枯草杆菌摇瓶发酵生产淀粉酶

枯草杆菌摇瓶发酵生产淀粉酶第1页，共44页，2023年，2月20日，星期五一、实验目的掌握酶的发酵生产方式之——微生物发酵产酶；学习和掌握摇瓶培养的方法。第2页，共44页，2023年，2月20日，星期五二、实验原理酶可由动物（如胰蛋白酶、胃蛋白酶）、植物（如木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶）和微生物（细菌、霉菌、酵母）产生，其中工业酶制剂大多数由微生物发酵法生产。由于微生物世代时间短，繁殖快、容易培养和管理，可大规模工业化生产，所以工业酶制剂大多由微生物发酵产生。产酶微生物的获得：

1、从有关菌种保藏机构购买

2、从自然界分离筛选第3页，共44页，2023年，2月20日，星期五产酶微生物的分离筛选方法1)样品的采集：从富含酶作用底物的场所采集样品。2)富集培养:投其所好，取其所抗。3)分离获得纯培养(pureculture)的微生物。4)初筛：选出产酶菌种，以多为主。5)复筛：选出产酶水平相对较高的菌株，以质为主。第4页，共44页，2023年，2月20日，星期五产酶工艺条件及其调节控制保藏细胞细胞活化细胞扩大培养发酵产酶分离纯化酶固定化细胞原生质体固定化原生质体培养基预培养无菌空气第5页，共44页，2023年，2月20日，星期五酶制剂的发酵生产过程图解第6页，共44页，2023年，2月20日，星期五30升全自动发酵罐第7页，共44页，2023年，2月20日，星期五第8页，共44页，2023年，2月20日，星期五第9页，共44页，2023年，2月20日，星期五发酵工艺参数的控制pH的调节控制温度的调节控制溶解氧的调节控制泡沫的控制染菌的控制第10页，共44页，2023年，2月20日，星期五酶的提取与分离纯化的工艺流程发酵液预处理（细菌絮凝）固液分离（离心、过滤）菌体（胞内酶）动植物源酶液体（胞外酶）细胞破碎提取固液分离液体第11页，共44页，2023年，2月20日，星期五工业、食品、饲料浓缩（蒸发、超滤、沉淀）浓缩液配方干燥医药、分析、科研液体酶固体酶浓缩分离纯化（离心、沉淀、膜分离、层析、电泳、萃取、结晶）配方、制剂干燥液体酶固体酶第12页，共44页，2023年，2月20日，星期五酶活力的测定酶活力：也称酶活性，酶催化一定化学反应的能力。酶活力大小可用在一定条件下，它所催化的某一化学反应的起始速率V0表示，即用反应起始阶段产物增加(或底物减少)的速率表示。v=-dS/dt=dP/dt第13页，共44页，2023年，2月20日，星期五酶活力测定方法酶活力测定的要求：快速、简便、准确。包括两个阶段：

1、将酶与反应底物混合均匀，在一定条件下反应一段时间；

2、测定反应液中底物或产物的变化量。第14页，共44页，2023年，2月20日，星期五酶活力测定的基本步骤：(1)根据酶催化的专一性，选择适宜的底物，并配制成一定浓度的底物溶液。(2)根据酶的动力学性质，确定酶催化反应的温度、pH值、底物浓度、激活剂浓度等反应条件。(3)在一定的条件下，将一定量的酶液和底物溶液混合均匀，适时记下反应开始的时间。(4)

反应到一定的时间，取出适量的反应液，运用各种生化检测技术，测定产物的生成量或底物的减少量。注意：若不能即时测出结果的，则要及时终止反应，然后再测定。第15页，共44页，2023年，2月20日，星期五终止酶反应的方法：加热使酶失活；加入适宜的酶变性剂（如三氯醋酸）；调节pH值；低温终止反应。第16页，共44页，2023年，2月20日，星期五酶活力测定方法根据测量操作过程终止反应法：在恒温反应系统中进行酶促反应，间隔一定时间取样，终止反应，进行测定。连续反应法：基于反应过程中光谱吸收、酸碱度等变化用仪器跟踪反应的进程、记录结果。第17页，共44页，2023年，2月20日，星期五酶活力测定方法根据底物或产物的物理化学性质化学测定法、光学测定法、气体测定法等。如化学滴定、比色法、紫外光吸收、荧光测定、同位素标记底物或称放射性化学法、酶偶联法等。其中化学滴定、紫外、可见光比色法最为常用。第18页，共44页，2023年，2月20日，星期五酶的反应速度的影响因素酶的反应速度受到许多条件的影响：底物浓度、温度、pH、金属离子等要准确地测定酶的活力，必须满足这些前提条件。最适反应条件：最适底物浓度、最适pH、最适温度、最适离子强度、必要的辅助因子；保证测定的是V0，即线性部分第19页，共44页，2023年，2月20日，星期五酶活力单位国际单位：1961年国际生物化学与分子生物学联合会规定：在特定条件下，每1min

