细胞衰老及凋亡课件

请注意观察老人的外部形态有哪些特征?衰老症状与原因分析衰老症状原因分析皮肤干燥、发皱头发变白老人斑饮食减少细胞水分减少，体积减小细胞内的酶活性降低细胞内色素的累积细胞膜通透性功能改变第十三章细胞衰老与凋亡人的寿命应该有多长？哺乳类动物的寿命应该是其生长期的7倍。人的生长期是最后一颗牙齿长出来的时间(20-25岁)。因此人的寿命应该为100-175岁，正常应该是120岁。“衰”是指功能或体力的减退。“老”是指年龄超过某一界限。衰老是机体在退化时期生理功能下降和紊乱的综合表现，是不可逆的生命过程。衰老是客观存在的，是细胞生命活动的客观规律。机体的衰老与细胞的衰老是相关联的。衰老有三种表现形式：生理性衰老、病理性衰老、心理性衰老“衰”与“老”二、细胞衰老的特征（一）形态变化衰老细胞的形态变化主要表现在细胞皱缩，膜通透性、脆性增加，核膜内折，细胞器数量特别是线粒体数量减少，胞内出现脂褐素等异常物质沉积，最终出现细胞凋亡或坏死。总体来说老化细胞的各种结构呈退行性变化.核增大、染色深、核内有包含物染色质凝聚、固缩、碎裂、溶解质膜粘度增加、流动性降低细胞质色素积聚、空泡形成线粒体数目减少、体积增大、mtDNA突变或丢失高尔基体碎裂尼氏体消失包含物糖原减少、脂肪积聚核膜内陷三、细胞衰老的分子机理关于衰老的机理具有许多不同的学说，概括起来主要有差错学派（Errortheories）和遗传学派（Genetic/Programmedtheories）两大类，前者强调衰老是由于细胞中的各种错误积累引起的，后者强调衰老是遗传决定的自然演进过程。其实，现在看来两者是相互统一的（一）差错学派细胞衰老是各种细胞成分在受到内外环境的损伤作用后，因缺乏完善的修复，使“差错”积累，导致细胞衰老。根据对导致“差错”的主要因子和主导因子的认识不同，可分为不同的学说1．代谢废物积累（wasteproductaccumulation）细胞代谢产物积累至一定量后会危害细胞，引起衰老，哺乳动物脂褐质的沉积是一个典型的例子，脂褐质是一些长寿命的蛋白质和DNA、脂类共价缩合形成的巨交联物，次级溶酶体是形成脂褐质的场所，由于脂褐质结构致密，不能被彻底水解，又不能排出细胞，结果在细胞内沉积增多，阻碍细胞的物质交流和信号传递，最后导致细胞衰老，如老年性痴呆（AD）就是由β-淀粉样蛋白沉积引起的，因此β-AP可做为AD的鉴定指标。2．自由基学说（freeradicaltheories）自由基是一类瞬时形成的含不成对电子的原子或功能基团，普遍存在于生物系统。主要包括：氧自由基（如羟自由基·OH）、氢自由基（·H）、碳自由基、脂自由基等，其中·OH的化学性质最活泼。人体内自由基的产生有两方面：一是环境中的高温、辐射、光解、化学物质等引起的外源性自由基；二是体内各种代谢反应产生的内源性自由基。内源性自由基是人体自由基的主要来源，其产生的主要途径有：①由线粒体呼吸链电子泄漏产生；②由经过氧化物酶体的多功能氧化酶（MFO）等催化底物羟化产生。此外，机体血红蛋白、肌红蛋白中还可通过非酶促反应产生自由基。自由基含有未配对电子，具有高度反应活性，可引发链式自由基反应，引起DNA、蛋白质和脂类，尤其是多不饱和脂肪酸（polyunsaturatedfattyAcids，PUFA）等大分子物质变性和交联，损伤DNA、生物膜、重要的结构蛋白和功能蛋白，从而引起衰老各种现象的发生。实验表明DNA中OH8dG随着年龄的增加而增加。OH8dG完全失去碱基配对特异性，不仅OH8dG被错读，与之相邻的胞嘧啶也被错误复制。正常细胞内存在清除自由基的防御系统，包括酶系统和非酶系统，前者如：超氧化物歧化酶（SOD），过氧化氢酶（CAT），谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX），非酶系统有维生素E、醌类物质等电子受体。OrrWC和SohalRS（1994），将铜锌超氧化物岐化酶（copper-zincsuperoxidedismutase）基因导入果蝇，使转基因株具有3个拷贝的SOD基因，其寿命比野生型延长1/3。1．程序性衰老（programmedsenescence）程序性衰老理论认为，生物的生长、发育、衰老和死亡都由基因程序控制的，衰老实际上是某些基因依次开启或关闭的结果。例如在小鼠肝中，胚胎早期表达的胞质丙氨酸转氨酶（cytosolicalanineaminotransferase，cAAT）为A型，随后停止表达，但是在衰老时则表达B型cAAT，其它类似的衰老标志物（senescencemarkers）也有报道，如肝脏中的衰老标志蛋白2（senescencemarkerprotein2）也是在老年期表达。此外程序性学派还认为衰老还与神经内分泌系统退行性变化以及免疫系统的程序性衰老有关。2．复制性衰老（replicativesenescence）概念：关于细胞增殖能力和寿命是有限的观点细胞，至少是培养的二倍体细胞，不是不死的，而是有一定的寿命；它们的增殖能力不是无限的，而是有一定的界限，这就是Hayflick界限。癌细胞或培养的细胞系是不正常细胞，其染色体数目或形态已经不同于原先的细胞细胞的增殖能力与供体年龄有关物种寿命与培养细胞寿命之间存在着一定的关系二倍体细胞的衰老是由细胞本身决定的 ◆决定细胞衰老的因素在细胞内部，不是外部的环境 ◆是细胞核而不是细胞质决定了细胞衰老Hayflick界限(HayflickLimitation）细胞来源人胚肺成纤维细胞中年人成纤维细胞老年人成纤维细胞可增殖代数40-60202-4不同年龄来源的人成纤维细胞的增殖代数一个37岁的成人早衰症患者正常儿童（左）和婴幼儿早衰症患者（右）研究表明当细胞衰老时，一些衰老相关基因（SAG）表达特别活跃，其表达水平大大高于年轻细胞，已在人1号染色体、4号染色体及X染色体上发现SAG。用线虫的研究表明，基因确可影响衰老及寿限，Caenorhabditiselegans的平均寿命仅3.5天，该虫age-1单基因突变，可提高平均寿命65%，提高最大寿命110%，age-1突变型有较强的抗氧化酶活性，对H2O2、农药、紫外线和高温的耐受性均高于野生型。对早老综合症的研究发现体内解旋酶存在突变，该酶基因位于8号染色体短臂，称为WRN基因。对AD的研究发现，至少与4个基因的突变有关，其中淀粉样蛋白前体基因（APP）的突变，导致基因产物β淀粉蛋白易于在脑组织中沉积，引起AD。1.细胞坏死（细胞被动性死亡）

