基因表达的检测课件

基因表达检测第三部分：RT-PCR(ReversetranscriptionPCR)

ReverseTranscriptionPCR

RNA抽提cDNA反转录基因特异性引导Oligo(dT)引导随机六核苷酸引物引导PCRNorthernBlotting基因表达分析NorthernBlottingAwardedNobelPrizeforChemistryin1993.基因表达水平（梁大成等，2006）mRNA反转录生成的cDNA可作为PCR的模板进行扩增称为RT-PCR，RT-PCR比Northern杂交更灵敏，对RNA的质量要求较低，操作简便，它是在转录水平上检测基因时空表达的常用方法。

实验原理被污染的试剂，缓冲液移液器使用的器皿及tip等操作者的手，头发等

RNA操作中应注意的问题：防止RNase污染外源RNase的主要来源：当处理RNA时，移液器专用保证RNA实验用的玻璃器皿、塑料制品和缓冲液等留出专用；溶液和试剂分装成小份保存；RNA电泳装置专用（清洗、处理、DEPC处理过的水冲洗）；防止外源RNase污染的主要措施(一）：材料要新鲜;裂解过程要同RNase活性抑制同步防止内源RNA酶降解RNARNA酶抑制剂RNA酶是一种强有力的酶，在RNA分离和鉴定的各个阶段严重威胁RNA的完整性。用来使RNA酶不发挥作用的RNA酶抑制剂主要有：DEPC(Diethyl-pyrocarbonate)或DMDC(Dimethyl-dicarbonate)氧钒核糖核苷复合物

RNA酶的蛋白质抑制剂DEPC:是高度活性的烷基化试剂，通过组胺基团乙氧基甲酸化形式破坏RNase的活性OCCOO-CH2-CH3-CH2-CH3氧钒核糖核苷复合物:能与多种RNA酶活性位点结合并几乎百分之百地抑制RNA酶的活性RNAEXTRACTION(miniprep)

RNA的制备与分析对于了解基因在转录水平上的调节和cDNA的合成都是必须的，RNA的纯度和完整性对于Northernblot,RT-PCR和cDNA文库的构建等分子生物学实验都至关重要。RNA分离的方法很多，最关键的因素是尽量减少RNA酶的污染。

实验目的：学习RNA的简易制备过程，通过RNA电泳带评价RNA质量

实验材料：水稻幼嫩叶片

苯酚/氯仿反复抽提，价廉但质不优，尤其是对多酚等含量高的材料不适蛋白酶/SDS配合酚、氯仿抽提的方法强变性剂法。硫氰酸胍，盐酸胍等，可配合氯化铯离心或有机溶剂提取。

TrizolReagent提取方法：75％乙醇（inDEPC-treatedwater)氯仿异丙醇（RNA专用）RNase-freewater：DrawwatertoRNase-freeglassbottles.Adddiethylpyrocarbonate

（DEPC）to0.1%.Letstandovernightandautoclave.防止外源RNase的污染：

应戴口罩和手套，环境洁净；玻璃器皿180ºC烘烤3hrs以上；塑料制品DEPC水清洗，蛋白质变性剂处理；一次性用品如tube,tip等使用新的，无RNA酶的产品。RNA抽提前应准备的其它试剂及物品：操作步骤（一）液氮磨样，每管分装0.1克样品；每管加1毫升Trizol

试剂（样品体积不超过Trizol

试剂体积的10％），迅速混匀（若样品较多可先将混好的样品置于冰上）；室温下净置5－10分钟以利于核酸蛋白质复合体的解离；加200µl的氯仿，用手剧烈摇荡15秒，室温下静置5分钟左右；4.2-8℃

，12000×g离心10-15分钟；将水相（上清）转入一新离心管，加0.5ml异丙醇室温下沉淀10分钟；2-8℃

，12000×g离心15分钟；弃上清，加1ml75％乙醇清洗RNA，振荡片刻后（务必使沉淀悬浮起来，以确保洗涤干净），7500×g离心5分钟，小心弃上清；室温静置5－15分，使RNA沉淀恰好干燥，加入20µlDEPC水溶解，保存于-70℃

。取2µl琼脂糖电泳检测RNA质量。操作步骤（二）In1×MOPS80—150V40min—1h30min电泳有溴化乙锭存在时，电泳后28SrRNA和18SrRNA在紫外灯下应当很清楚的看得到，还应当有一条由tRNA，5.8SrRNA和5SrRNA组成的较模糊的迁移较快的带。如果RNA没有降解，28SrRNA的亮度应当是18SrRNA的2倍，且这两条带都没有弥散现象。WhatdoesgoodorbadtotalRNAlooklikewhenseparatedingel?CallusLeafDegradationContaminantGoodRNA产量低的原因样品研磨不彻底，没有混匀，裂解不彻底RNA没有完全溶解DNA污染的原因样品太多，所加试剂相对太少用来分离RNA的样品中含有机溶剂（乙醇，DMSO等），或碱溶液等RT-PCR(ReversetranscriptionPCR)

