核酸的生物合成

核酸的生物合成第1页，共49页，2023年，2月20日，星期五遗传信息传递的中心法则蛋白质翻译转录逆转录复制复制DNARNA生物的遗传信息以密码的形式储存在DNA分子上，表现为特定的核苷酸排列顺序。在细胞分裂的过程中，通过DNA复制把亲代细胞所含的遗传信息忠实地传递给两个子代细胞。在子代细胞的生长发育过程中，这些遗传信息通过转录传递给RNA，再由RNA通过翻译转变成相应的蛋白质多肽链上的氨基酸排列顺序，由蛋白质执行各种各样的生物学功能，使后代表现出与亲代相似的遗传特征。

后来人们又发现，在宿主细胞中一些RNA病毒能以自己的RNA为模板复制出新的病毒RNA，还有一些RNA病毒能以其RNA为模板合成DNA，称为逆转录这是中心法则的补充。第2页，共49页，2023年，2月20日，星期五

中心法则总结了生物体内遗传信息的流动规律，揭示遗传的分子基础，不仅使人们对细胞的生长、发育、遗传、变异等生命现象有了更深刻的认识，而且以这方面的理论和技术为基础发展了基因工程，给人类的生产和生活带来了深刻的革命。第3页，共49页，2023年，2月20日，星期五一、DNA的半保留复制的概念

DNA在复制时，两条链解开分别作为模板，在DNA聚合酶的催化下按碱基互补的原则合成两条与模板链互补的新链，以组成新的DNA分子。这样新形成的两个DNA分子与亲代DNA分子的碱基顺序完全一样。由于子代DNA分子中一条链来自亲代，另一条链是新合成的，这种复制方式称为半保留复制。第一节DNA的生物合成

第4页，共49页，2023年，2月20日，星期五T2GenomicDNA

singlelinearDNA(about182,000bp)第5页，共49页，2023年，2月20日，星期五OldstrandNewstrandThehypothesisofsemiconservativereplication

proposedbyWatsonandCrickin1953.第6页，共49页，2023年，2月20日，星期五DNA的半保留复制实验Meselson&stahl用同位素示踪标记加密度梯度离心技术实验,证明了DNA是采取半保留的方式进行复制.第7页，共49页，2023年，2月20日，星期五复制中的大肠杆菌染色体放射自显影图

(Caims实验：阐明了大肠杆菌染色体DNA是一环状分子，并以半保留方式进行复制)

用3H-胸苷标记大肠杆菌DNA，经过近两代的时间，3H-胸苷掺入大肠杆菌DNA。用溶菌酶把细胞壁消化掉，使完整的大肠杆菌染色体DNA释放出来，放射自显影，得到上图。非复制部分（C）银粒子密度较低，由一股放射性链和一股非放射性链构成。已复制部分占整个染色体的三分之二，其中一条双链（B

）仅有一股链是标记的，另外一股双链（A

）的两股链都是标记的，银粒子密度为前二者的两倍。染色体全长约为1100微米。ABC环状DNA的复制ABC第8页，共49页，2023年，2月20日，星期五基因组能进行独立复制的单位称复制子，每个复制子都含有一个复制起点。原核生物的染色体和质粒、真核生物的细胞器DNA都是环状双链分子，它们都是单复制子，都在一个固定的起点开始复制，复制方向大多数是双向的，少数是单向复制。多数是对称复制，少数是不对称复制（一条链复制后才进行另一条链的复制）。环状DNA的复制眼象θ，称θ形复制。二、DNA复制的起点和方式第9页，共49页，2023年，2月20日，星期五

真核生物的染色体DNA是线形双链分子，含有许多复制起点，因此是多复制子，每个复制子约有100-200Kb。人体细胞平均每个染色体含有1000个复制子。

病毒DNA多种多样，环状或线形，双链或单链，但都是单复制子。复制方向:

定点起始，复制方向大多数是双向的（等速进行或异速进行），形成两个复制叉，少数是单向复制，形成一个复制叉。

第10页，共49页，2023年，2月20日，星期五DNA的双向和单向复制环状

DNA复制时所形成的θ结构起始点复制叉的推进复制叉起始点起始点起始点复制叉复制叉未复制DNA单向复制双向复制第11页，共49页，2023年，2月20日，星期五三、原核生物DNA聚合反应有关的酶类

1.DNA聚合酶(DNApolymetases)2.引物酶和引发体(primosome)：启动RNA引物链的合成。

3.DNA连接酶（DNAligase）4.DNA解链酶(DNAhelicase)

