微工第四章课件

4优良菌种选育目的防止菌种退化提高生产能力提高产品质量开发新产品菌种选育工业化生产自然选育诱变育种杂交育种原生质体融合DNA重组抗噬菌体菌株优良的生产菌种的基本特性：

（1）具有在较短的发酵周期内产生大量发酵产物的能力。

（2）在发酵过程中不产生或少产生与目标产品性质相近的副产物及其他产物。

（3）生长繁殖能力强，有较强的生长速率，产生孢子的菌种应该具有较强的产孢子能力

（4）能够高效地将原料转化为产品；（5）有利用广泛来源原材料的能力，并对发酵原料成分的波动敏感性较小。工业菌种的育种方针

运用遗传学原理和技术对某个用于特定生物技术目的的菌株进行的多方位的改造。通过改造，可使现存的优良性状强化，或去除不良性质或增加新的性状。

菌种选育

菌种选育的方向是选育“吃粗粮”、耐高温、生长快、代谢旺、产量高、质量好、无毒性的优良菌株。自然选育诱变育种杂交育种(有性、准性)原生质体融合育种基因工程育种

菌种选育方法

自然状态下，碱基对发生自然突变的机率为10-8～10-9自然突变正突变负突变生产上希望看到的，对生产有利。

一种是我们生产上所不希望看到的，表现为菌株的衰退和生产质量的下降。

多因素低剂量的诱变效应：自然环境中存在着低剂量的宇宙射线、各种短波辐射、低剂量的诱变物质和微生物自身代谢产生的诱变物质等的作用引起的突变。互变异构效应:

指四种碱基第六位上的酮基或氨基的瞬间变构，会引起碱基的错配。例如，T和G可以酮式或烯醇式出现，C和A可以氨基式或亚氨基式出现。工厂应用：简单易行，最大缺点：效率低、进展慢。制备单孢子（单细胞）悬液适当稀释在固体平板上分离挑取部分单菌落进行生产能力测定经反复筛选以确定生产能力更高的菌株替代原来的菌株一般习惯上将自然选育称为菌种的分离纯化。自然选育操作步骤：

4·2·1诱变育种的原理●诱变育种：指用诱变剂处理微生物细胞，提高基因突变频率，通过适当的筛选方法获得所需高产优质菌种的育种方法。诱变剂：能够提高生物体突变频率的物质称为诱变剂●诱变剂种类：物理诱变剂化学诱变剂生物诱变剂诱变剂的共性原则：1)化学药剂对细菌的诱变率与其对动物的致癌性成正比.

2)超过95%的致癌物质对微生物有诱变作用.3)90%以上的非致癌物质对微生物没有诱变作用.

目前发酵工业中应用的生产菌株大部分是诱变育种得来的。以青霉素为例，1943年开始生产时的效价仅为40U/ml，通过多次诱变育种现已达50000-100000U/ml。虽然遗传工程等新的育种方法迅速发展，但诱变育种仍是目前广泛使用的育种手段。(一)出发菌株的选择1．自然界新分离的野生型菌株，对诱变处理较敏感，容易达到好的效果。2．在生产中经生产选种得到的菌株与野生型较相像，也是良好的出发菌株。3．每次诱变处理都有一定提高的菌株，往往多次诱变能积累较多的提高。4．出发菌株开始时可以同时选2～3株，在处理比较后，将更适合的出发菌株继续诱变。

5．根据采用的诱变剂或根据细胞生理状态或诱变谱选择诱变剂，因为同一诱变剂的重复处理会使细胞产生抗性，使诱变效果下降。有的诱变剂是作用于营养细胞，就要选对数期的细胞：有的作用于休止期，就可选用孢子。

(二)处理菌悬液的制备这一步骤的关键是制备单细胞和单孢子状态的、活力类似的菌悬液，为此要进行合适培养基的培养，并要离心，洗涤，过滤。因为1）分散状态的细胞可均匀地接触诱变剂2）可避免长出不纯的菌落。如紫外线、X-射线、-射线、快中子、超声波、微波等硫酸二乙酯(DES)、亚硝基胍(NTG)、亚硝酸(NA)、氮芥(NM)、羟胺、ICR类等诱变剂物理诱变剂化学诱变剂(三)诱变处理单一诱变剂处理复合处理1）两种或多种诱变剂先后使用2）同一诱变剂重复处理3）两种或多种诱变剂同时使用

菌种

单独处理诱变剂突变率（%）

复合处理诱变剂突变率（%）土曲霉紫外线X-射线21.319.7紫外线+X-射线42.8土曲霉氮芥（0.1%）紫外线不明显4.7氮芥+紫外线11.0链霉菌紫外线-射线31.035.0紫外线+-射线43.6金色链霉菌二乙烯三胺硫酸二乙酯紫外线6.061.7812.5二乙烯三胺+紫外线硫酸二乙酯+紫外线26.635.9诱变剂的复合处理及其协同效应

