双荧光素酶系统实验操作步骤与方法-

报告基因(reportergene):是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，也就是说，是一个其表达产物非常容易被鉴定的基因。一般的，把报告基因的编码序列和基因表达调节序列相融合形成嵌合基因，或与其它目的基因相融合，从而利用它的表达产物来标定目的基因的表达调控。在动物基因表达调控的研究中，报告基因被广泛应用。如绿色荧光蛋白(GFP）和荧光素酶。一、概述第一页，共13页。荧光素酶（Luciferase）：是能够催化不同底物氧化发光的一类酶的统称，哺乳细胞无内源性荧光素酶。荧光素酶报告基因的优点蛋白不需要翻译后加工，所以一旦翻译立即产生报告活性。在所有的化学发光反应中，它的光产物具有最高的量子效率，因而非常灵敏。另外，在宿主细胞及检测试剂中均检测不到背景发光。检测快速，每个样品只需几秒钟。第二页，共13页。构建成荧光素酶报告质粒。然后转染细胞，适当刺激或处理后裂解细胞，测定荧光素酶活性。通过荧光素酶活性的高低判断刺激前后或不同刺激对感兴趣的调控元件的影响。二、实验原理

利用荧光素酶与底物结合发生化学发光反应的特性，把感兴趣的基因转录的调控元件克隆在萤火虫荧光素酶基因（fireflyluciferase）的上游，LUC启动子细胞内目的基因的转录被激活未处理对照刺激物处理启动子-Luc转染细胞启动子-Luc的启动子被激活Luc的转录Luc表达量测得的荧光值第三页，共13页。同时，为了减少内在的变化因素（如：培养细胞的数目和活力的差别，细胞转染和裂解的效率等）对实验准确性的影响，将带有海肾荧光素酶基因（Rinillaluciferase）的质粒（phRL-TK）作为对照质粒与报告基因质粒共转染细胞，提供转录活力的内对照，使测试结果不受实验条件变化的干扰。在测量过程中，当加入荧光素酶检测试剂II(LARII)时产生萤火虫荧光信号，这样先测量萤火虫荧光素酶报告基因。定量萤火虫荧光强度之后，再在同一样品中加入Stop&Glo®试剂，将上述反应淬灭，并同时启动海肾荧光素酶反应，同时进行第二次测量。第四页，共13页。A．检测前相关试剂配制1.1XPLB裂解缓冲液配制：将4×体积水或PBS加入1×体积5XPLB裂解缓冲液。（使用前在室温平衡1X缓冲液，平衡需2-3min）。2.LuciferaseAssayReagentII(LARII)配制：将LuciferaseAssayBufferII加入LuciferaseAssaySubstrate充分混合后，分装，置于-20℃避光保存。（一次配好，分装成小管，避免反复冻融），使用前将配好的LARII从-20℃拿出，并平衡至室温（需20-30min）。三、操作程序与结果判定第五页，共13页。3.Stop&Glo®Reagent配制：现用现配，先将Stop&Glo®Buffer放在37度温箱中平衡至室温（15-30min），再将1倍体积的50XStop&Glo®Substrate加入49倍体积的将Stop&Glo®Buffer中。第六页，共13页。B．样品制备1.仔细地将生长培养基从待检细胞孔中吸出。用1XPBS漂洗细胞2-3次。此过程必须仔细，并尽量将漂洗用PBS吸尽（防止细胞掉落）。2.24孔板每孔加入100-150μl1X裂解缓冲液PLB以覆盖细胞。然后将24孔板置摇床振摇20-30min以保证裂解缓冲液完全裂解细胞。第七页，共13页。C．双荧光素酶检测（PromegaGLOMAX）(注：系统运行时请勿触摸操作屏)1.重新设定系统：ToolsSettingsReset2.双荧光素酶检测程序的设定：ProtocolsRunPromegaProtocolDLR-O-INJOK3.将50μlLARII加入1.5mlEP管中（专用的进口EP管），取10μl细胞裂解液加入装有LARII的1.5mlEP管中，吹打2-3次混匀（尽量不要吹出气泡），置于检测仪，点击“Measure”开始读数（为萤火虫荧光素酶反应强度）。（使用前LARII要混匀，并平衡到室温）第八页，共13页。4.测量结束后，取出EP管，再加入50μlStop&Glo®Reagent，吹打2-3次混匀（尽量不要吹出气泡），再次置于检测仪，点击“Measure”开始读数（为内参海肾荧光素酶反应强度）。（Stop&Glo®Reagent现配现用，不能保存）5.记录读数:每个样品会有3个数值：RLU1——萤火虫荧光素酶反应强度,RLU2——内参海肾荧光素酶反应强度,Ratio——RLU1/RLU2。一般记录Ratio值即可，但RLU1和RLU2为实际荧光强度值，可以反映细胞的转染效率，也可根据实际荧光强度来调整报告质粒与内参的比例。第九页，共13页。6.测量完毕后，请将最后检测的EP管取出后，关闭仪器。7.实验结果的处理与分析：采用双样本等方差t检验进行处理，P＜0.05为差异显著，P＜0.01为差异极显著。第十页，共13页。四、注意事项由于温度对酶反应有影响，所以测定时样品和试剂均需达到室温后再进行测定。Renilla荧光素酶检测工作液后需配制后立即使用，不可配制成工作液后长期保存。LuciferaseAssayReagentII(LARII)不能反复冻融，保证每次用同一批次的LARII。配好的LARII在-20度可稳定一个月，在-70度可稳定一年。第十一页，共13页。试剂保存和使用时都应避光。为取得最佳测定效果，测定