解旋酶DNA聚合酶III解链酶RNA引物引物酶和引发体DNA聚合酶ISSB3´3´5´3´5´5´RNA引物第12页，共49页，2023年，2月20日，星期五5.单链结合蛋白(single-strandbindingprotein,SSB)：结合在解开的DNA单链上，防止重新形成双螺旋。6.拓扑异构酶(topoisomerase):兼具内切酶和连接酶活力，能迅速将DNA超螺旋或双螺旋紧张状态变成松驰状态，便于解链。拓扑异构酶I使DNA的一条链发生断裂和再连接，反应无须供给能量，主要集中在活性转录区，与转录有关。拓扑异构酶Ⅱ使DNA的两条链同时断裂和再连接，当它引入超螺旋时需要由ATP供给能量。分布在染色质骨架蛋白和核基质部，与复制有关。第13页，共49页，2023年，2月20日，星期五第14页，共49页，2023年，2月20日，星期五大肠杆菌DNA聚合酶Ⅲ全酶的结构和功能延长因子DNA聚合酶Ⅲ两个亚基夹住DNADNA聚合酶Ⅲ异二聚体核心酶校对引物的结合和识别促使核心酶二聚化第15页，共49页，2023年，2月20日，星期五ArthurKornbergwonthe1959NobelPrizeinMedicineforhisdiscoveryofthemechanisminthebiologicalsynthesisofdeoxyribonucleicacid(beforeWatsonandCrickwontheirs!)1918,3,3-2007,10,26第16页，共49页，2023年，2月20日，星期五大肠杆菌三种DNA聚合酶比较DNA聚合酶Ⅱ相对分子质量每个细胞的分子统计数5´-3´聚合酶作用3´-5´核酸外切酶作用5´-3´核酸外切酶作用聚合速度(核苷酸/分)持续合成能力DNA聚合酶Ⅰ109，000400+++1000-12003-200120，000100++-24001500400，00010-20++-15000-60000>500000比较项目DNA聚合酶III切除引物修复修复复制功能第17页，共49页，2023年，2月20日，星期五DNA聚合酶催化的链延长反应5´RNA引物子链3´3´5´5´3´3´5´5´3´3´5´模板链第18页，共49页，2023年，2月20日，星期五DNA聚合酶催化的链延长反应n1dATPn2dGTPn3dCTPn4dTTP++++DNAdAMPdGMPdCMPdTMPDNA+(n1+n2+n3+n4)PPiMg2+DNA聚合酶第19页，共49页，2023年，2月20日，星期五第20页，共49页，2023年，2月20日，星期五DNA聚合酶的3´-5´外切酶水解位点3´3´5´5´错配碱基3´-5´核酸外切酶水解位点第21页，共49页，2023年，2月20日，星期五DNA聚合酶5´-3´外切酶活力

5´-3´核酸外切酶水解位点单链缺口5´第22页，共49页，2023年，2月20日，星期五DNA聚合酶水解引物并填补缺口第23页，共49页，2023年，2月20日，星期五DNA复制酶系总览第24页，共49页，2023年，2月20日，星期五四、原核细胞DNA的半不连续复制过程前导链（leadingstrand）

：当复制叉沿DNA向前移动时，由于两条模板链是反向平行的，而DNA聚合酶只能以5‘→3’的方向合成新链，同时新链必须与模板链反向平行，碱基配对。这样，以走向3‘→5’的亲代链为模板，子代链就能连续合成，称为前导链；滞后链（laggingstrand）

：以走向5‘→3’的亲代链为模板，在其上DNA也是以5‘→3’方向合成，因此和复制叉移动的方向正好相反，所以随着复制叉的移动，形成许多不连续的片段，最后连成一条完整的DNA链，该链称为滞后链。第25页，共49页，2023年，2月20日，星期五复制叉的移动方向解旋酶DNA聚合酶III解链酶RNA引物引物体DNA聚合酶ISSB3´3´5´前导链随后链3´5´复制的起始DNA链的延长DNA链终止5´RNA引物3´3´半不连续复制过程第26页，共49页，2023年，2月20日，星期五聚合酶III核心酶大肠杆菌复制体结构示意图聚合酶I聚合酶III核心酶滞后链前导链解螺旋酶引物合成酶RNA引物引发体拓扑异构酶II-夹子-聚体-夹子-复合物RNA引物单链结合蛋白（SSB）第27页，共49页，2023年，2月20日，星期五E.Coli基因结构及复制起始点第28页，共49页，2023年，2月20日，星期五大肠杆菌复制起点成串排列的重复序列GATCTNTTNTTT成串排列的三个13bp序列共有序列共有序列TTATCCACA

DnaA蛋白结合位点四个9bp序列DnaADnaB(解螺旋酶)SSB大肠杆菌DNA复制起点在起始阶段的结构模型第29页，共49页，2023年，2月20日，星期五ThepreprimingcomplexisformedattheOriC,withtheparticipationofDnaA,HU,DnaB,DnaCandotherproteins.Thepreprimingcomplex第30页，共49页，2023年，2月20日，星期五1.复制的起始起始：当DNA的双螺旋解开后，合成RNA引物的过程。引发体：引物合成酶与各种蛋白质因子构成的复合体，负责RNA引物的合成。引发体沿着模板链5’→3’方向移动（与冈崎片段合成的方向正好相反，而与复制叉移动的方向相同），移到一定位置上即可引发RNA引物的合成。（1）DNA解旋、解链、形成复制叉；（2）RNA引物合成。第31页，共49页，2023年，2月20日，星期五引物酶合成RNA引物第32页，共49页，2023年，2月20日，星期五2.复制的延伸

