基因工程育种微生物遗传育种课件

1第五章基因工程育种

Geneticengineering

基因工程是将不同生物的基因在体外人工剪切组合，并和载体（质粒、噬菌体、病毒）DNA连接，然后转入微生物或细胞内，进行扩增，并使转入的基因在细胞内表达，产生所需要的蛋白质。2奠定基因工程的三项关键技术DNA的特异切割

Smith和Nathans

获1978年诺贝尔医学奖DNA的分子克隆

Berg（1972）将猴病毒SV40DNA与λ噬菌体基因融合，成功构建重组DNA；

Cohen和Boyer（1973）将质粒pSC101与R的tetrkmr基因融合，并将重组DNA转化E.coli，首次实现了DNA的分子克隆。DNA的快速测序

Sanger(1975)的酶法、Gilbert(1977)的化学法DNA快速测序技术

1980年诺贝尔化学奖：Berg,Gilbert,Sanger3分离或合成基因；通过体外重组将基因插入载体；将重组DNA导入细胞；扩增克隆的基因；筛选重组体克隆；对克隆的基因进行鉴定或测序；控制外源基因的表达；得到基因产物或转基因动物、转基因植物基因工程操作的主要步骤51、寄主控制的限制与修饰作用（1）寄主控制的限制作用(Restriction)作用：破坏外源DNA，使之迅速降解机制：限制性核酸内切酶，识别特定的碱基序列并进行切割（2）寄主控制的修饰作用(Modification)作用：保护自身的DNA，使之不受限制机制：甲基化酶，催化S-腺苷甲硫氨酸的甲基转移到限制酶识别序列的特定碱基，使之甲基化。62、限制性核酸内切酶的类型特性Ⅰ型Ⅱ型Ⅲ型功能限制、修饰限制限制、修饰蛋白质结构3种不同亚基单一成分2种不同亚基所需辅助因子ATP,Mg2+,SAMMg2+ATP,Mg2+,SAM识别序列EcoB:TGA(N)8TGCT4~8bp,旋转对称EcoPI:AGACC切割位点距识别位点至少1000kb处随机切割在识别序列内（或附近）距识别位点3’-端24~26bp处73、限制性核酸内切酶的命名用产生菌的属名一个字母(大写，斜体)＋种名两个字母(小写，斜体)[＋菌株名一个字母]＋编号（罗马数字）[例]EcoRI,EcoRII：从E.coli

Rye13菌株中获得HindI，HindII，HindIII：从Haemophilusinfluenzae

d菌株获得9（2）切割：产生平末端：SmaI5’-CCC↓GGG-3’3’-GGG↑CCC-5’产生3’-OH单链粘性末端:PstI5’-CTGCA↓G-3’3’-G↑ACGTC-5’产生5’-P单链粘性末端:EcoRI5’-G↓AATTC-3’3’-CTTAA↑G-5’1011酶剪切条件需要镁离子的存在，特定的酸碱度和离子强度。辅助条件：DTT、牛血清蛋白。抑制因子：杂蛋白、酚、氯仿、乙醇、EDTA、 SDS、高盐浓度。其它：甘油浓度等可以改变对序列的识别。13

两种酶切割序列不完全相同，但却能产生相同的粘性末端，这类酶被称为同尾酶

BamHI:G↓GATCCBglⅡ：T↓GATCA（4）同尾酶(isoocaudamer)14二、DNA连接酶（DNAligase）

催化两个双链DNA片段相邻的5’-P与3’-OH之间形成磷酸二酯键。1、体外DNA连接连接具有互补粘性末端的DNA片段连接具有平末端的DNA片段先在DNA片段末端加上人工接头，使其形成粘性末端，再行连接152、连接用酶（1）T4DNA连接酶：催化反应需要Mg+2,ATP催化粘性末端连接，效率较高催化平末端连接（2）大肠杆菌连接酶催化反应需要NAD+只能催化粘性末端的连接17三、反转录酶(reversetranscriptase)催化以mRNA为模板的cDNA的合成cDNA（complementaryDNA）：互补于mRNA的DNA片段内含子外显子

DNA↓转录前体mRNA↓修饰成熟mRNA18Reversetranscription19四、末端转移酶(terminaldeoxynucleotidyltransferase)催化将脱氧核苷酸连接至DNA分子末端的3’-OH上向3’-单链末端上连接：Mg+2向平末端上连接：Co+2五、TaqDNA聚合酶来源：栖热水生菌Thermusaquaticus21一、质粒载体1、质粒的一般生物学特性

(1)环状双链质粒DNA的构型共价闭合环状DNA(cccDNA):两条链均保持完整的环状构型，通常呈现超螺旋的SC构型开环DNA(ocDNA)：一条链保持完整的环状结构，另一条链出现有一至数个缺口，即OC构型线形DNA(lDNA)：质粒DNA经过适当的限制性核酸内切酶的切割后，发生双链断裂，称L构型2223(2)表型效应性别：F，SCP1抗生素类物质合成：SCP1，Col抗药性：R分解性质粒：CAM(樟脑)，TOL(甲苯)酶的合成：Rye13隐蔽性质粒(crypticplasmid)：2m25接合类型接合型质粒(conjugative)

非接合型质粒(nonconjugative)质粒的不亲和性(incompatibility)