细胞坏死是病理条件下细胞死亡的过程。早期表现为细胞膜破裂，线粒体肿胀。继而溶酶体破裂,细胞内容物流出,引起炎症。判断细胞是否死亡，常用细胞活体染色方法进行鉴别，由于细胞死亡时，细胞膜通透性发生改变，丧失原有功能及增殖能力，可被伊文思蓝、洋红、甲基蓝等.染色时间不能太长,凡未染或染色及浅的细胞是有活力的，而染色深的细胞是无活力的死细胞胞质内蛋白变性、凝固或碎裂，以及嗜碱性核蛋白的降解，细胞质呈现强嗜酸性，故坏死组织或细胞在苏木精/伊红染色切片中，胞质呈均一的深伊红色FDA:双醋酸荧光素荧光法:染色法:

2.细胞凋亡（细胞主动性死亡） 美国科学情报研究所（ISI）1997年SCI（ScienceCitationIndex）收录及引用论文检索，全世界自然科学研究中论文发表最集中的三个领域分别是：细胞信号转导（signaltransduction）；细胞凋亡（cellapoptosis）；基因组与后基因组学研究（genomeandpost-genomicanalysis）。CaenorhabditiselegansDrosophilamelanogasterArabidopsisthaliana细胞凋亡的形态学特征◆凋亡的起始：细胞表面的特化结构如微绒毛消失，细胞间接触的消失，但细胞膜依然完整；线粒体大体完整，但核糖体逐渐从内质网上脱离，内质网囊腔膨胀，并逐渐与质膜融合；染色质固缩，形成新月形帽状结构等形态，沿着核膜分布