复制体：在DNA合成的生长点（既复制叉上）分布着许多与复制有关的酶和辅助因子，它们在DNA的模板链形成离散的复合物，彼此配合进行高度精确的复制，称为复制体。复制体沿着复制叉方向前进就合成DNA。（1）子链延长；（2）半不连续合成。前导链只需要一个RNA引物，后随链的每一个冈崎片段都需要一个RNA引物，链的延长反应由DNApol.Ⅲ催化。第33页，共49页，2023年，2月20日，星期五半不连续复制第34页，共49页，2023年，2月20日，星期五DNA聚合酶延长子链第35页，共49页，2023年，2月20日，星期五（3）RNA引物的切除及缺口补齐

DNApolⅠ的5‘→3’外切酶活性，切除RNA引物。

DNApolⅠ的5‘→3’聚合酶活性补齐缺口（4）DNA切口的连接

DNAligase，动物、真核由ATP供能，原核由NAD+供能。

3.DNA合成的终止

环状DNA、线性DNA，复制叉相遇即终止。第36页，共49页，2023年，2月20日，星期五DNA的复制过程第37页，共49页，2023年，2月20日，星期五DNAligasefirsttransfersanAMPmoietytothe5`phosphategroup(fromNAD+orATP)beforemakingaphosphodiest-erbond.连接酶连接两个冈崎片段第38页，共49页，2023年，2月20日，星期五第39页，共49页，2023年，2月20日，星期五连接酶连接切口Mg2+连接酶ATP或NAD＋AMP+PPi或NMN+AMPATCGPTTPPPAACCTGAPACPPPPOHTGGATCGPTTPPPAACCTGAPACPPPTGGP缺口3'3'5'5'5'5'3'3'模板链模板链第40页，共49页，2023年，2月20日，星期五大肠杆菌染色体复制的终止oric复制叉2复制叉1终止复制叉2终止复制叉1复制叉1复制叉2完成复制DNA拓扑异构酶连锁染色体第41页，共49页，2023年，2月20日，星期五DNA复制过程小结：

（1）DNA解螺旋酶解开双链DNA。

（2）SSB结合于DNA单链。

（3）DNA旋转酶引入负超螺旋，消除复制叉前进时带来的扭曲张力。

（4）DNA引物酶(在引发体中)合成RNA引物

（5）DNApol.Ⅲ在两条新生链上合成DNA。

（6）DNApolⅠ切除RNA引物，并补上DNA

（7）DNAligase连接冈崎片段。第42页，共49页，2023年，2月20日，星期五DNA聚合反应必备的条件

（1）DNA聚合酶

（2）DNA模板(反转录时用RNA模板)

（3）引物(DNA、RNA)

（4）4种dNTP

（5）Mg2+

第43页，共49页，2023年，2月20日，星期五

聚合反应过程

在链的延长过程中，链的游离3‘-羟基，对进入的脱氧核糖核苷三磷酸α磷原子发生亲核攻击，生成3’,5‘-磷酸二酯键，并脱下焦磷酸。

DNA聚合酶的反应特点（1）以4种dNTP为底物（2）反应需要接受模板的指导，不能催化游离的dNTP的聚合。（3）反应需有引物3‘-羟基存在。（4）链生长方向5‘→3’（5）产物DNA的性质与模板相同第44页，共49页，2023年，2月20日，星期五五、复制的忠实性

DNA复制过程是一个高度精确的过程，据估计，大肠杆菌DNA复制5109碱基对仅出现一个误差，保证复制忠实性的原因主要有以下三点:DNA聚合酶的高度专一性（严格遵循碱基配对原则，但错配率为710-6

）DNA聚合酶的校对功能（错配碱基被3’-5’外切酶切除）起始时以RNA作为引物第45页，共49页，2023年，2月20日，星期五起始时以RNA作为引物的作用

DNA复制为什么要合成一个RNA引物，而后又把这个引物消除呢？这是保证DNA聚合过程高度精确的又一措施。已知DNA聚合酶具有35外切酶功能校对复制过程中的核苷酸，也就是说聚合酶在开始形成一个新的磷酸二酯键前，总是检查前一个碱基是否正确，这就决定了它不能从头开始合成。因此先合成一条低忠实性的多核苷酸来开始DNA的合成，并以核糖核苷酸来表示是“暂时”的，当DNA开始聚合以后再以53外切酶的功能切除，以高忠实性的脱氧核苷酸取而代之，确保复制的忠实性