植物组织石蜡切片的制作

植物组织石蜡切片的制作第1页，共47页，2023年，2月20日，星期五一、实验目的1．熟练掌握石蜡切片的方法。2．掌握永久制片的制作过程，为研究植物的内部结构奠定基础。3．学会植物内部结构的比较研究方法。第2页，共47页，2023年，2月20日，星期五二、实验器具与试剂1．器具石蜡切片机、烘箱、显微镜、染色缸、小培养皿、镊子、毛笔、吸水纸、纱布、载玻片、盖玻片等。2．试剂10%番红水溶液、0.5%固绿（用95%的酒精配制）、酒精（100%、95%、80%、70%、50%）、二甲苯、蒸馏水、甘油、中性树胶等。

第3页，共47页，2023年，2月20日，星期五三、实验材料幼嫩植物各部分，根据季节选择材料。

第4页，共47页，2023年，2月20日，星期五四、实验内容与方法石蜡切片法是显微技术上最重要、最常用的一种方法。它是把材料封埋在石蜡里面，用旋转切片机切片，可以切出很薄的切片。凡是精细的工结构，大都用石蜡切片。全都过程如下：第5页，共47页，2023年，2月20日，星期五1．固定2．洗涤3．脱水与硬化4．脱酒精2．封埋6．切片7．粘片8．脱蜡9．染色10．脱水11.透明12．胶封第6页，共47页，2023年，2月20日，星期五实验二1、石蜡切片技术—固定、染色第7页，共47页，2023年，2月20日，星期五一、实验目的：掌握制作石蜡切片中固定、染色、返蓝的基本操作技术第8页，共47页，2023年，2月20日，星期五二、实验原理：石蜡切片法：是用石蜡浸透到组织中，并包埋组织，然后用旋转切片机将蜡块切成切片。只是切片中最常用的一种方法。第9页，共47页，2023年，2月20日，星期五三、实验用品：1．实验材料：瓜叶菊叶柄，长寿花幼茎。2．实验试剂：卡诺固定液、FAA固定液、35%酒精、50%酒精、70%酒精、83%酒精、95%酒精、100%酒精、二甲苯、中性树胶、2%氨水、爱氏苏木精染液。3．实验器具：解剖器，双面刀片，青霉素小瓶。第10页，共47页，2023年，2月20日，星期五四、实验步骤：1．取材：依据生物组织取材的各项注意事项。2．固定：卡诺固定液、FAA固定液固定24小时。3．复水：卡诺固定液（1h）→50%酒精（1h）→爱氏苏木精染液

FAA固定液→爱氏苏木精染液第11页，共47页，2023年，2月20日，星期五4．染色（整染）：爱氏苏木精染液染色，染色时间视材料不同而有所不同，总之使材料最后染指红棕色为止，且内外均染色均匀。对于染不好的材料，可加长染色时间，还可通过负压，超声波加注浸剂等方法提高染色效率。时间为1-2天。第12页，共47页，2023年，2月20日，星期五5．返蓝：染好的材料，用自来水冲洗，加2%氨水使材料变为蓝色，时间也因材料的不同而有所不同，好返蓝的材料用水一洗就蓝。第13页，共47页，2023年，2月20日，星期五附：分染：番红与固绿色法

番红用l％的水溶液，固绿用0.5％的酒精液(用95％的酒精配制)，染色步骤如下：第14页，共47页，2023年，2月20日，星期五第15页，共47页，2023年，2月20日，星期五讨论和注意点：(1)用番红和固绿这个组合染成的切片，木化、栓化和角质的细胞壁，被番红染成鲜红色，纤维素的细胞璧，被固绿成绿色。就维管束来讲，木质部染红，韧皮部染绿，区别极清楚。(2)在50％酒精中脱色，需经实践，如脱色不够，绿色难得染好，脱色太过分，做出来的切片，红色太淡，甚至于全是绿色，失掉了二色染法的用意。第16页，共47页，2023年，2月20日，星期五实验二2、石蜡切片技术—脱水、透明、浸蜡、包埋

