植物基因工程技术及应用

植物基因工程技术及应用第1页，共70页，2023年，2月20日，星期五基因工程（geneticengineering）基因工程（geneengineering），又称为重组DNA技术，是按着人们的科研或生产需要，在分子水平上，用人工方法提取或合成不同生物的遗传物质（DNA片段），在体外切割，拼接形成重组DNA,然后将重组DNA与载体的遗传物质重新组合，再将其引入到没有该DNA的受体细胞中，进行复制和表达，生产出符合人类需要的产品或创造出生物的新性状，并使之稳定地遗传给下一代。基因工程的基本特点:分子水平操作，细胞水平表达。基因工程的概念第2页，共70页，2023年，2月20日，星期五第3页，共70页，2023年，2月20日，星期五

在这个过程中：

1.“基因剪刀”

——限制性核酸内切酶

2.“缝纫针”

——DNA连接酶

3.“交通工具”——载体

4.“乘客”——目的基因第4页，共70页，2023年，2月20日，星期五植物基因工程技术及应用第5页，共70页，2023年，2月20日，星期五一、植物基因工程的发展历程1983年美国和比利时科学家首次将外源基因导入烟草和胡萝卜1994年世界上第一种耐储藏的番茄在美国批准上市1995年转基因的抗虫、抗除草剂的玉米和棉花在美国投入生产2000年美国转基因大豆的种植面积首次超过普通大豆到2005年为止，世界上共批准了12种作物、6大类性状的48个转基因品种进行商业化生产，其中包括水稻、玉米、马铃薯、小麦、黑麦、红薯、大豆、豌豆、棉花、向日葵、油菜、亚麻、甜菜、甘草、卷心菜、番茄、生菜、胡萝卜、黄瓜、芦笋、苜蓿、草莓、木瓜、猕猴桃第6页，共70页，2023年，2月20日，星期五二、植物基因工程中常用遗传转化的基因元件1、目的基因真菌和细菌：

GUS、HPT、NPTⅡ、GNA均来自大肠杆菌；杀虫蛋白基因cry1Ab、cry1Ac、cry2A则来自苏云金芽孢杆菌；抗除草剂基因Bar来自吸水链霉菌。病毒：几丁质酶基因。植物：蛋白酶抑制基因、凝集素基因等、Xa21、C4相关基因、水稻中生产胡萝卜素—前维生素A的基因。动物：来自水母的绿色荧光蛋白基因（GFP）、蝎的昆虫毒素基因、蜘蛛毒素基因。人工合成基因：

Wx的反义基因。第7页，共70页，2023年，2月20日，星期五2、选择标记基因新霉素磷酸转移酶基因NptII：表达产物可以拮抗卡那霉素、G418潮霉素磷酸转移酶Hpt基因：表达产物可以抗潮霉素（HygromycinB）

Bar基因：表达产物可以抗PPT)第8页，共70页，2023年，2月20日，星期五三、转基因的主要方法及原理植物基因转化系统受体细胞转化方法转化原理载体转化系统名称共感染法（整体接种法）Ti质粒Ri质粒

