流行性乙型脑炎病毒危害评估报告

流行性乙型脑炎病毒危害评估报告流行性乙型脑炎病毒危害评估报告的部分内容如下，流行性乙型脑炎是经蚊虫媒介传播的一种人畜共患性疾病。1935年日本的学者从病死脑炎病人的脑组织中分离到该病毒，国际上，将这种病原体命名为日本脑炎病毒(JapaneseencephalitisvirusJEV)，简称''乙脑病毒〃。我国称为''流行性乙型脑炎〃，简称''乙脑〃。根据《中华人民共和国传染病防治法》，流行性乙型脑炎属于乙类传染病。(-)不同实验室操作生物安全实验室级别要求根据《名录》的要求，在实验室操作可能含有和确定含有乙型脑炎病毒感染性材料或未经培养的感染性材料以及病毒培养、动物感染实验，务必在BSL—2实验室内进行；在对灭活、无感染性材料进行操作时，确认的乙脑病毒灭活措施有效后，方可进入BSL—1实验室进行诸如ELISA,PCR等后续实验检测过程。二、背景资料(一)一般生物学特性1、形态染色乙型脑炎病毒属于黄病毒科(Flaviviridae),黄病毒属(flavi-virus)。电镜下病毒颗粒大致呈球形，直径40~60nm左右。超薄切片上可看到一层外膜(膜蛋白囊膜)和一个电子密集的核心(RNA蛋白)，围绕成一个清晰的结构。负染色体可见一些明显的突起部分分布在外膜上，由32个子粒组成的衣壳呈明显的对称二十面体。病毒基因组为llkb左右的单股、正链RNA。脂质双分子层中镶嵌有糖基化的包膜蛋白(E)和膜蛋白(M)。在脂蛋白囊膜表面有血凝素刺突，能凝集鸡、鹅、羊等动物红细胞。JEV抗原性稳定，人和动物感染JEV后，均产生补体结合抗体、中和抗体和血凝抑制抗体。2、培养特性JEV能够感染多种细胞，C6/36、BHK21、Vero等细胞株和金黄色地鼠肾、猪肾、狗肾、鸡胚等原代细胞均对乙型肝炎病毒敏感，并引起典型的细胞病变。较敏感的细胞包括金黄色地鼠肾细胞，猪肾细胞。上述细胞感染乙型脑炎病毒后均能够大量繁殖扩增到增到较高的滴度，并引起明显的细胞病变，细胞病变表现为细胞圆缩,脱落：C6/36细胞上的病变可以表现为聚集、圆缩以及脱落等。在琼脂糖覆盖下，鸡胚、地鼠肾、Vero等细胞均能形成蚀斑。本病毒的这一特性可用于减毒疫苗苗株的筛选。乙型脑炎病毒有明显的嗜神经特性，接种小鼠、金黄色地鼠、猴、马、绵羊、山羊等动物内均可引起典型的神经系统症状，乳鼠可经皮下接种而感染，小鼠是常用的实验动物模型。能凝集多种动物血红细胞。病毒在细胞和鼠脑内连续传代，可使毒力下降。(1)原代细胞：原代细胞较敏感。而常用的为黄金色地鼠肾细胞(BHK-21)o培养环境：含EagLe's液、胎牛血清、青霉素和链霉素(PS)1%谷氨酰胺(G)的生长维持液；ph值至7.2~7.4；37℃5%CO2培养箱孵育。以小量病毒(10TCID50)感染后，病毒很快繁殖，24H开始出现病变，72H病变明显，病毒滴度可达107TCID50/ml以上。其他常用细胞有鸡胚纤维母细胞，常用于蚀斑培养。（2）传代细胞：以白蚊伊蚊C6/36细胞为最敏感，培养环境：含EagLe's液、1640培养液、胎牛血清、青霉素和链霉素（PS）、1%1%谷氨酰胺（G）的生长维持液；ph值至7.2~7,4。在28℃的5%CO2培养箱孵育。