◆凋亡小体的形成：核染色质断裂为大小不等的片段，与某些细胞器如线粒体一起聚集，为反折的细胞质膜所包围。细胞表面产生了许多泡状或芽状突起，逐渐形成单个的凋亡小体 ◆凋亡小体逐渐为邻近的细胞吞噬并消化细胞凋亡的发生过程，在形态学上可分为三个阶段：在光镜下表现为：细胞凝缩，染色质致密、边缘化、核凝集，染色体断裂形成核碎片。细胞质气泡化，凋亡小体形成并从胞体脱落，被周边细胞吞噬。在电镜下表现为：细胞核：早期缩小，电子密度增高，核膜皱缩，染色体密集于核膜下，分布不均匀；中期核高度凝集致密化；晚期核膜消失，染色体断裂，核被分裂成碎片。核碎片在细胞质中与细胞器等成分一起被细胞膜包裹成圆形的凋亡小体。细胞质：密度增高，细胞骨架被破坏；内质网扩大为泡状。细胞膜：微绒毛丧失，但膜完整性始终保持。

a正常T细胞杂交瘤细胞b凋亡细胞(扫描电镜)c凋亡细胞(透射电镜)(扫描电镜)1.细胞皱缩;2.染色质凝集呈块状;3.细胞质浓缩;4.凋亡小体形成；5.凋亡小体内有结构完整的细胞器。细胞凋亡的生物化学特征1.DNA凝胶电泳时呈现出特征性的梯形带;2.RNA和蛋白质的合成增加;3.钙离子浓度升高;钙离子浓度的升高是细胞凋亡的一个重要条件。4.内源性核酸内切酶活化，导致染色质ＤＮＡ断裂;5.线粒体的变化。细胞凋亡与坏死(necrosis)●二者的主要区别细胞凋亡过程中，细胞质膜反折，包裹断裂的染色质片段或细胞器，然后逐渐分离，形成众多的凋亡小体（apoptoticbodies），凋亡小体则为邻近的细胞所吞噬。整个过程中，细胞质膜的整合性保持良好，死亡细胞的内容物不会逸散到胞外环境中去，因而不引发炎症反应。相反，在细胞坏死时，细胞质膜发生渗漏，细胞内容物，包括膨大和破碎的细胞器以及染色质片段，释放到胞外，导致炎症反应○

细胞凋亡是细胞内死亡程序活化而致的细胞自杀，是由凋亡相关基因调节控制的，故亦称编程性细胞死亡。○细胞坏死指各种致病因子干扰和中断了细胞正常代谢活动而造成的细胞意外死亡。细胞凋亡与细胞坏死的主要区别特征细胞凋亡细胞坏死

细胞核染色质边缘化核浓缩核凝集断裂核破碎凋亡小体核溶解细胞质浓缩、胞质气泡显著膨胀细胞器结构保留细胞器破坏细胞膜完整破裂DNA电泳阶梯状条带弥散分布条带合成代谢新RNA蛋白质合成合成代谢终止炎症反应无有基因调节由凋亡相关基因调控与基因调控无关发生条件多为生理性只为病理性坏死细胞凋亡细胞三、细胞凋亡的检测1）、形态学检测：染色法结合普通光镜，以及电子显微镜检测2）、DNA电泳：3）、TUNEL测定法：即DNA断裂的原位末端标记法，用荧光素耦连分子标记DNA3‘-OH断裂口4）、彗星电泳法：利用电泳技术检测降解成片断的DNA。5）、流式细胞仪分析：根据凋亡细胞DNA断裂和丢失，采用碘化病啶使DNA产生激发荧光，从而检测凋亡。HeLa细胞透射电镜观察HeLa细胞扫描电镜观察细胞色素c诱导的凋亡细胞DNA电泳图1．细胞色素c诱导0h2．细胞色素c诱导1h3．细胞色素c诱导2h4．细胞色素c诱导3h5．细胞色素c诱导4h6．阴性对照7．Marker（自赵允、翟中和）彗星图像(×400)A.死后0h;B.死后3h;C.死后15h大鼠死后脾细胞核DNA降解四、细胞凋亡的分子机理一）、诱导细胞凋亡的因子◆物理性因子，包括射线（紫外线，射线等），较温和的温度刺激（如热激，冷激）等◆化学及生物因子：包括活性氧基团和分子，DNA和蛋白质合成的抑制剂，激素，细胞生长因子，肿瘤坏死因子（TNF）等线虫细胞凋亡的研究