农杆菌原生质体共培养法（细胞接种法）RNA载体转化系统叶盘法DNA

病毒基因枪法

各种受体微针注射法电击法电泳法

物理原理

原生质体超声波法

激光法直接转化系统脂质体法PEG法

化学原理浸泡法卵细胞花粉管通道法花粉粒生殖细胞

细胞细胞转化法茎尖细胞种质细胞种质转化系统第9页，共70页，2023年，2月20日，星期五植物成功应用的转化方法：直接转化法：是通过物理或化学方法将外源基因导入植物细胞或原生质体，由此获得转基因植株的方法。基因枪法、花粉管通道法、电击法、PEG法、超声波法、激光束法、脂质体法和减压渗透法等。间接转化法：是通过生物体（如农杆菌、细菌球、病毒等）介导，将外源基因导入植物细胞。根癌农杆菌介导转化法。第10页，共70页，2023年，2月20日，星期五基因枪法（微弹轰击法）基本原理：将DNA包被在微小的金粉或钨粉粒表面上，以火药爆炸、高压气体或高压放电等作为驱动力，将微粒射入受体细胞或组织，伴随伴随而入的DNA分子便随机整合到寄主细胞的基因组中，从而实现转化的目的。第11页，共70页，2023年，2月20日，星期五优点：（1）直接将DNA送入完整的、可再生的植物细胞，避开了原生质体分离和再生的困难。（2）靶细胞类型广泛，不受组织类型限制，几乎所有具有潜在分生能力的组织或细胞都可以用基因枪进行轰击转化。（3）利用基因枪法可以同时将多个基因导入植物。缺点：易引起多拷贝插入和非孟德尔遗传，且外源DNA整合机理不清楚，随机性较大，目标基因与筛选标记基因有时发生重排，有益基因有可能丢失。此外，不同的受体类型，其基因枪转化参数需进行优化，且价格昂贵。第12页，共70页，2023年，2月20日，星期五高压气体基因枪－PDS-1000/He气压表气体加速管可裂圆片运动中的微弹靶细胞第13页，共70页，2023年，2月20日，星期五PEG诱导法

基本原理：PEG法借助化合物聚乙二醇、磷酸钙，在高pH值条件下诱导原生质体摄取外源DNA分子。第14页，共70页，2023年，2月20日，星期五优点：对细胞伤害小，转化顺利实验成本低受体植物不受种类限制能够转化较大的外源DNA片段（甚至某物种的总DNA）转化子易于筛选结果较为稳定、重复性较好易于推广等优点缺点：受体制备和保持比较困难分化效率低，费工费时，基因依赖性强，原生质体再生困难再生植株结实率低，易产生突变体第15页，共70页，2023年，2月20日，星期五电击（激）法

基本原理：利用高压电脉冲作用，在原生质体质膜上电击穿孔，形成瞬间可修复通道（一般只有8nm），当外源DNA附着于细胞质膜电击点时，DNA分子就有可能通过小孔进入细胞内，进而整合到受体细胞基因组上。第16页，共70页，2023年，2月20日，星期五优点：除具有PEG原生质体转化法的优点外，还具有操作简便、DNA转化效率高的优点。缺点：造成原生质体的损伤，使植板率降低仪器比较昂贵。第17页，共70页，2023年，2月20日，星期五“电注射”法，它可以直接在带壁的植物组织和细胞上打孔，将外源基因直接导入细胞。使用该技术可以不制备原生质体，提高了植物细胞的存活率，而且简便易行，现已有水稻上成功应用的报道。第18页，共70页，2023年，2月20日，星期五花粉管通道法

基本原理：是利用植物受粉后一定时间内，外源DNA可通过花粉管渗入，经珠孔通道进入胚囊，转化尚不具备正常细胞壁的卵、合子或早期胚胎细胞，进而借助天然的种胚系统（Germline）形成转基因种胚。第19页，共70页，2023年，2月20日，星期五优点：在理论上可以应用于任何开花植物，不需离体再生过程具有广泛的应用性，特别是对于一些其它转化条件不具备的实验室尤其值得尝试操作简便缺点：无法提供令人信服的分子证据以及遗传分析数据重复性也比较差第20页，共70页，2023年，2月20日，星期五脂质体转化法基本原理：是用脂类化学物质包被DNA成球体，通过植物原生质体的吞噬或融合作用把脂体内的DNA转入受体细胞。第21页，共70页，2023年，2月20日，星期五激光微束介导法基本原理：激光经光学显微镜聚焦后，形成微米级的微光束，细胞经过这种微光束照射后，在细胞膜上可形成能自我愈合的小孔，使加入细胞培养基里的外源DNA流入细胞，实现基因的转移。第22页，共70页，2023年，2月20日，星期五低能离子束介导法

基本原理：利用低能离子束的溅射，引起植物细胞壁刻蚀变薄并产生局部穿孔，使外源DNA导入受体细胞。第23页，共70页，2023年，2月20日，星期五根癌农杆菌介导转化法