病毒反之滴度高达108TCID50/ml,但细胞病变不甚明显。BHK-21细胞可用于培养，也可适用于做蚀斑，此外，人二倍体细胞也可培养病毒。不同细胞的敏感性不同。（二）乙脑病毒对外环境的稳定性L自然环境中的稳定性与对温度的敏感性乙型脑炎病毒对外界抵抗力弱，不耐热，50°C30min或54°C10min即可灭活，对低温和干燥抵抗力较强，在4℃冰箱中能保存数年，如加甘油或血清保存可增加其稳定性。病毒感染性在PH7~9时最为稳定，在-70°C或冷冻干燥存放较为稳定，存于4℃的患者血清或其他感染材料的感染性可保持数周之久。2.对紫外线、生物试剂的敏感性超声波（560千周/S）、紫外线可灭活病毒。毒粒经蛋白酶处理，不仅可以灭活，且表面突出物及血凝素也全部消失。病毒在不同的稀释剂内的稳定性有明显的不同，如10%水解乳蛋白和5%乳糖是较好的稀释剂。3,化学因子的敏感性乙型脑炎病毒属于有包膜的RNA病毒，对乙醛、氯仿、蛋白酶、乳酸、高镒酸钾、龙胆紫等均可灭活病毒。（三）乙型病毒的致病性和感染数量L致病性当携带乙脑病毒的蚊虫叮咬宿主时，病毒随蚊虫的唾液进入人体内。首先在局部的毛细血管内皮细胞和局部淋巴组织的细胞中增殖，然后病毒释放入血形成短暂的低水平的病毒血症期，病毒经过血液循环扩散到肝、脾等处的细胞中增殖，一般仅表现出轻微的症状或无症状。乙脑病毒通过附着于人体的中枢神经的血管内皮细胞，内吞作用下进入细胞内囊泡中，进而被血管周围的细胞摄取并运送至中枢神经系统。尤其在血脑屏障受损或脑实质已被病毒入侵时更容易诱发脑炎。经过4~7D的病毒增殖过程，大量病毒再次释放入血形成第二次病毒血症，引起发热、寒战、出疹和其他全身不适的症状；乙脑病毒能够导致严重的中枢神经系统病理改变，表现为：可引起脑实质广泛病变，以大脑皮质、脑干及基底核的病变最为明显；脑桥、小脑和延髓次之，脊髓病变最轻。其基本病理改变为：①血管内皮细胞损害，可见脑膜与脑实质小血管扩张、充血、出血及血栓形成，血管周围套式细胞浸润；②神经细胞变性坏死，液化溶解后形成大小不等的筛状软化灶；③局部胶质细胞增生，形成胶质小结。部分患者脑水肿严重，颅内压升高或进一步导致脑疝。病后免疫力强而持久，罕有二次发病者。多种动物敏感对乙型脑炎病毒，将乙型脑炎病毒颅内接种小白鼠、金黄色地鼠、马、绵羊、山羊、马等都能够发生典型的神经系统症状和病理改变。一般颅内接种3日龄乳鼠，2~3D内病变达到最强表现为死亡，首先表现为离群、抽搐、拒乳、行动迟缓、后肢活动障碍、平衡能力下降，中枢神经系统症状渐进性发展最终对外界刺激反映能力下降或消失、体温下降直至死亡，通常皮下方式接种21日龄以下的小白鼠，致病变作用明显，病毒先在神经组织繁殖，再通过血脑屏障侵入神经组织，引起脑炎而死亡。2,感染数量目前尚无乙脑对人的感染剂量的相关报道（四）乙脑病毒的传播途径及暴露的后果.自然状态下乙脑的传播途径乙脑属于血液传播的自然疫源性疾病。病毒通常在猪一蚊一猪之间循环。通过媒介昆虫叮咬处于病毒血症的动物，乙脑病毒在昆虫体内增殖，再叮咬人，通过口器把病毒传到人体而引起感染发病。乙脑的传染源是受感染的动物和人。动物：主要是猪，其次为家鼠、猴、马、牛、羊、兔、田鼠、仓鼠、鸡、鸭以及鸟类等。