实验目的：学习RT-PCR的原理及其操作过程实验材料：水稻幼嫩叶片RNA

单链多肽，具有聚合酶和较弱的RNaseH活性（或RNaseH－），最适反应条件：37°C,pH8.3,反转录酶：依赖于RNA的DNA聚合酶鼠白血病毒反转录酶M-MLV：禽成髓细胞反转录酶AMV2条多肽链，具有聚合酶活性和较强的RNaseH活性，最适反应条件41-45°C，pH8.3比pH7.6活性高RNaseH：催化DNA-RNA杂合体的RNA部分的降解，产生不同链长带3‘羟基和5’磷酸末端的寡核苷酸。RibonucleaseInhibitor单一多肽，可与RNaseA形成1：1非共价的复合物，从而使RNA酶失活。不能在变性剂如SDS、胍等存在的情况下使用。活性表达需要巯基化试剂（DTT）本实验以水稻叶片RNA为材料，检测β-actin基因的表达。实验中设置一个阴性对照：不加模板RNA，主要是消除DNA及PCR试剂方面引起的假阳性；同时以叶片DNA为阳性对照，检验PCR试剂和扩增过程是否有问题实验设计操作步骤（一）RNAPreparationPreparetheplanttotalRNAbyTRIzolReagent.DilutetheTotalRNAtothefinalconcentrationof1g/lbyDU640..Combinethefollowingina0.5mlsterileeppendorftube:TotalRNA 3l

(2-5g)

RNase-freeDNase

１l(１u/l)10×DNase

buffer 1laddDEPC-treatedddH2O5lIncubateat37℃for15min,then70℃for10min.操作步骤（二）ReverseTranscriptaseReaction

Add1l500g/mloligo(dT)15primer,mixthecontentsofthetubebygentlyvortexingandcollectthereactionbybriefcentrifugation.Heatthemixtureat70℃drybathfor10minutes,thenputonicefor5minutes.Addthefollowingcontents: 5×firststrandbuffer 4l 0.1MDTT 2l 10MdNTP 1lM-MLV(200U/l)

1l

操作步骤（二）4.incubateat37℃for1h.(Thetotalvolumeshouldnowbe20l)5.Inactivethereactionbyheatingat70℃for10min,thenadd20lddH2OandthefirststrandofcDNAcanbeusedasatemplatetoamplificationinPCR.6.ToremovetheRNAcomplementarytothecDNA,add1l(2units)ofRNaseHandincubateat37℃for20min.PCR技术PCR（多聚酶链式反应〕是一种体外扩增特异DNA片段的技术，是分子克隆技术中最常用的技术之一，是在模板DNA、引物和dNTPs的存在下依赖于DNA聚合酶的酶促反应。PCR技术的特异性取决于引物和模板结合的特异性。反应分为变性（denaturation，）退火（annealing）、延伸（extension）三步，经过一定的循环，介于两个引物之间的特异DNA片段得到大量扩增。TheInventionofPCRInventedbyKaryMullisin1983.Firstpublishedaccountappearedin1985.AwardedNobelPrizeforChemistryin1993.模板DNA：一般102－105个拷贝Mg2＋：Mg2＋能影响反应的特异性和扩增片段的产率。一般反应体系中1.5-2.5mmol/L反应反冲液：使TaqDNA聚合酶的作用环境维持偏碱性。dNTP：在PCR反应体系中其浓度一般为20－200mol/L，浓度过高、过低都不利。TaqDNA聚合酶：在70－75C具最高活性。具有5’－3’的聚合酶活性和5’－3’的外切酶活性，无校正功能。是镁依赖性酶。引物：PCR反应中引物浓度一般为0.1－0.5mol/L。PCR反应体系中的主要成分及其作用：变性：模板DNA由双链变成单链，使有利于与引物结合。可根据模板的复杂程度调整变性温度和时间，一般情况下94C30秒可使各种复杂的DNA分子完全变性（过高的温度或高温持续时间过长，可对TaqDNA聚合酶活性和dNTP分子造成损害）。退火：变性的DNA快速冷却至40－60C可使引物和模板DNA发生结合。可根据引物的长度和G＋C的含量选择复性温度。退火时间30秒。延伸：一般是70－75C，此时TaqDNA聚合酶活性最高。<1kb，1分钟；>1kb的可适当延长时间。循环次数：理论上20－25个循环PCR产物的累计即可达到最大值、实际操作中25－30较合理。循环次数越多，非特异性产物的量也会增加。循环条件的设定：ThermalCyclersPCRmachineavailablefrommanysuppliers.Manyblockformatsandmulti-blocksystems.Reactionsintubesor96-wellmicro-titreplates.在冰上配制下列反应体系: FirststrandcDNA 1l

TaKaRaExTaq(5u/1l) 0.5l 10×ExTaqbuffer 2l

dNTPmixture(2mM) 2l PrimerF(10mM) 0.5l PrimerR(10mM) 0.5l ddH2O 13.5l混匀后，短暂离心，每管加一滴矿物油。操作步骤（三）PCRPCR反应循环条件设置：

根据引物及基因的表达水平设置循环参数：如引物序列、引物长度、扩增片段的长度及mRNA的丰度等检测：加2l溴酚蓝，混匀，取15l反应产物电泳；在1%的琼脂糖凝胶上点样电泳；EB染色，紫外观察。

RT反应程序：94度45秒，58度45秒，72度60秒，27CYCLES.Genome:750bpcDNA:250bp2KBcDNAZH11H2OGAL4反应程序：94度45秒，58度45秒，72度60秒，30CYCLES.Size:630bpTaq酶过多；Mg2+浓度不合适；引物浓度过高或设计不合理；复性温度过低；循环次数过多；模板量过多；PCR产物的电泳检测时出现拖带或非特异性扩增带的可能原因：PCR扩增产物电泳检测OptimisingtheAnnealingTemperaturePrimershaveacalculatedannealingte