根癌农杆菌：能够诱发冠瘿瘤的称为根癌农杆菌。发根农杆菌：诱导毛发状根的称为发根农杆菌。第24页，共70页，2023年，2月20日，星期五农杆菌转化原理第25页，共70页，2023年，2月20日，星期五农杆菌与植物细胞的化学分子内共生关系转录转译生长素和细胞分裂素刺激细胞分裂冠瘿碱冠瘿碱分泌分解Opines作为碳源和氮源ChrA.t染色体其它Vir基因的诱导物激活T-DNA加工Vir基因超量诱导Ti质粒T-DNAVIRTRAOCC接合转移附着植物细胞农杆菌损伤细胞产生的诱导物（酚、糖类）第26页，共70页，2023年，2月20日，星期五常用植物转基因转化方法特点比较评价条件植物基因转化方法农杆菌法PEG法电击法微针注射法基因枪法花粉管通道法受体材料完整细胞原生质体原生质体原生质体完整细胞卵细胞宿主范围有无无无无有性繁殖植物组织培养条件简单复杂复杂复杂简单无转基因植株转化率10-2~10-110-5~10-410-5~10-410-3~10-210-3~10-210-1~101出现嵌合体比例有无无无多无操作复杂性简单简单复杂复杂复杂简单设备要求便宜便宜昂贵昂贵昂贵便宜转化工作效率高低低低高低单子叶植物的应用少可行可行可行广泛广泛第27页，共70页，2023年，2月20日，星期五1、利用转基因植物生产功能蛋白和工业原料利用植物生物反应器生产医用蛋白利用植物生物反应器生产食品或饲料添加剂利用植物生物反应器生产工业原料四、植物基因工程的应用第28页，共70页，2023年，2月20日，星期五转基因植物作为生物反应器的优势如下：植物易于生长，农田管理成本相对低廉，操作技术要求也不高绝大多数植物的表达产物对人和牲畜无毒副作用，安全可靠植物具有完整的真核表达修饰系统，利用转基因植物生产的重组蛋白药物和疫苗在分子结构和生物活性上，与人体来源的蛋白质相似第29页，共70页，2023年，2月20日，星期五利用植物生物反应器生产医用蛋白

借助于根瘤农杆菌介导的转化系统，将小鼠抗体的轻链和重链编码基因分别置于两种烟草植物体内表达，然后两种重组植物品系进行杂交，产生的子代植物能同时合成小鼠的轻链和重链两种多肽。转基因烟草表达小鼠抗体第30页，共70页，2023年，2月20日，星期五转基因烟草表达小鼠抗体第31页，共70页，2023年，2月20日，星期五疫苗苹果基因工程第32页，共70页，2023年，2月20日，星期五利用植物生物反应器生产医用蛋白

人葡萄糖脑苷脂酶（hGC）是治疗高歇斯症遗传病的特效药，可能也称得上当今世界最昂贵的药物。每生产一个剂量的hGC要消耗2000-8000只人类胎盘，因此这种药物一直供不应求。美国VPI研究机构的专家将克隆的hGC基因经改造导入到烟草中，并获得高效表达。在每克这种转基因烟草的新鲜叶片中，hGC的含量竟高达1mg，也就是说，从一株转基因烟草中就能产生出传统工艺需要消耗数千只胎盘才能获得的药物。转基因烟草表达人葡萄糖脑苷脂酶第33页，共70页，2023年，2月20日，星期五利用植物生物反应器生产食品或饲料添加剂

荷兰科学家把果糖基转移酶基因导入烟草和马铃薯中，在获得的转基因植株中，果聚糖含量占8%（干重）以上，具有良好的开发前景。转基因烟草和马铃薯生产果聚糖第34页，共70页，2023年，2月20日，星期五利用植物生物反应器生产食品或饲料添加剂

荷兰科学家从黑曲霉菌中克隆到植酸酶基因，并将之导入到烟草的种子中表达。在饲料中添加这种转基因烟草的种子便可达到良好的效果。转基因烟草生产植酸酶第35页，共70页，2023年，2月20日，星期五利用植物生物反应器生产工业原料

油菜通常产生十八碳的不饱和脂肪酸，但只要在其体内表达另一个特殊的基因即可使转基因油菜改为合成月桂酸，并可使其含量提高到44%。此外，鉴于油菜植物易生长且产量高的特点，人们还致力于用它来生产其它工业用油，如可作润滑油和尼龙生产原料的芥酸以及用于麦淇淋制作的6-十八碳烯酸等。转基因油菜生产月桂酸第36页，共70页，2023年，2月20日，星期五利用植物生物反应器生产工业原料

