱性(NaOH)环境，就会变性。然后，用酸性乙酸钾来中和溶液，使溶液处于中性，质粒DNA将迅速复性，而基因组DNA，由于分子巨大，难以复性。离心后，质粒DNA将在上清中，而基因组DNA则与细胞碎片一起沉淀到离心管的底部。通过这种方法即可将质粒DNA从细菌中提取出来。溶液III：HAc和KAc组成的高盐溶液(复性，分离)HAc溶液能中和溶液Ⅱ的碱性，使染色体DNA变性而发生缠绕，并使质粒DNA复性。KAc会与SDS形成溶解度很低的盐，并与蛋白质形成沉淀而除去；溶液中的DNA也会与蛋白质-SDS复合物缠绕成大分子而与小分子质粒DNA分离。SolutionIII

5mol／L乙酸钾60mL

冰乙酸11．5mL

水28．5mL

TE缓冲液

10mmo1／LTris·HCl1mmo1／LEDTA(pH8.0)胰RNA酶溶液

将RNA酶溶于10mmo1/LTris·HCl(pH7．5)和15mmo1/LNaCl中，配成10mg/mL的浓度，于100℃加热15min，缓慢冷却至室温，保存于-20℃。

四、实验步骤加1.5ml培养物于EP管，12000g×2min

除去上清，加入冰的200µl溶液I，剧烈振荡EP管，室温3min

加入300µl溶液II，快速颠倒数次，冰浴3min

加入400µl冰溶液III，温和振荡10s，冰浴5min，12000g×5min转移上清到新吸附柱，加入漂洗液，12000g×1min（反复)

吸附柱开盖室温静置1min，加入50-100µl洗脱缓冲液回收纯化的质粒DNA

取10

l的质粒DNA

加2

l上样液混匀。加到1%琼脂糖凝胶的加样孔内。电泳条件：100V40min。电泳结束后照像保存，结果分析。

质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳21

质粒DNA的浓度测定计算公式：1.0OD260nm=50ug/mlDNA质粒DNA(ug/ml)=50×OD260nm×稀释倍数22一、实验目的

通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术。

琼脂糖凝胶电泳检测DNADNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应,DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖—磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型。具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样，可进行分离。DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系。二、实验原理

溴化乙锭在紫外光照射下能发射荧光，当DNA样品在琼脂糖凝胶中从负极向正极泳动时，溴化乙锭从正极向负极移动，这样溴化乙锭分子就会嵌入DNA分子中形成络合物，使DNA在紫外光下发射很强的荧光。在溴化乙锭足够的情况下，荧光的强度正比于DNA的含量，这样就可以检测DNA的浓度。因此电泳后呈3条带，超螺旋质粒DNA泳动最快，其次为线状DNA，最慢的为开环质粒DNA。

凝胶电泳不仅可分离不同相对分子质量的DNA，也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子。如上次实验提取的质粒DNA，有3种构型,这3种构型的质粒DNA分子在凝胶电泳中的迁移率不同。

三、仪器、材料与试剂

(一)仪器

1．微波炉

2．琼脂糖凝胶电泳系统

3．移液器

4．凝胶成像系统

(二)试剂1．（1）5×TBE(50倍体积的TBE贮存液）配1000mL5×TBETris54g

硼酸27.5g

0.5mol／LEDTA20mLpH8.0

或（2）50×TAE(50倍体积的TAE贮存液）

Tris242g

乙酸57mL

0.5mol／LEDTA100mLpH8.02．凝胶加样缓冲液(6x)3．琼脂糖4．溴化乙锭溶液(EB)0.5ug／mL琼脂糖凝胶电泳

琼脂糖是一种海藻多糖，结构单元是D-半乳糖和3.6-脱水-L-半乳糖。通过改变琼脂糖凝胶的浓度，可以分离200到50,000bp大小的DNA片断。28琼脂糖凝胶缓冲液适用于双链DNA的电泳缓冲液Tris-乙酸盐和EDTA缓冲液（TAE）Tris-硼酸盐缓冲液(TBE)Tris-磷酸盐缓冲液(TPE)29DNA分子在碱性缓冲液中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。不同DNA的分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。DNA分子的迁移速度与分子量的对数值成反比关系。30琼脂糖凝胶操作步骤1.

根据电泳需要，配置合适浓度的电泳及制胶缓冲液。取0.5g琼脂糖，放入锥形瓶中，加入50mL0.5xTAE缓冲液（配1%）2.

根据制胶量及凝胶浓度，在加有一定量的电泳缓冲液的三角锥瓶中，加入准确称量的琼脂糖粉。

注意：用于电泳的缓冲液和用于制胶的缓冲液必须是相同的。

注意：总液体量不宜超过三角锥瓶的50%容量。

注意：必须保证琼脂糖充分完全溶解，否则，会造成电泳图像模糊不清。

注意：加热时如胶液剧烈沸腾发泡，停止加热。微波炉中加热时间不宜过长。注意：由于蒸发作用，溶解前在容量瓶上作一个记号，溶解后用三蒸水补足。3.在微波炉中加热溶解琼脂糖。324.

使溶液冷却至60℃左右，如需要可在此时加入溴化乙锭(EB)溶液使其终浓度为0.5ug/ml，并充分混匀。5.将琼脂糖溶液倒入制胶模中，然后在适当位置处插上梳子。凝胶厚度一般在3－5mim之间。注意：溴化乙锭是一种致癌物质。使用含有溴化乙锭的溶液时，请戴用手套。溴化乙锭在可见光下会分解。

注意：不要产生气泡，影响电泳效果。336.在室温下使胶凝固（大约30分钟），然后放置于电泳槽中进行电泳。

注意：凝胶不立即使用时，用保鲜膜将凝胶包好在4℃下保存，或者放在制胶的缓冲液中，一般可保存2～5天。电泳缓冲液刚好没过凝胶1mm为好，太多则电流加大，凝胶发热。347.LoadingDNAsamples(加样)

用移液枪缓慢将DNA样品垂直加入加样孔直至开口下方。1.DNAsamples：

10µl2.Loadingbuffer(6X)：2µl3.DNAmarkers

：6µl

Total

12µl358.电泳接通电泳槽与电泳仪的电源(注意正负极，DNA片段从负极向正极移动)。保持电压60-80V。当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿1-2cm