线虫（C.elegans)是研究细胞凋亡的理想材料，提供了一个良好的模型。它虫体透明，易于观察。早期研究发现虫体在不同发育时期某些细胞定期死亡。在整个发育过程中，有131个细胞陆续进入死亡程序，决定这些细胞进入死亡程序的是一系列凋亡基因。现已从中分离出10余个凋亡基因。研究发现ced3,ced4基因促进细胞凋亡，ced9基因阻止ced3/ced4的激活，抑制细胞凋亡。Ced3哺乳类同源物是ICE(Interleukin-1-convertingenzyme)，即Caspase1

正常细胞走向死亡细胞死细胞降解细胞起动死亡程序执行死亡程序被吞噬处理Ced-2Ces-1cgl-1Ced-9ced-3\4Ced-1\2\5ced-5\6\7ced-8\10nec-1其中研究的较清楚的是ced-9(抑制细胞凋亡）、ced-3,ced-4(促进细胞凋亡）二）、细胞凋亡的分子调控机理线虫细胞凋亡的过程可划分为四个阶段：1命令阶段（execution）这一阶段决定细胞凋亡与否，通过基因ced-3和ced-4的指令可以执行细胞凋亡，使细胞有程序有步骤的凋亡，而ced-9基因则能阻止这一凋亡过程的执行。2细胞凋亡阶段（death）已经接受凋亡指令的细胞，在这一阶段将受ced-3和ced-4基因的调控而停止生长，选择凋亡途径。3细胞吞噬阶段（engulfment）这一阶段细胞处于被临近细胞吞噬的状态。控制这一过程的基因有两组：即ced-1,ced-6,ced-7,ced-8基因组和ced-2,ced-10基因组。4分解阶段（degradation）凋亡细胞被吞噬后很快分解，这一阶段起作用的基因是nec-1.目前发现的调控细胞凋亡的相关基因1.Caspase家族与凋亡◆在哺乳类找到的一组与ced-3基因同源的基因，构成一个家族，即Caspase家族。

Caspase活性位点是半胱氨酸(Cysteine)，裂解靶蛋白位点是天冬氨酸残基后的肽键，因此称为Cysteineasparticacicspecificprotease，即Caspase特点：①酶活性依赖于半胱氨酸残基的亲核性；②总是在天冬氨酸之后切断底物，所以命名为caspase（cysteineaspartate-specificprotease）；③都是由两大、两小亚基组成的异四聚体，大、小亚基由同一基因编码，前体被切割后产生两个活性亚基:异二聚体。Caspase的种类：13种Caspase。分为2个亚族（subgroup）：ICE亚族和CED-3家族。又分为两类：一类为执行者（effector），如caspase-3、6、7，它们可直接降解胞内的结构蛋白和功能蛋白，引起凋亡，但不能通过自催化（autocatalytic）或自剪接的方式激活；另一类为启动者（initiator），如caspase-8、9，受到信号后，能通过自剪接而激活，然后引起caspase级联反应，如caspase-8可依次激活caspase-3、6、7ced基因在一种无脊椎动物——线虫中发现的一组基因，共14个，其中ced-3,ced-4,ced-9研究的较为清楚。Ced-3编码530个氨基酸，其中有100个氨基酸为丝氨酸富含区。ICE基因是哺乳动物中克隆出的ced-3的同源基因，为白细胞介素1β转化酶（inter-leukin-1βconvertingenzyme）。是一种底物特异性半胱氨酸蛋白酶（cysteinasparticacicspecificprotease,caspase家族)，这个家族的共同点是特异的断开天冬氨酸后的肽键.Caspase活化Caspase自身以非活化的Procaspase存在，其激活则需在两个亚基的连接区的天冬氨酸位点进行切割（裂解活化），结果产生了由两个亚基组成的异二聚体，此即具有活性的酶。胞外信号分子诱导的细胞凋亡途径

凋亡信号通路当细胞接受凋亡信号分子后，凋亡细胞表面信号分子受体相互聚集并与细胞内的衔接蛋白(Adaptorprotein)结合，这些衔接蛋白又募集Procaspases聚集在受体部位，Procaspase相互活化并产生级联反应，使细胞凋亡