猪成为主要传染源，蚊虫是乙脑病毒的最主要的扩散宿主和传染源。.实验室操作所致的非自然状态下乙脑感染途径实验室操作可能发生感染的途径主要有：大量活病毒操作时形成的感染性气溶胶传播、开放型伤口等。气溶胶的产生环节包括：离心、病毒悬液分装、病毒培养换液以及实验动物标本注射、标本解剖等环节。开放型伤口感染模式主要发生在：实验动物接种与实验动物解剖过程中注射器针头或破裂的病毒培养瓶扎伤、划破；被实验室内感染有病毒的齿动物咬伤；破损的皮肤或黏膜组织接触到病毒等造成意外胃肠外接种等（六）乙脑的预防、诊断和治疗L预防（1）免疫接种：接种乙脑疫苗以提高人群免疫力是预防乙脑的重要措施之一。接种对象是流行区的儿童及从非流行区到流行区的敏感人群。目前有灭活疫苗和活疫苗两种。为了确保疫苗接种效果，接种时间应在流行季节前1~3个月完成。儿童初次基础免疫后应按规定加强免疫。疫苗在运输和储存过程中均应在4℃保存。以保证其有效性。我国目前广泛使用的乙脑疫苗有地鼠肾灭活疫苗和地鼠肾减毒活疫苗。目前已研制出纯化浓缩的灭活疫苗。我国的乙脑减毒活疫苗自1989年批准生产以来，10年多共生产两亿多人份，接种约1亿多人,实验观察副反应较轻，认为是安全有效的，但免疫持久性有待进一步观察。（2）灭蚊防蚊：灭蚊、防蚊为预防本病的主要环节。针对传播乙脑病毒的蚊虫所采取的以环境智力为主的综合防制措施是切断法。宜开展以灭蚊为中心的群众性爱国卫生运动，在农村重点是消灭牲畜（特别是猪圈）的蚊虫。黄昏户外活动应避免蚊虫叮咬。（3）化学药物等防制：在我国现阶段，采用化学防制方法也是最重要的手段,对一时无法清除的孽生地，可使用灭幼虫杀虫剂定期喷洒,如20%清氛杀虫乳油、生物蛙、必克幼、2%毗虫琳灭幼颗粒剂等药物，效果较好。尤其在发生蚊媒传染病的疫区，使用化学药物，迅速降低成蚊密度是当务之急，通过化学药物的空间喷雾和滞留喷洒达到成蚊防制。（4）实验室防护：针对前述可能出现实验室感染的环节：离心时，使用带盖的密封离心机；严格按照生物安全操作规范，病毒培养操作时，要求实验操作务必轻柔规范，并且要求使用负压设施；实验操作过程中，佩戴符合生物安全标准的防护器材包括：口罩、帽子、手套和隔离衣等；定期进行生物安全耗材的评价、评估工作；进行动物实验，务必小心，警惕不要被锐器扎伤，动作轻柔最大限度地减少气溶胶产生的可能性。2.诊断根据流行病学资料、临床症状和体征以及实验室检查结果的综合分析进行诊断，但确诊则需要依靠抗体检查或病原分离。(1)流行病学：在乙脑流行区居住，在蚊虫叮咬季节发病或发病前25D内在蚊虫叮咬季节到过乙脑流行区。(2)临床症状和体征：急性起病，发热头痛、喷射性呕吐、嗜睡，伴有脑膜刺激症状。急性起病，发热2~3D后出现不同程度的意识障碍，如昏迷、惊厥、抽搐、肢体痉挛性麻痹等中枢神经系统症状，或发展至中枢性呼吸循环衰竭。(-)乙脑病毒的复苏L冻存的细胞培养病毒毒种的复苏(略).干燥管保存的毒种的复苏(略),感染的鼠脑组织(1)可能危害：在振荡器上振荡破碎及离心过程中易形成气溶胶的溢出、液体溅出和离心管的可能破裂。(2)预防及处置措施：振荡过程中一定要把离心管口封严，同时要在生物安全柜内进行操作。离心后一定要在生物安全柜内打开离心管吸取上清液。