基因工程的基本操作程序课件新人教选修

基因工程的基本操作程序课件新人教选修第1页，共46页，2023年，2月20日，星期四基因工程基本操作的四个步骤1、目的基因的获取2、基因表达载体的构建3、将目的基因导入受体细胞4、目的基因的检测与鉴定第2页，共46页，2023年，2月20日，星期四一、目的基因的获取(一)、目的基因主要是______________________编码蛋白质的结构基因请举出三个以上的例子（二）、获取目的基因的常用方法有哪些?1、从基因文库中获取2、利用PCR技术扩增3、人工合成请阅读P9第一和二两段第3页，共46页，2023年，2月20日，星期四1.目的基因的获取（1）直接从生物体中提取总DNA，构建基因组DNA文库(genomicDNAlibrary)，从中调用目的基因；第4页，共46页，2023年，2月20日，星期四

基因组DNA文库的构建将总DNA经过酶解，分离不同长短的DNA片段。包含的基因组片段分别克隆在质粒或噬菌体载体上，转染细菌或体外包装到噬菌体颗粒上便构成了该生物的基因组文库。第5页，共46页，2023年，2月20日，星期四①基因组文库的构建（2）.基因文库的构建方法通过对受体菌的培养而储存基因第6页，共46页，2023年，2月20日，星期四②cDNA文库的构建-----反转录法：

以目的基因转录成的信使RNA为模板，反转录成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需的基因。目的基因的mRNA单链DNA反转录酶DNA聚合酶双链DNA(目的基因)第7页，共46页，2023年，2月20日，星期四第8页，共46页，2023年，2月20日，星期四cDNA(互补DNA)：是由生物的某一特定器官或特定发育时期细胞内的mRNA经体外反转录后形成的互补DNA片段，与载体连接后储存在一个受体菌群中，这个受体菌群就叫做这种生物的cDNA文库2)cDNA文库(cDNAlibrary)基因重组反转录酶mRNAcDNA第9页，共46页，2023年，2月20日，星期四1、原核细胞的基因结构非编码区非编码区编码区编码区上游编码区下游与RNA聚合酶结合位点启动子终止子启动子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片断，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白质终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断，能终止mRNA的转录第10页，共46页，2023年，2月20日，星期四①不能转录为信使RNA，不能编码蛋白质。：能转录相应的信使RNA，能编码蛋白质编码区非编码区原核细胞的基因结构②有调控遗传信息表达的核苷酸序列.包括启动子和终止子非编码区非编码区编码区编码区上游编码区下游启动子终止子第11页，共46页，2023年，2月20日，星期四2、真核细胞的基因结构编码区非编码区非编码区与RNA聚合酶结合位点内含子外显子能够编码蛋白质的序列叫做外显子不能够编码蛋白质的序列叫做内含子启动子终止子编码区上游编码区下游内含子：外显子：第12页，共46页，2023年，2月20日，星期四原核细胞真核细胞不同点编码区是_____的编码区是间隔的、_____的相同点都由能够编码蛋白质的______和具有调控作用的______区组成的3、原核细胞与真核细胞的基因结构比较思考编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细胞与真核细胞基因结构一样长吗？连续不连续编码区非编码第13页，共46页，2023年，2月20日，星期四基因组文库和部分基因组文库(cDNA文库)比较第14页，共46页，2023年，2月20日，星期四怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因呢?第15页，共46页，2023年，2月20日，星期四依据：目的基因的有关信息。如：根据基因的核苷酸序列基因的功能基因在染色体上的位置基因的转录产物mRNA

基因翻译产物蛋白质等特性④从基因文库中得到目的基因的方法第16页，共46页，2023年，2月20日，星期四2、利用PCR技术扩增目的基因第17页，共46页，2023年，2月20日，星期四①概念：PCR全称为_______________，是一项在生物____复制___________的核酸合成技术③条件：_______________________、

_______________、___________、____________________等②原理：__________④方式：以_____方式扩增，即____（n为扩增循环的次数）⑤结果：多聚酶链式反应体外特定DNA片段DNA复制四种脱氧核苷酸一对引物热稳定DNA聚合酶指数2n使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增要有一段已知目的基因的核苷酸序列（前提条件）第18页，共46页，2023年，2月20日，星期四⑥过程：a、高温变性（90℃-95℃）：双链DNA模板在热作用下，_____断裂，形成___________b、退火（复性55℃-60℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部________。c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，合成与模板互补的________。氢键单链DNA双链DNA链第19页，共46页，2023年，2月20日，星期四第20页，共46页，2023年，2月20日，星期四3、人工合成法：基因较小，核苷酸序列已知，可以利用DNA合成仪人工合成第21页，共46页，2023年，2月20日，星期四二、基因表达载体的构建4、切割质粒和目的基因的限制性内切酶是否要求一样？为什么？2、表达载体至少带有哪些结构？各有什么作用？思考：3、构建表达载体时需要哪些工具？1、这步是基因工程的核心，构建基因表达载体的目的是什么？——

核心第22页，共46页，2023年，2月20日，星期四二、基因表达载体的构建

——基因工程的核心1、目的：所需物质：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。它们各自的作用是什么?第23页，共46页，2023年，2月20日，星期四启动子：位于基因首端，RNA聚合酶识别和结合部位，启动转录终止子：位于基因尾端，终止转录标记基因：鉴别受体细胞内是否含目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来目的基因：外源DNA分子的有效片段。第24页，共46页，2023年，2月20日，星期四1.用一定的_________切割质粒，使其出现一个切口，露出____________。2.用_____________切断目的基因，使其产生_________________。3.将切下的目的基因片段插入质粒的______处，再加入适量___________，形成了一个重组

