核酸的生物合成2课件

§2

BiosynthesisofRNATranscriptionReplicationreversetranscript一、转录（Transcription）概念：DNA的遗传信息转移到RNA分子中的过程，即通过酶促合成与基因编码链碱基序列相同的RNA链，转录产物有3种RNA：mRNA,rRNA,tRNA。DNA-DependentSynthesisofRNA不对称转录

在生物体内，DNA的两条链中只有一条用于转录，另一条链可能对转录起调节作用。用于转录的链为模板链（templatestrand）/负链/反义链/非编码链；另一条链称为非模板链/正链/有义链/编码链。

由于转录只在DNA的一条链进行，所以称为不对称转录。基因的有义链并不总是在染色体DNA的同一条链上。基因的转录是有选择的：时间（不同的发育时期）、空间（不同的器官组织/细胞）。 区别于复制！

转录单位

(transcript)：被转录成单个RNA分子的一段DNA

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||5'终止序列promoter起始位点调节区转录因子：参与RNA聚合酶进行转录活动的辅助因子，为蛋白质。终止子：提供转录停止信号的DNA序列（核苷酸片段）。upstream-112downstream(一)RNA合成的酶促反应n1ATPn2GTPn3CTPn4UTP+DNAtemplate

AMPn1GMPn2CMPn3UMPn4RNARNApolymeraseMg2+,Zn2++(n1+n2+n3+n4)PPiRNAIsSynthesizedbyRNAPolymerase新合成链的5’端常是GTP或ATP，它们的5’–三磷酸基团在转录过程中保留完整。转录时，DNA双链只部分解链，新RNA链与模板链形成RNA-DNA杂交链。底物：NTP；方向：5’→3’有转录起始位点，合成不需要引物，RNA聚合酶“无校正功能”碱基配对：dT-A,dA-U,dC-G,dG-C基本特点！σ因子转录开始时识别转录起始点，使全酶结合在起始位点上，形成全酶-DNA复合物,而在转录合成开始后被释放，由核心酶催化RNA的合成。结合调控序列催化磷酸二酯键形成与模板DNA结合识别启动子,起动合成σ因子先识别-35区保守序列，并与之结合，该区是聚合酶的初始识别位点。原核中，-35与-10区之间的距离（16~19bp）对于转录很重要，而之间的碱基序列对转录并不重要。转录过程起始延长终止转录起始σ因子识别DNA上的起始位点形成全酶-DNA二元复合物DNA解链，形成转录泡（transcriptionbubble）β亚基催化形成RNA的第一个核苷三磷酸（GTP或ATP），形成启动子、全酶和核苷三磷酸组成的三元起始复合物合成8-9ntRNA后，σ亚基被释放脱离核心酶

ρ-非依赖性终止子：在终止点之前具有一段富含G-C的回文序列；富含G-C的区域之后是一连串的dA碱基序列，它们转录的RNA链的末端为一连串U（连续6个）。转录出的RNA形成的发夹结构中断了DNA-RNA杂合体的形成ρ-依赖性终止子

有的终止子要因子的帮助才能终止转录。其回文结构不富含G-C区，其后无寡聚U。细菌中少见，噬菌体中广泛存在。

（三）真核生物转录作用真核生物有三种RNA聚合酶：RNA聚合酶I、II、IIIP562~565真核生物的启动子由转录因子而不是RNA聚合酶所识别对α-鹅膏蕈碱的敏感性不敏感敏感中等敏感（四）转录过程的选择性抑制剂按照作用的对象、性质不同，分为2种：一、模板功能的抑制剂嵌合剂：如放线菌素D(p266)嵌入dG-dC之间溴乙锭EB为高灵敏度荧光试剂

吖啶二、RNA聚合酶的抑制剂原核生物：利福霉素（衍生物：利福平）真核生物：-鹅膏蕈碱1.rRNA前体的转录后加工（1）

原核生物rRNA前体的加工30S→16S、23S、5S、tRNA（2）真核生物rRNA前体的加工45S→5.8S、18S、28S（5SrRNA由其它途径产生）甲基化修饰：修饰在碱基(原)、核糖(真)上

剪切作用：需专一核酸酶参与

自我剪接：一种核酶的作用（真）加工过程2.tRNA前体的加工

细胞内tRNA种类多，各种tRNA加工方式不同，但主要方式有以下几种：除去前体5’和3’端多余的核苷酸（有时tRNA分子酶解产生2个或更多的tRNA）3’末端加上CCA碱基的修饰：甲基化、脱氨和还原作用碱基甲基化修饰：甲基供体是SAM（S-腺苷甲硫氨酸）。ProcessingoftRNAsinbacteriaandeukaryotesRNaseP(5’成熟酶）、RNaseD（3’成熟酶）均识别tRNA空间结构；碱基甲基化修饰：甲基供体是SAM（S-腺苷甲硫氨酸）。m7Gppp5’端加帽子结构5′,5′–三磷酸桥5’端加帽反应在RNA合成了30核苷酸后就开始进行。甲基化反应由SAM（S-腺苷甲硫氨酸）提供甲基。5‘端为三磷酸嘌呤核苷3’端加polyAa.thecleavagesignalsequencesisboundbyanenzymecomplex.b.TheRNAiscleavedbytheendonucleaseatapoint10to30nucleotides3‘to(downstreamof)thesequenceAAUAAA.c.Thepolyadenylatepolymerase(多聚腺苷酸聚合酶)synthesizesapoly(A)tail80to250nucleotideslong,beginningatthecleavagesite.RNASplicing：在基因转录过程中，内含子与外显子同时被转录，产物为RNA前体，切除前体中的内含子，将外显子连接形成成熟RNA的过程。*RNA剪接与RNA修饰无关，对不存在Cap、polyA的mRNA序列同样可以剪接。*真核生物细胞核mRNA前体的剪接是在形成剪接体（spliceosome）后才能进行。剪接体是包括mRNA前体在内的多组分复合物。*内含子一般以GU开始到AG结束。类型Ⅰ自我剪接两次转酯反应亲核试剂来自鸟苷酸真核生物细胞器基因，低等真核生物核rRNA基因，细菌和噬菌体个别基因。例：四膜虫6400nt