若离心管发生破裂，按《BSL-2实验室安全手册》中意外事故处理办法章节处理。打开离心管时，若液体溅出到安全柜台面应及时消毒处理。方法参见《BSL-3实验室安全手册》中以外事故处理办法章节中相关内容。若溅到操作者身体上，其处理参见《BSL-2室安全手册》中《意外事故处理办法》章节中相关内容。若手套污染必须经高压处理后才允许运出实验室进行集中处理。（二）病毒的培养与扩增（略）（三）病毒灭活和灭活效果评价L可能危害吸取病毒液时有可能发生液体溅出、滴洒到实验台面上等。装有毒液的的盖子上可能沾有病毒液，开盖时可能会溅出，吸液时可能会污染移液枪壁：稀释混匀过程可能会形成气溶胶。2,预防及处置措施加液过程中台面上铺上浸有消毒剂的纱布或一次性吸水纸，一旦发生意外，马上将污染的纱布或纸弃入含10%有效氯的次氯酸钠的消毒缸内并立即消毒台面并更换新的纱布或吸水纸。幻业过程中动作要轻，弃液时应将吸管插入消毒液面下，方法参见《BSL-3实验室安全手册》中《意外事故处理办法》相关章节内容。装有病毒液的管子开盖前先离心；稀释混匀过程不要用吸头吹打，而是盖紧瓶盖后在振荡器上混匀。3,病毒的保存略。（四）病毒冻干保存1,可能危害分装操作中可能有气溶胶的产生；在毒种管封口、储存中可能发生破裂；破裂的毒种管可能划伤实验人员。2,预防及处置措施操作轻柔，病毒液要贴壁缓缓流下，封口时要力度合适，如发生毒种管破裂或划伤情况，请参见《BSL-2实验室安全手册》中《意外事故处理办法》章节中相关内容处理。（五）毒种的运输（略）（六）标本采集、运输和保存（略）（七）病毒分离（略）（A）病毒检测1.ELISALISA检测中使用全病毒抗原的情况下，包被抗原和检测后包被材料的消毒、废弃值得注意。要求在生物安全二级实验室生物安全柜内进行活病毒抗原包被，操作者应着防护装备，戴手套，包被好的检测板最好密封，放置4℃冰箱内过夜。由于活病毒的存在及造成扩散的危险，检测后应将检测板放置于消毒液内，将可能存留的病毒灭活，而后废弃。2.IFAIFA检测中也会涉及使用活病毒作为抗原的情况，所以制备抗原片时应在生物安全二级实验室生物安全柜内进行，用过的抗原片应在消毒液中浸泡消毒后再废弃。.PCR严格执行PCR功能分区，防止病原核酸和环境双向污染极其重要。PCR过程中使用的与核酸或CDNA接触的枪头要回收至密闭容器内。使用的一次性手套等物品，务必置于密闭垃圾桶内废弃。.Real-timePCR对环境洁净度要求比PCR严格，因此每次Real-timePCR使用的枪头，一次性手套均应即使置于密闭容器中，回收废弃。5,中和试验中和试验中一定会使用活病毒，操作费时费力，应特别注意安全，应在生物二级实验室生物安全柜内进行，留下的可能有活病毒的物品，要及时浸泡消毒液，消毒后方可废弃。（九）病毒滴定（略）（+）乙型脑炎病毒的中和试验1,可能危害装有病毒液的盖子上可能沾有毒液，开盖时可能回溅出,吸液时可能会污染移液枪壁；稀释混匀过程可能会形成气溶胶；病毒液滴有可能发生液体溅出、洒在实验台面上。2,预防及处置措施装有病毒液的管子开盖前先离心；稀释混匀过程不要用吸头吹打，而是盖紧后在振荡器上混匀；吸液过程中动作要轻,弃液时应将吸管插入液面下；加液过程中台面上铺上浸有消毒剂的纱布，一旦发生上述意外，实验过程中产生的耗材等都必须经高压处理后才允许运出实验室进行处理。