(四)中间培养

由于在发生了突变尚未表现出来之前，有一个表现延迟的过程(生理延迟)，需3代以上的繁殖才能将突变性状表现出来。这个过程对今后的筛选和获得稳定菌株都是极为重要的。

方法：

让变异处理后细胞在液体培养基中培养几小时，以让细胞的遗传物质复制，让细胞繁殖几代，以得到纯的变异细胞。这样，隐性的变异就会显现出来。若不经液体培养基的中间培养，直接在平皿上分离就会出现变异和不变异细胞同时存在于一个菌落内的可能，形成混杂菌落，以致造成筛选结果的不稳定和将来的菌株退化。

在初筛过程中，一般采用观察初筛菌落在平板上的生理效应所呈现的变色圈、透明圈、生长圈或抑菌圈的大小来进行初步测定。初筛

要求迅速地从大量菌株中挑选出较好的一些菌，主要应着眼于尽量扩大挑选范围。降解纤维素产生产透明圈例如，测定突变株淀粉酶活力，可把待测菌株的培养液以相同大小和条件浸泡的滤纸片点植于淀粉平板上，经培养后滴加碘液再仔细观察并测定其透明圈的大小。

部分微生物菌株经过诱变处理后，变异菌株的菌落形态与生理特性、生产性能变化有一定的相关性，可在初筛时加以利用。赤霉素产生菌色素暗红加深，产量上升红霉素产生菌有颜色产量下降灰黄霉素产生菌野生菌株高产菌株碱性脂肪酶产生菌野生菌株高产变异株复筛

在初筛缩小了的范围中选出产量最高的1-2个菌株，主要着眼于在接近生产条件的情况下精确地测定出菌株的生产性状。

复筛一般是将初筛所得到的菌株接种到三角瓶中做摇瓶培养，然后对其培养液进行定量分析测试。第一轮：1个出发菌株诱变处理200个单细胞菌株50株5株初筛每株1瓶复筛每株4瓶第二轮：5个出发菌株诱变处理40株40株40株40株40株50株5株初筛每株1瓶复筛每株4瓶

在诱变育种过程中要正确处理出发菌株，诱变因素和筛选条件三者的关系。这三者之间在诱变育种过程中有紧密的内在联系。

经诱变后，菌种的性能有可能发生各种各样的变异，如营养缺陷、抗性突变、形态变异、生长温度变异等，这些变异均可用各种方法筛选出来.几种重要突变株的筛选1）营养缺陷型突变菌株的筛选

●机理：底物产物1产物2E1E2E3E4●目的：在分支代谢途径中：解除反馈调节，使另一分支代谢途径中的末端产物积累。abc1c2◆

影印培养法夹层培养法点植法等影印培养法检出营养缺陷型夹层培养法检出营养缺陷型点植法检出营养缺陷型2）抗反馈阻遏和抗反馈抑制突变菌株的筛选●抗反馈阻遏机理：调节基因或操纵基因发生突变，产生的阻遏蛋白不能和终产物结合或结合后不能作用于已突变的操纵基因。●抗反馈抑制机理：结构基因发生突变，变构酶不再具有结合终产物的能力，但仍具有催化活性。●筛选模型：抗结构类似物突变反馈抑制反馈阻遏→酶的活性→酶的合成◆

结构类似物与末端产物结构相似，能与阻遏蛋白或变构酶结合，阻止产物的合成，引起反馈调节作用；但不能代替末端产物参与生物合成HD:高丝氨酸脱氢酶HT:高丝氨酸转乙酰酶AK:天冬氨酸激酶结构类似物抗性：Lys的结构类似物AEC黄色短杆菌中赖氨酸的合成调节机制3）组成型突变株的筛选

●机理：改变菌种的遗传特性，解除对诱导物的依赖。

●筛选模型：设计某种有利于组成型菌株生长，并限制诱导型菌株生长的培养条件，造成组成型菌株生长的优势或适当的分辨两类菌落的方法，选出组成型突变菌株。

●

举例说明：培养基中加入诱导酶抑制剂。

例如

可在培养基中加入抑制诱导酶合成的物质，使组成型菌株处于选择优势以-半乳糖苷酶为例：含有乳糖的培养基中加入抑制物邻硝基--D-岩藻糖苷-半乳糖苷酶的合成被抑制，因此诱导型菌株不能利用乳糖，故不能生长而组成型菌株能合成该酶，利用乳糖生长，使组成型菌株被富集4）抗性突变株的筛选

●抗生素抗性突变

●抗噬菌体菌株的选育

●条件抗性突变

●敏感突变抗生素抗性突变例：衣霉素可抑制细胞膜糖蛋白的合成，改变细胞的分泌能力，有助于胞内物质分泌到胞外筛选枯草芽孢杆菌的衣霉素抗性突变株，使α-淀粉酶的产量比亲株提高了5倍。◆筛选检出抗药性突变株可用梯度培养皿法温度敏感突变

指仅在某个温度范围内显示与野生型不同表型的突变型