在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的不同质粒，不能够在同一个寄主细胞中稳定共存的现象。同一不亲和群：不能共存于同一细胞中不同的不亲和群：能共存于同一细胞中26(4)质粒的命名①质粒名以三个英文字母加阿拉伯数字表示

pUC19plasmid发现者或实验室名编号(小写）（大写）29（2）克隆质粒载体3031质粒分离的步骤：粗提精提32氯化铯梯度离心法：有效地去除蛋白质、RNA、染色体DNA、受损质粒。33二、l噬菌体克隆载体1、优点遗传学背景十分清楚载体容量大，~23kb具有较高的感染效率2、类型插入型载体:较小片段DNA的插入（10kb以内）；取代型载体：较大片段DNA的插入；重组DNA分子大小为l噬菌体DNA的75～105％；野生型λDNA为48kb，λ噬菌体的包装上限是51kb。编码必要基因的DNA区段占28kb，因此λ载体克隆外源DNA的理论极限值应是23kb。34插入型载体35取代型载体363、l噬菌体克隆载体的导入转染：用λ重组体DNA分子直接感染大肠杆菌，使之侵入寄主细胞内。效率低：未经任何基因操作处理的新鲜制备的λDNA，其典型的转染效率也仅为105～106噬菌斑/微克λDNA，体外连接的结果，转染效率便下降到了104～103左右。λDNA的体外包装：在离体条件下，将重组体DNA包入噬菌体等病毒颗粒，形成有感染功能的病毒载体。37三、柯斯质粒载体(cosmidvector)

由l噬菌体的粘性末端和质粒构建而成。含有来自质粒的一个复制起点、抗药性标记、一个或多个限制酶单一位点，来自l噬菌体粘性末端的DNA片段（cos位点）。38优点具有l噬菌体的特性，在体外包装后具有噬菌体的高效感染力；具有质粒DNA的复制方式；具有克隆大片段外源DNA的能力(45kb)；具有与同源序列的质粒进行重组的能力39柯斯克隆（cosmidcloning）应用柯斯质粒载体，在大肠杆菌细胞中克隆大片段的真核基因组DNA技术40第三节基因工程的基本操作一、目的基因的获得1、从供体细胞的DNA中分离

（基因文库的构建）基因文库：某生物染色体基因组各DNA片段的克隆总体。如“鸟枪法”(ShotgunMethod)41步骤提取染色体DNA限制酶解电泳分离与载体连接导入宿主筛选阳性克隆422、从mRNA合成cDNA(cDNA文库构建）所谓cDNA文库是指某生物体全部mRNA的cDNA克隆总体。43步骤提取mRNA反转录合成cDNA第一链合成cDNA第二链与载体连接导入宿主细胞筛选阳性克隆443、PCR体外扩增目的基因PCR（PolymeraseChainReaction）聚合酶链式反应：利用特殊的DNA聚合酶，在体外扩增位于两段已知序列之间的特定DNA区段的方法。(1)PCR组成：含目标DNA序列的模板DNA寡核苷酸引物DNA聚合酶：Taq或PfudNTPs缓冲体系和金属离子45(2)PCR过程变性(denaturation)：90℃以上退火(annealing)：40~60℃延伸(extension)：72℃

如此进行20~40个循环，DNA量扩增106~107倍。4647484、基因的化学合成主要应用于已知核苷酸序列的、分子量较小的基因的制备。通常先合成一定长度的具有特定序列的寡核苷酸片段，然后再组装成完整的基因。方法主要有：磷酸二酯法、磷酸三酯法、亚磷酸三酯法、固相合成法和自动化法等。49二、目的DNA与载体的连接1、粘性末端连接2、平齐末端连接3、同聚末端连接4、人工接头连接50三、重组DNA导入宿主细胞1、转化或转染2、体外包装与感染3、电穿孔法electroporation常用宿主系统51过程：连接反应的混合液+感受态细胞;

冰浴10至30分钟;

热休克0.5至2分钟;

加入培养基37C振荡培养1小时;

涂布平板，培养。52四、重组体的筛选与鉴定1、遗传学方法：检测选择性标记2、核酸杂交方法：检测目的基因3、免疫化学方法：检测目的基因产物4、直接检出法：检测目的基因产物53五、DNA序列测定Sanger双脱氧链终止法1、试剂引物模板：待测序DNADNA聚合酶dNTPsddNTP542、测序反应3、制备聚丙烯酰胺凝胶3、凝胶加样4、电泳5、结果记录与分析555657六、外源基因的表达影响表达的因素细胞中基因拷贝数：拷贝数多，产物多转录水平：启动子与RNA多聚酶的统一翻译水平：mRNA的核糖体结合部位与宿主核糖体的统一；密码子与tRNA的统一；mRNA的稳定性外源基因的插入方向转录后的修饰及翻译后的修饰58第四节基因工程的实际应用微生物发酵病毒疫苗哺乳动物蛋白（人源蛋白药物）转基因动植物环境生物技术基因诊断与基因治疗蛋白质工程（定点突变、定向进化）代谢工程59复习题1、何谓基因工程？基因工程操作主要步骤。2、何谓限制性核酸内切酶？Ⅱ型限制性核酸内切酶有何特点？3、克隆载体的基本要求。4、质粒的表型效应、分类、命名。5、目的基因的获得途径6、名词：基因文库、cDNA文库、PCR、质粒不亲和性60插入钝化/失活（insertionalinactivation)由于外源DNA插入到某一基因内而使其功能丧失的现象。受体细胞是Amp、Tet的敏感型在Amp+Tet培养基上生长的是野生型质粒只在Amp培养基上生长的带有重组质粒选择性标记筛选61b-半乳糖苷酶显色反应（蓝白斑筛选）

β-半乳糖苷酶能将无色底物X-gal切割成半乳糖和深蓝色的5-bromo-4-chloroindigo，菌落呈蓝色宿主基因合成的是缺失N-末端11~41氨基酸的缺陷型酶，无活性pUC系列等质粒具有lacZ’基因，所编码酶的N-末端片段与宿主基因产物组成有活性的酶（α-互