催化1μmol

的底物转化为产物的酶量定义为1个酶活力单位。这个单位称为国际单位（IU）国际上另一个常用的酶活力单位是卡特（Kat）。在特定条件下，每秒催化1mol底物转化为产物的酶量定义为1卡特（Kat）。第20页，共44页，2023年，2月20日，星期五酶的比活力酶的比活力是酶纯度的一个指标，是指在特定条件下，单位重量（mg）蛋白质或RNA所具有的酶活力单位数。酶活力：样品中酶总共有多少个酶单位。比活力：每mg蛋白质中有多少个酶单位。

酶比活力＝酶活力（单位）/mg（蛋白或RNA）可用以比较每单位质量酶蛋白的催化能力。对同一种酶，比活力可以代表酶的纯度，比活力愈高，表示酶愈纯。在酶纯化过程中，比活力增高。第21页，共44页，2023年，2月20日，星期五淀粉水解酶类凡是能催化淀粉（或糖元）分子及其分子片段中的α-葡萄糖苷键水解的酶，统称为淀粉酶，包括α-淀粉酶，糖化酶，β-淀粉酶，异淀粉酶，环状糊精生成酶，麦芽寡糖生成酶等。广泛应用于淀粉糖工业、酒精、啤酒、味精、酿造、烘焙、饲料、纺织退浆、医药等领域。第22页，共44页，2023年，2月20日，星期五α-淀粉酶alpha-amylase

能水解淀粉分子链中的α-1,4-葡萄糖苷键，将淀粉链切断成为短链糊精和少量麦芽糖和葡萄糖，使淀粉粘度迅速下降的酶制剂。产品分类

按产品的适用温度分为:

中温α-淀粉酶制剂和耐高温α-

淀粉酶制剂。

按产品形态分为：液体剂型酶制剂和固体剂型酶制剂。第23页，共44页，2023年，2月20日，星期五第24页，共44页，2023年，2月20日，星期五中温α-淀粉酶中温α-液化型淀粉酶系用枯草芽孢杆菌（BacillusSubtilis)经发酵提炼精制而成。用途：

本产品适用于酒精、啤酒、味精、发酵工业的液化以及纺织退浆等。产品特性：

[物理特性]

外观：棕褐色液体

溶解性：易溶于水

比重：

1.15-1.25g/ml第25页，共44页，2023年，2月20日，星期五[化学物性]

热稳定性：需Ca2+150ppm，最适作用温度60-70℃，在70-90℃之间，随着温度升高，其反应速度加快，但失活也加快，适用于最高达90℃的液化过程。

pH6.0-7.0较为稳定；最适作用pH6.0，pH5.0以下失活严重。产品规格：

1，中温α-淀粉酶分为固体和液体两种剂型。固体分为2000、4000u/g,6000u/g三种。液体为2000u/ml2，酶活力定义：1ml酶液(1g酶粉)在60℃，pH6.0条件下，1小时液化可溶性淀粉的克数。第26页，共44页，2023年，2月20日，星期五耐高温α-淀粉酶耐高温α-淀粉酶采用地衣芽孢杆菌经深层培养，提取等工序精制而成，能随机水解淀粉、糖原及其降解物内部的α-1，4葡萄糖苷健使得胶状淀粉溶液的粘度迅速下降，产生可溶性糊精和寡聚糖，过度的水解可产生少量葡萄糖和麦芽糖。用途：耐高温α-淀粉酶具有极好的耐热性，能广泛应用于淀粉、酒精、啤酒、味精、酿造、纺织退浆等工业上。产品特性:(物理特性)

外观：棕褐色液体溶解性：易溶于水比重：

1.15-1.25g/ml第27页，共44页，2023年，2月20日，星期五[化学物性]钙离子对酶活稳定性的影响：较低浓度的钙离子存在，本品即可有很好的稳定性，对于淀粉的水解，推荐加入50-100ppm钙离子。pH范围：5.5-7.0最适6.0温度范围：