（H八一）蚊虫饲养与蚊虫的病毒接种（略）四.工作人员的预防接种和工作人员素质（-）工作人员的预防接种根据《中华人民共和国传染病防治法》及《突法公共卫生事件应急条例》有关法律法规，并参照《中国疾病预防控制中心实验室人员管理规定（试行）》及世界卫生组织关于《实验室生物安全手册》等制定出实验室人员健康管理规定。集体措施如下：1,进行乙型脑炎病毒相关操作的人员必须取得以下资格或处于以下工作状态（1）完成乙型脑炎病毒疫苗接种程序，并且进行抗体检测（2）经过规范的生物安全培训，并经过严格考核和取得上级主管部门人员许可；发生严重的发热性疾病、卡他性炎症以及有近期较深的开放性伤口的人员应该禁止或限制其进入相关实验操作区。（3）限制在妊娠早期的工作人员进行乙型脑炎病毒相关的感染性材料的操作。.根据实验室从事乙脑病毒需要，为实验室人员建立健康档案；新工作人员进实验室前必须进行本实验室规定项目的体检，并根据需要进行疫苗接种；每年最少一次为本实验室职工提供相关项目体检，体检日期定在每年9、10月份流行期过后，有条件的话，最好每年流行期前后都要进行体检；项目包括内科常规检查，血常规、尿常规检查,肝功能、肝、脾B超，心电图，抗体检测，血凝抑制试验。.实行健康监测报告，实验室人员必须在身体状况良好的情况下，才能进入实验室工作。建立监测网，有关人员必须每天监察实验人员健康状况，一旦出现体温升高和身体状况异常及时向本单位医务室报告，进行必要的医学观察和处置。从事与乙脑病毒有关的实验工作后,在相应疾病的平均潜伏期内不得离开实验室所在地，因工作原因必须离开时，务必采取相应的监测或预防措施。.对所有从事乙脑病毒的实验室工作人员在进入实验室前都要做健康体检，保留血样，定期体检采集的血清标本留在健康档案中备案。五,评估结论（一）各种实验活动的防护措施1•凡是涉及到活病毒的操作如病毒分离、组织培养、TCID50测定、中和实验和空斑实验等，因为一直病毒，而且病毒种子的浓度较高，可能会发生通过意外胃肠外接种、皮肤和黏膜接触感染或通过气溶胶感染等实验室意外感染。因此，对JEV活病毒的操作都必须在生物安全二级实验室的外排式生物安全柜内操作。上岗前必须接受严格的生物安全以及该病毒实验技术的培训I,在个人防护措施上应按生物安全二级实验室防护级别进行个人防护。实验完毕后能高压的废弃物在实验室内121C高压处理20min后才允许运出实验室，不能高压的物品用含10%有效氯的次氯酸钠溶液进行浸泡消毒30min以上。2.临床疑是病人标本（血清和脑脊液标本）中JEV的分离：如果知识未知病毒性脑炎暴发，而且根据流行季节和暴露史等怀疑为虫媒病毒性脑炎，因临床疑是病人标本中病毒较少，且虫媒病毒一般都需要通过感染的媒介蚊虫叮咬传播，气溶胶造成的感染罕见报道，因此分离病毒可在生物安全二级实验室，在个人防护措施上应按生物安全二级实验室防护级别进行个人防护。3,已经灭活的病毒或标本，用于病毒特异性核酸和特异性抗体的检测：此类实验因病毒已经灭活，可BSL级实验室进行操作。用于核酸提取的已知病毒和临床疑是病人标本的灭活过程，而且在PCR室进行后续抽提过程，然后进