聚-b-羟基烷酸（PHAs）和聚羟基丁酸（PHB）两种结构相似的多聚体具有热塑性好、可被微生物完全分解的特性，因此被认为是最好的无污染性塑料原料。转基因拟南芥生产聚羟基丁酸

将真核细菌养产碱菌的PHB生物合成基因导入拟南芥中，转基因植物在整个生命周期中，PHB的含量逐步增加，并达到每克湿重植物产10毫克PHB的最大产量，大约相当于细胞干重的14%。第37页，共70页，2023年，2月20日，星期五2、植物转基因技术在植物品种改良中的应用控制果实成熟的转基因植物抗病虫害的转基因植物抗除草剂的转基因植物改变花卉形状和颜色的转基因植物抗环境压力的转基因植物改善品质的转基因植物第38页，共70页，2023年，2月20日，星期五控制果实成熟的转基因植物

植物细胞中的乙烯由S-腺苷甲硫氨酸经氨基环丙烷羧酸合成酶ACC和乙烯合成酶EFE催化裂解而成。科学家采用反义RNA技术封闭番茄细胞中上述两个酶编码基因的表达，由此构建出的重组番茄的乙烯合成量分别仅为野生植物的3%和0.5%，明显增长了番茄的保存期。第39页，共70页，2023年，2月20日，星期五控制果实成熟的转基因植物植物体内乙烯的生物合成机制第40页，共70页，2023年，2月20日，星期五抗病虫害的转基因植物

将抗虫基因导入农作物是植物基因工程的得意之笔，能避免化学杀虫剂所造成的许多负面影响。目前，抗虫作物已占全球转基因作物的22％。用于构建抗虫害转基因植物常见的外源基因有苏云金芽孢杆菌的毒晶蛋白基因、蛋白酶抑制剂基因、淀粉酶抑制剂基因、凝集素基因、脂肪氧化酶基因、几丁质酶基因、蝎毒素、蜘蛛毒素基因等40多个，其中毒晶蛋白基因、蛋白酶抑制剂基因和凝集素基因应用最为广泛。第41页，共70页，2023年，2月20日，星期五细菌毒素蛋白编码基因的植物转基因程序第42页，共70页，2023年，2月20日，星期五水稻抗虫基因工程育种第43页，共70页，2023年，2月20日，星期五转基因水稻植株的田间抗虫性FEDCBA第44页，共70页，2023年，2月20日，星期五转基因植株室内抗虫性测定AB第45页，共70页，2023年，2月20日，星期五水稻抗白叶枯病基因工程育种第46页，共70页，2023年，2月20日，星期五水稻抗白叶枯病基因工程育种第47页，共70页，2023年，2月20日，星期五抗除草剂的转基因植物

在大田里，尽管每年花费上百亿美元使用100多种化学除草剂，但杂草的生长仍使农作物减产10%。目前使用的除草剂特异性不强，或多或少会影响农作物的生长。利用转基因技术构建抗除草剂的重组植物可望解决这一问题，其战略包括：抑制农作物对除草剂的吸收高效表达农作物体内对除草剂敏感的靶蛋白降低敏感性靶蛋白对除草剂分子的亲和性向农作物体内导入除草剂的代谢灭活能力第48页，共70页，2023年，2月20日，星期五水稻抗除草剂基因工程育种第49页，共70页，2023年，2月20日，星期五矮牵牛抗除草剂基因工程EPSPCK第50页，共70页，2023年，2月20日，星期五抗环境压力的转基因植物

植物对盐、碱、旱、寒、热等环境不利因素的自我调节能力很大程度上取决于细胞内的渗透压，提高渗透压往往能改善植物对上述环境不利因素的耐性。两种战略：一：高效表达能提高植物胞内渗透压的同源或异源蛋白；二：借助于基因工程技术改变植物细胞内丰度较高的蛋白质的氨基酸组成。第51页，共70页，2023年，2月20日，星期五水稻抗盐、抗旱基因工程育种第52页，共70页，2023年，2月20日，星期五改善品质的转基因植物