DNA分子（重组质粒）限制酶黏性末端同一种限制酶的黏性末端切口DNA连接酶相同(二).过程第25页，共46页，2023年，2月20日，星期四①载体与表达载体的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构②用到的工具酶：既用到限制酶切割载体，又用到DNA连接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键③启动子、终止子对于目的基因表达必不可少④目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表达载体的方式携带进去。注意第26页，共46页，2023年，2月20日，星期四三、目的基因导入受体细胞1、导入植物细胞常用的方法是什么？原理是什么？具体过程是怎样的？3、导入大肠杆菌的方法是怎样的？钙离子有什么作用？2、导入动物细胞常用的方法是什么？基本操作程序是怎样的？第27页，共46页，2023年，2月20日，星期四三将目的基因导入受体细胞（一）转化：（二）方法将目的基因导入植物细胞将目的基因导入动物细胞将目的基因导入微生物细胞农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法——显微注射法——感受态细胞目的基因进入_________内，并且在受体细胞内维持_____和_____的过程受体细胞稳定表达第28页，共46页，2023年，2月20日，星期四1.目的基因导入植物细胞：

目的基因进入受体细胞内，在受体细胞内维持稳定和表达的过程A.转化的概念：B.农杆菌的特点

农杆菌易感双子叶和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力(1)农杆菌转化法C、原理：Ti质粒上的T---DNA可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上。第29页，共46页，2023年，2月20日，星期四（2）过程目的基因插入到____________,构建___________,______菌______细胞整合到______细胞的____________上,_________.转入侵染

④优点:比较经济和有效第30页，共46页，2023年，2月20日，星期四（2）基因枪法（3）花粉管通道法第31页，共46页，2023年，2月20日，星期四2.目的基因导入动物细胞（１）．方法:显微注射技术（２）基本操作程序：含有目的基因的表达载体______显微注射受精卵移植到雌性动物体的＿＿＿＿，输卵管或子宫内提纯取卵（）受精卵使发育成为具新现状的动物第32页，共46页，2023年，2月20日，星期四3、将目的基因导入微生物细胞（1）思考：为什么选用微生物作为受体细胞？繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少(２)．最常用的原核细胞_____________（３）转化方法:第一步：用_____处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的状态（_________细胞）第二步：将溶于_______缓冲液中与＿＿＿＿＿细胞混合，在一定温度下促进________细胞吸收DNA分子，完成转化过程表达载体感受态感受态感受态Ca2+第33页，共46页，2023年，2月20日，星期四方法将目的基因导入植物细胞将目的基因导入动物细胞将目的基因导入微生物细胞农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法——显微注射法——感受态细胞三、目的基因导入受体细胞第34页，共46页，2023年，2月20日，星期四(四)目的基因的检测与鉴定——检查是否成功检测—①检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因②检测目的基因是否转录出了mRNA③检测目的基因是否翻译成蛋白质方法——方法——方法——DNA分子杂交法

分子杂交技术抗原抗体杂交法分子水平的检测第35页，共46页，2023年，2月20日，星期四1、检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因①.首先取出转基因生物的基因组DNA②.用含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作标记,以此做探针③.使探针和转基因生物的基因组杂交,若显示出杂交带,表明染色体已插入染色体DNA中（1）方法:DNA分子杂交幻灯片37（2）过程:第36页，共46页，2023年，2月20日，星期四DNA分子杂交示意图

采用一定的技术手段，将两种生物的DNA分子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序列的部位，仍然是两条游离的单链。P15思考与探究第37页，共46页，2023年，2月20日，星期四基因探针（DNA探针）与目的基因杂交，有无杂交带第38页，共46页，2023年，2月20日，星期四2、检测目的基因是否转录出了mRNA3、检测目的基因是否翻译成蛋白质①方法:分子杂交方法:抗原抗体杂交②过程:用上述探针和转基因生物的mRNA杂交,若出现杂交带,表明目的基因转录出了mRNA第39页，共46页，2023年，2月20日，星期四检测二：个体生物学水平的鉴定

用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不出现中毒症状，说明未摄入目的基因或摄入目的基因未表达。如虫吃后中毒死亡，则说明摄入了抗虫基因并得到表达。鉴定——抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等第40页，共46页，2023年，2月20日，星期四归纳:基因工程的基本操作程序获取目的基因从基因文库利用PCR化学方法人工合成构建基因表达载体目的基因、启动子、终止子、标记基因将目的基因导入受体细胞农杆菌转化法、显微注射法目的基因的检测与鉴定检测：是否插入、转录、翻译鉴定：第41页，共46页，2023年，2月20日，星期四练习1：(2008理综山东卷)为扩大可耕地面积，增加粮食产量，黄河三角洲等盐碱地的开发利用备受关注。我国科学家应用耐盐基因培育出了耐盐水稻新品系。（1）获得耐盐基因后，构建重组DNA分子所用的限制性内切酶作用于图中的

处，DNA连接酶作用于

处。（填“a”或“b”）第42页，共46页，2023年，2月20日，星期四练习1：(2008理综山东卷)为扩大可耕地面积，增加粮食产量，黄河三角洲等盐碱地的开发利用备受关注。我国科学家应用耐盐基因培育出了耐盐水稻新品系。（2）将重组DNA分子导入水稻受体细胞的常用方法有农杆菌转化法和