90-95℃在喷射液化工艺中瞬间温度达105-110℃，仍能有效水解淀粉。产品规格：

1，耐高温α-淀粉酶为液体酶制剂。酶活力：20000u/ml。

2，酶活力定义：1ml酶液在70℃，pH6.0条件下，1分钟液化可溶性淀粉的毫克数。第28页，共44页，2023年，2月20日，星期五α-淀粉酶制剂的理化要求第29页，共44页，2023年，2月20日，星期五α-淀粉酶制剂的卫生要求第30页，共44页，2023年，2月20日，星期五三、实验内容微生物发酵法是酶制剂生产的主要方法。发酵生产中多用液体深层发酵法制备酶。大规模液体深层发酵之前，首先在实验室对保藏的目的菌种进行活化和扩大培养，制得生产种子。扩大培养多采用摇瓶培养，即在锥形瓶中加入一定量的液体培养基，在摇床上以一定转速摇动进行恒温培养。摇瓶培养也是实验室模拟生产上进行发酵产酶的一种模拟实验。（摇瓶发酵生产α-淀粉酶）发酵液酶活力的测定。第31页，共44页，2023年，2月20日，星期五（一）摇瓶发酵产酶仪器和试剂1、菌种：枯草芽孢杆菌2、仪器耗材：恒温培养箱、冰箱、高压灭菌锅、无菌操作台、摇床、托盘天平、分析天平、电炉、白色搪瓷杯、三角瓶、量筒、纱布、绳子、pH试纸、玻棒等。第32页，共44页，2023年，2月20日，星期五实验步骤1、菌种：枯草杆菌（已活化好，每组1支）2、培养基的准备：查资料，自行设计3、工艺条件：查资料，自行设计4、菌种的制备：将斜面菌种在无菌条件下接种至液体种子培养基中，在一定温度、转速下培养。5、发酵：将摇床培养好的种子培养液接入发酵培养基中，接种量为5mL，共接3瓶（100ml/250ml瓶），做好标记。第33页，共44页，2023年，2月20日，星期五实验步骤发酵结束后：检查是否染菌固液分离：方法自定；

发酵结束时，显微镜检查每个发酵瓶是否污染，若无污染合并发酵液并测定发酵酶活力。第34页，共44页，2023年，2月20日，星期五（二）酶活测定原理：α-淀粉酶制剂能将淀粉分子链中的α-1,4-葡萄糖苷键随机切断成长短不一的短链糊精、少量麦芽糖和葡萄糖，而使淀粉对碘呈篮紫色的特性反应逐渐消失，呈现棕红色，其颜色消失的速度与酶活性有关，据此可通过反应后的吸光度计算酶活力。第35页，共44页，2023年，2月20日，星期五酶活定义

中温a一淀粉酶活力：

1g固体酶粉(或1mL液体酶)，于60℃、pH=6.0条件下，1h液化1g可溶性淀粉所需的酶量，即为1个酶活力单位，以u/g(u/mL)表示。耐高温a-淀粉酶活力：

1g固体酶粉(或1mL液体酶)，于70℃、pH=6.0条件下，1min液化1mg可溶性淀粉所需的酶量，即为1个酶活力单位，以u/g(u/mL)表示。第36页，共44页，2023年，2月20日，星期五实验仪器及试剂仪器：分光光度计、恒温水浴锅（控温精度±0.1℃）、移液管、试管、烧杯、容量瓶、玻璃棒、秒表。第37页，共44页，2023年，2月20日，星期五试剂及溶液试剂：碘、碘化钾、α-淀粉酶制剂、磷酸氢二钠、柠檬酸、盐酸、可溶性淀粉（湖州展望化学药业有限公司）。溶液配制：原碘液：称取11.0g碘和22.0g碘化钾，用少量水使碘完全溶解，定容至500mL，贮存于棕色瓶中。稀碘液：吸取原碘液2.00mL，加20.0g碘化钾用水溶解并定容至500mL，贮存于棕色瓶中。第38页，共44页，2023年，2月20日，星期五试剂及溶液溶液配制：

可溶性淀粉溶液(20g/L)：称取2.000g(精确至0.001g)可溶性淀粉(以绝干计)于烧杯中，用少量水调成浆状物，边搅拌边缓缓加入70mL沸水中，然后用水分次冲洗装淀粉的烧杯，洗液倒人其中，搅拌加热至完全透明，冷却定容至100mL。溶液现配现用。

磷酸缓冲液(pH=6.0)：称取45.23g磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)和8.07g柠檬酸(C6H8O7·H2O)，用水溶解并定容至1000mL。用pH计校正后使用。

盐酸溶液：c(HCI)=0.1mol/L。第39页，共44页，2023年，2月20日，星期五实验方法待测酶液的制备：称取1g~2g酶粉(精确至0.0001g)或准确吸取酶液1.00mL，用少量磷酸缓冲液充分溶解，将上清液小心倾入容量瓶中，若有剩余残渣，再加少量磷酸缓冲液充分研磨，最终样品全部移入容量瓶中，用磷酸缓冲液定容至刻度，摇匀。用四层纱布过滤，滤液待用。注:待测中温a-淀粉酶酶液酶活力控制酶浓度在3.4u/mL~4.5u/mL范围内，待测耐高温淀粉酶活力控制酶浓度在60u/mL~65u/mL范围内。第40页，共44页，2023年，2月20日，星期五酶活力测定吸取10.0mL可溶性淀粉溶液于试管中，加入磷酸缓冲液2.5mL，摇匀后，置于60℃±0.2℃(耐高温α-淀粉酶制剂置于70℃±0.2℃)恒温水浴中预热8min；加入0.5mL稀释好的待测酶液，立即计时，摇匀，准确反应5min；立即用移液管吸取1.0mL反应液，加到预先盛有0.5mL盐酸溶液和5.00mL稀碘液的试管中，摇匀，并以0.5mL