第17页，共47页，2023年，2月20日，星期五一、实验目的：掌握制作石蜡切片中脱水、透明、浸蜡、包埋的基本操作技术。第18页，共47页，2023年，2月20日，星期五二、实验用品：1．实验试剂：35%酒精、50%酒精、70%酒精、83%酒精、95%酒精、100%酒精、二甲苯、石蜡。2．实验器具：电光纸、电热恒温箱、烤片机、解剖器、盆。第19页，共47页，2023年，2月20日，星期五三、实验步骤：1．脱水：35%酒精→50%酒精→70%酒精→83%酒精→95%酒精→100%酒精→100%酒精。每级1-2h。70%酒精处可长期保存。2．透明：1/2二甲苯+1/2100%酒精(1-2h)→纯二甲苯(1h)→纯二甲苯(1h)3．浸蜡：石蜡先置于60℃的温箱中，倒入含二甲苯及材料的小瓶中置于38℃温箱中，放置2-4小时。第20页，共47页，2023年，2月20日，星期五4．包埋：先提升恒温箱的温度至60℃，换纯蜡3次，每次1-2h，用硬的电光纸、牛皮纸叠纸盒，置于45-60℃的烫板上，倒入材料，摆放好材料，把标签（正面向外置于底部），补足石蜡，倒好后轻轻的置于冷水盆中，注意底面要接触盆中凉水，待石蜡全部凝固后可取出晾干，也可在凉水盆中放置过夜。第21页，共47页，2023年，2月20日，星期五第22页，共47页，2023年，2月20日，星期五实验二3、石蜡切片技术—切片、粘片、脱蜡、透明、封藏第23页，共47页，2023年，2月20日，星期五一、实验目的：掌握制作石蜡切片中切片、粘片、脱蜡、透明、封藏的基本操作技术。二、实验用品：1．实验试剂：95%酒精、100%酒精、二甲苯、蒸馏水、加拿大树胶。2．实验器具：切片机、烤片机、解剖器、载玻片、盖玻片、酒精灯、木筷、染色缸。第24页，共47页，2023年，2月20日，星期五三、实验步骤：1．修块、粘块、整修的步骤：①选取所要切片的材料，从包埋的石蜡块上用单面刀片切割下来，注意不可损伤包埋的组织。②确定切面的方位，用刀片将石蜡块的四面作初步的整修。保证材料四周都有石蜡包围。但不可太多。切面的上、下边平行。第25页，共47页，2023年，2月20日，星期五③点燃酒精灯，并准备一把旧的解剖刀。④左手大拇指与食指间持整修好的石蜡块，材料向上用其余三指夹住台木。此时将解剖刀在酒精灯上加温后，即放在台木与石蜡块之间，因解剖刀已加温，遇上两面的石蜡都会融化，可立即将解剖刀抽出，石蜡块迅速压在台木上。第26页，共47页，2023年，2月20日，星期五⑤再将解剖刀蘸取少许石蜡碎屑，放在刚才固定的石蜡四周。此时，解剖刀再加温，并迅速将石蜡块四周的碎屑烫平。使石蜡块牢固地粘在台木上。⑥修石蜡块上下面平行，是切成的蜡带呈一直线，不弯曲。每个切片中组织的距离接近。第27页，共47页，2023年，2月20日，星期五2．切片的方法：①准备下列用具：毛笔、黑色亮光纸②将已固着和整修好的石蜡块和台木装在切片机的夹物部分.第28页，共47页，2023年，2月20日，星期五③安装切片刀，将刀片夹在刀夹上，并调整好刀的角度。刀的斜度，非常重要，最好先切除的蜡块试刀，以确定刀的斜度，一经调度适合后，就不要随便变动，以免每次试刀的麻烦。④移动刀片固定器，使夹刀部与夹物部之间的距离调整好，以石蜡块的表面刚贴近刀口为度，在旋紧切片固定器的螺旋。第29页，共47页，2023年，2月20日，星期五⑤调整石蜡块与刀口之间的角度与位置。修整蜡块，将刀片移近蜡块，使小蜡块的下边与刀锋平行，如不平行，可调夹物部上的螺旋。然后把它固定，再转下蜡块．呈矩形才行。只有平整的蜡块，才能切出平整的蜡带。