pre-rRNA的加工类型Ⅱ自我剪接两次转酯反应亲核试剂来自内含子真菌线粒体，植物叶绿体基因RNAediting：RNA编码序列的改变。RNArecoding：RNA读码和编码方式的改变。以RNA携带遗传信息，并能通过RNA复制与自身相同RNA分子的生物，如（+）RNA和（-）RNA：通常将具有mRNA功能的链称为（+）RNA，而它的互补链为（-）RNA。带（+）RNA的病毒可直接进行与病毒繁殖有关的蛋白质合成。1.（+）RNA病毒：不含复制酶，如灰质炎病毒和噬菌体Qβ。2.（-）RNA病毒：含有复制酶，如狂犬病病毒，H1N1流感病毒。3.（±）RNA病毒：含双链RNA和复制酶，如呼肠孤病毒。4.逆转录病毒：致癌RNA病毒，如白血病病毒，AIDS病毒。RNA复制类型以病毒RNA直接作为复制的模板；以病毒RNA为模板逆转录出cDNA，然后再从DNA转录出病毒RNA。特殊的复制方式三、逆转录（reversetranscription）

——RNA指导的DNA合成

1970年，Temin、Mizufani、Baltimore同时分别从致癌RNA病毒中发现RNA指导的DNA聚合酶——逆转录酶(reversetranscriptase)，有利地证明了Temin于1964年提出的前病毒学说(previrustheory)。

（1975年获NobelPrize）

前病毒学说：致癌RNA病毒的复制需经过一个DNA中间体即前病毒，此中间体可部分或全部整合到细胞DNA中，并随细胞增殖而传递至子代细胞，细胞的恶性转化就是由前病毒引起的。所有已知的致癌RNA病毒都含有逆转录酶，因此被称为逆转录病毒（retrovirus），基因组均由两条相同的（+）RNA链所组成。逆转录酶是一种多功能酶，兼有3种酶活：RNA指导的DNA聚合酶活性DNA指导的DNA聚合酶活性核糖核酸酶H活性n1dATPn2dGTPn3dCTPn4dTTP+RNAtemplate

dAMPn1dGMPn2dCMPn3dTMPn4DNADNApolymerasePrimer,Zn

2++(n1+n2+n3+n4)PPi逆转录：以RNA为模板在逆转录酶的催化下合成与其碱基互补的DNA的过程。合成的DNA称cDNA(complementaryDNA)。逆转录过程需要引物

(tRNA)两次转换模板Primerbindingsite,PBSPolypurinetract,PPT1234/5RNA指导的DNA聚合酶活性核糖核酸酶H活性No3

-5proofreading1errorper20,000fasterrateofviralevolution6789/10Longterminalrepeat,LTRDNA指导的DNA聚合酶活性逆转录现象并不仅限于病毒。如后来发现的逆转座子，表明逆转录过程在细胞中频繁发生。但在一般的细胞中并无可觉察的逆转录酶活性。其实端粒酶就是一种逆转录酶，其活性只存在于胚胎和肿瘤细胞中，可能细胞的逆转录酶只在一定条件下才能表达，这也是细胞染色体遗传信息得以保持相对稳定的一个原因。OVER基因重组与DNA“克隆”geneticrecombination

and

DNAclone基因重组(geneticrecombination)：染色体DNA分子内或分子间发生交换。自然界的基因转移和重组是无目的基因工程有目的1865年G.J.Mendel的豌豆杂交试验1944年O.T.Avery的肺炎球菌转化实验基因工程大事记1973Cohen第一例成功的克隆实验（美斯坦福大学）1978Genentech公司人胰岛素世界上第一种基因工程蛋白药物（美）

1982第一个基因工程药物--重组人胰岛素在英、美获准使用

1985第一批转基因家畜（兔、猪和羊），中国水生所不育转基因鱼1993保鲜延熟型西红柿在美国上市1999.9中国获准加入人类基因组计划，负责测定人类基因组全部序列的1%2000.6.26科学家公布人类基因组工作草图2001.2.11公布人类基因组基本信息克隆(clone)来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。获取同一拷贝的过程称为克隆化(cloning)，即无性繁殖。DNA克隆DNA克隆应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA）与载体DNA接合成一具有自我复制能力的DNA分子，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一DNA分子，也称基因克隆或重组DNA(recombinantDNA)。