Caspases活化后，作用底物：裂解核纤层蛋白，导致细胞核形成凋亡小体；裂解DNase结合蛋白，使DNase释放，降解DNA形成DNALadder;裂解参与细胞连接或附着的骨架和其他蛋白，使凋亡细胞皱缩、脱落，便于细胞吞噬；导致膜脂PS重排，便于吞噬细胞识别并吞噬。Fas介导的细胞凋亡Fas具有三个富含半胱氨酸的胞外区和一个称为死亡结构域（Deathdomain，DD）的胞内区。Fas的配体FasL（Fasligand）与Fas结合后，Fas三聚化使胞内的DD区构象改变，然后与接头蛋白FADD（Fasassociateddeathdomain）的DD区结合，而后FADD的N端DED区（deatheffectordomain）就能与Caspase-82．Apaf-1Apaf-1被称为凋亡酶激活因子-1，与线虫的ced-4同源Apaf-1含有3个不同的结构域①CARD（caspaserecruitmentdomain）结构域，能召集caspase-9；②ced-4同源结构域，能结合ATP/dATP；③C端结构域，含有色氨酸/天冬氨酸重复序列，当细胞色素c的结合到这一区域后，能引起Apaf-1多聚化而激活。Apaf-1具有激活Caspase-3的作用，但需要细胞色素c（Apaf-2）和caspase-9（Apaf-3）参与。Apaf-1/细胞色素c复合体与ATP/dATP结合后，Apaf-1就可以通过其CARD结构域召集caspase-9，形成凋亡体（apoptosome）3．Bcl-2家族◆Bcl-2是一种原癌基因，是ced-9在哺乳类中的同源物，能抑制细胞凋亡；与线粒体及内质网膜相结合；Bcl-2蛋白的羧基末端有一穿膜的结构域；Bcl-2家族成员的基因中，常常含有三个保守的Bcl-2同源区，即BH1，BH2和BH3，这三个区域是调节凋亡所必需的结构。Bcl-2家族可分为两类：一类是抗凋亡的，如：Bcl-2；一类是促进凋亡的，如：Bax、Bad、Bid，以二聚体形体发挥作用。4．p53是一种抑癌基因，其生物学功能是在G期监视DNA的完整性。如有损伤，则抑制细胞增殖，直到DNA修复完成。如果DNA不能被修复，则诱导其调亡，研究发现丧失p53功能的小鼠胸腺细胞对糖皮质激素诱导的调亡反应和正常细胞相同，而对辐射诱导的调亡不敏感。P53肿瘤抑制基因分为野生型与突变型，野生型P53诱导细胞凋亡，突变型P53抑制细胞凋亡P53通过调节Bcl2Bax的表达来影响细胞凋亡5．myc恶性肿瘤细胞中都发现有c-myc的过度表达，它能促进细胞增殖、抑制分化。在凋亡细胞中c-myc也是高表达，作为转录调控因子，一方面它能激活那些控制细胞增殖的基因，另一方面也激活促进细胞凋亡的基因，给细胞两种选择：增殖或凋亡。当生长因子存在，Bcl-2基因表达时，促进细胞增殖，反之细胞凋亡六、线粒体与细胞凋亡细胞内源信号◆内源信号●DNA损伤●细胞质中Ca2+浓度过高●极度氧胁迫（产生大量的自由基）◆正控制信号

促进细胞死亡,如细胞色素c,凋亡蛋白酶激活因子（apoptoticprotease-activatingfactor，Apaf）◆负控制信号

抑制细胞死亡，如哺乳动物中的BCL-2和BCL-x蛋白。细胞内源信号激发细胞程序性死亡线粒体既是细胞的能量工厂，也是细胞的凋亡控制中心，可是为什么线粒体会担负起如此重要的双重功能呢？一个主要的原因是各类生长因子都可以促进葡萄糖转运和己糖激酶等向线粒体转运、加速能量生产，相反地剥夺生长因子后，细胞氧消耗降低、ATP合成不足、蛋白质合成受阻，最后细胞走向死亡。由于这一方面的资料较少，目前还很难作出一个较好的解释，只能留在以后再完善。细胞凋亡可能的调控机制通过对线虫、昆虫、鼠和人