最后根据需要，调整控制切片厚度的机制。调度后，把它固定下来。上述四步骤完成后，就可进行切片，第30页，共47页，2023年，2月20日，星期五⑦开始切片。右手握旋转轮的手柄，摇动一转就可切下一片，切下的蜡片粘在刀口上，待第二片切下时粘在一起，所以连续摇动就可将切下的蜡片连成一条蜡带。这时左手就可持毛笔将蜡带提起，边摇边移动蜡带。转速为每分钟40-50为宜。第31页，共47页，2023年，2月20日，星期五⑧切成的蜡带到20-30厘米时，即以右手用另一只毛笔轻轻将蜡带挑起，平放在黑电光纸上。靠刀的一面较光滑，应向下，较皱的一面向上。⑨切下的蜡片是否良好，此时应先行检查。⑩切片工作结束后，仍将刀片用具擦拭干净。第32页，共47页，2023年，2月20日，星期五3．贴片：贴附牢固，在染色时不易脱落；是皱褶的蜡片伸展平整。用具：载玻片、粘片剂、解剖刀、蒸馏水、展片机及铐片机。 第33页，共47页，2023年，2月20日，星期五材料切成薄片后，须将切片粘在玻璃片上，加热展开，这叫粘片。所用载玻片必须清洁才能使用。粘片时，需把胶液(或称粘贴剂)置簿玻片上，再取切片，浮置胶液上，然后置烘片台上，使切片展开烫平，材料不现皱纹为度。最后将切片依次排好，用滤纸吸去多余水分，同时以记号笔在玻片上编号，放入温箱中烘干，温度30～40℃约1小时即干。常用的胶液有下列三种：第34页，共47页，2023年，2月20日，星期五(1)明胶液：这是粘片最常用的胶液，简便优良，配法是100毫升纯水中，加明胶4毫克，加热熔化，过滤即得。(2)梅氏蛋白质：鸡蛋清50ml甘油50m1水杨酸纳1g用蛋白与甘油搅拌，同时加入水杨酸纳，调匀过滤，应用时以滤液15滴，放入纯水50毫升中即得。(3)Land氏液：阿拉伯胶1克重铬酸钾0.2克纯水100毫升

第35页，共47页，2023年，2月20日，星期五方法①将展片机温度调整到35℃，保持恒定。②在载玻片上涂蛋白甘油粘片剂。其法是用细玻璃棒蘸取一小滴粘片剂，加在载玻片的中央，然后用洗净的手指（无名指）加以涂抹，范围不要太广，也不要太多，以能贴足够的蜡片为度。蛋白甘油粘片剂的配方：（不适宜用作蛋白观察）第36页，共47页，2023年，2月20日，星期五③将涂粘片剂的载玻片放在展片机上，滴加蒸馏水数滴，此时若发现水不均匀分散而聚成滴状，即表示玻片不清洁，有残留油脂等物在上面。④用解剖刀将蜡带切成小段，每段的长度应以盖玻片的长度为准，一般应比盖玻片短约1/5-2/5。分片应从蜡带交界处分。第37页，共47页，2023年，2月20日，星期五将蜡带轻轻移到涂有水的载玻片上，蜡片光面应向下贴在载玻片上，依次排列整齐。留出右端贴标签处。⑤材料展平后，从展片机上取下，稍稍倾斜留出多余的水分，用吸水纸吸干背面及周围多余水分，放于烤片机（35℃）上烤干水分。第38页，共47页，2023年，2月20日，星期五4.脱蜡：玻片烘干后，须将蜡脱去，才能染色，脱蜡用二甲苯，把烤好的载玻片放于盛二甲苯的染缸中纯二甲苯(5-10min)→纯二甲苯(5-10min)第39页，共47页，2023年，2月20日，星期五若分染需再经酒精入水中，而后染色，其顺序如下：

二甲苯→1/2二甲苯十1/2纯酒精→100%酒精→95％酒精→85％酒精→70％酒精→50％酒精→30％酒精→水→染色

以上各级约需5～10分钟。5.滴加加拿大树胶封藏。6．镜检：第40页，共47页，2023年，2月20日，星期五石蜡切片的异常及处理一张理想佳良的切片，除组织固定适当和染色清晰之外，还应具备：薄、平整，无皱褶压缩，无裂损抓迹及擦痕，同时贴片排列密集，整齐位置适当，透明度好，封片用胶适量，盖玻片端正，无气泡等。第41页，共47页，2023年，2月20日，星期五石蜡切片中的异常及原