植物油大都是含有双键的不饱和脂肪酸，故在室温下呈液态。人造黄油的制作是通过催化加氢使植物油熔点上升，这种工艺不但加工成本很高，而且还会导致顺式双键转变为对健康不利的反式双键。利用反义RNA技术，特异性灭活植物体内硬脂酰-ACP脱饱和酶的编码基因，即可提高转基因油料作物中饱和脂肪酸的含量。将不饱和脂肪酸转化为饱和脂肪酸第53页，共70页，2023年，2月20日，星期五改善品质的转基因植物

一般粮食种子的储存蛋白中几种必需氨基酸的含量较低，例如禾谷类蛋白的赖氨酸含量低，豆类植物的蛋氨酸、胱氨酸、半胱氨酸含量低，直接影响到人类主食的营养价值。将蚕豆中一种富含赖氨酸和甲硫氨酸的蛋白编码基因植入玉米中，可显著提高其营养价值。马铃薯和水稻的类似改良也在进行之中。提高粮食中必需氨基酸的含量第54页，共70页，2023年，2月20日，星期五改善品质的转基因植物

为了增加稻米中的铁质含量，从大豆芽中分离出铁蛋白编码基因，将之转入亚洲稻谷一个普通品系中。结果发现，转基因稻谷能储存相当于普通稻谷3倍的铁质。普通稻米中含有一种植物酸，阻碍人的消化系统对铁的吸收。瑞士科学家将来自水仙等植物的相关基因植入水稻中，不仅铁的含量有所提高，而且维生素A的含量也丰富了。提高粮食中铁元素和维生素的含量第55页，共70页，2023年，2月20日，星期五改变花卉形状和颜色的转基因植物大多数花卉的色素为黄酮类物质，而颜色主要取决于色素分子侧链取代基团的性质和结构，如花青素衍生物呈红色，翠雀素衍生物呈蓝色等。在黄酮类色素的生物合成途径中，苯基苯乙烯酮合成酶（CHS）是一个关键酶。利用反义RNA技术可有效抑制矮牵牛花属植物细胞内的CHS基因表达，使转基因植物花冠的颜色由野生型的紫红色变成了白色，并且对CHS基因表达抑制程度的差异还可产生一系列中间类型的花色。改变花卉的颜色第56页，共70页，2023年，2月20日，星期五基因工程改变矮牵牛的花色各种花色独特、花式新颖的转基因矮牵牛花色深浅不同的矮牵牛第57页，共70页，2023年，2月20日，星期五改变花卉形状和颜色的转基因植物

植物激素在控制花朵的形状和大小方面起着重要的作用。例如，细胞分裂素与植物生长素的比值可以决定植株包括花的形状。分子生物学和遗传学的研究都表明，同源异形基因表达的加强或减弱都会改变花的大小和形状，而这些基因的表达时间直接影响到植物的花期。同源异形基因控制花形的过程十分保守，在几乎所有的观赏花卉中都是一样的，这就为人们用基因工程的方法改变花形和花期提供了有利条件。改变花卉的形状第58页，共70页，2023年，2月20日，星期五第59页，共70页，2023年，2月20日，星期五五．植物基因工程面临的主要问题和对策1、转化率低

基因枪法和农杆菌法虽然经过了不断的改进，但转化率任然普遍较低，而且基因依赖性很强，部分材料甚至很难实现成功的转化。

第60页，共70页，2023年，2月20日，星期五第61页，共70页，2023年，2月20日，星期五2、转基因沉默

转基因沉默：转基因在受体植物中往往不能稳定表达，有时甚至完全不表达，它是目前制约基因工程育种的一大障碍。转录水平的沉默：是mRNA的合成大幅度减少或根本没有RNA合成；转录后沉默：是mRNA或mRNA前体可以正常地合成，但很快被降解或被不正常地加工。第62页，共70页，2023年，2月20日，星期五3、外源基因的低效表达转基因表达效率低乃至不表达的问题，一般认为这与植物表达载体的设计不当有关，如载体中含有多重复区域导致多基因重组而失活；启动子选择不当；启动子来源和受体材料之间不相匹配等，