绿色银光蛋白课件

“绿色荧光蛋白”让未知世界显影Osamu

Shimomura

Martin

Chalfie

Roger

Y.

Tsien

（钱永健）2008年10月8日，美Woods

Hole海洋生物学实验室的下村修、哥伦比亚大学的马丁-沙尔菲和加州大学圣地亚哥分校的钱永健三位美国科学家，因为在水母中发现和研究绿色荧光蛋白而获得2008年诺贝尔化学奖。

GFP发现之旅；1962年，下村修首次从维多利亚多管水母Aequorea

victoria中分离出GFP。他发现该蛋白在紫外线下会发出明亮的绿光。

1992年，道格拉斯·普瑞舍克隆并测定了水母中绿色荧光蛋白的基因。1993年，Martin

Chalfie证明了GFP作为多种生物学现象的发光遗传标记的价值。在最初的一项实验中，他用GFP使秀丽隐杆线虫的6个单独细胞有了颜色。

1994年，钱永健开始改造荧光蛋白，培育出黄色、蓝色、绿色、红色等多种颜色的荧光蛋白，理解了GFP发出荧光的机制。世界上目前使用的荧光蛋白大多是钱永健实验室改造后的变种。令在同一时间跟踪多个不同的生物学过程成为现实。钱永健还开发了检测荧光蛋白的荧光探针技术。GFP简介维多利亚多管水母生活在北太平洋寒冷水域。这种水母体内含有一种生物发光蛋白质——aequorin，它本身发蓝光。GFP能把这种光转变成绿色，也就是当水母容光焕发的时候我们实际看到的颜色。GFP的纯溶液在典型的室光下呈黄色，但是当被拿到户外的阳光下时，它会发出鲜绿的颜色。这种蛋白质从阳光中吸收紫外光，然后以能量较低的绿光形式发射出来。GFP结构蛋白序列SKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTFYLQCFARYPDHMKRHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSQNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSYQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGIGFP由238个氨基酸残基组成，分子量约为26.9kDa。GFP结构GFP结构GFP结构GFP结构GFP晶体结构显示,蛋白质中央是一个圆柱形水桶样结构,长420nm,宽240nm,由11个β片层组成桶状构成疏水中心和由4个α螺旋以及其中一个α螺旋包含着的发光基团构成。

GFP结构GFP结构桶的顶部由3个短的垂直片段覆盖,底部由一个短的垂直片段覆盖,对荧光活性很重要的生色团则位于大空腔内。严密的桶形结构保护着荧光基团，防止它被周围环境淬灭。实验表明GFP荧光产生的前提是桶状结构完整性,去除N端6个氨基酸或C端9个氨基酸,GFP均会失去荧光。这是由于生色团形成的效率较低,而且形成过程受外界环境影响较大的缘故GFP独特的结构由238个氨基酸组成“像一个罐头”每个单体由11个反向平行的-sheets围绕，4个-helix组成，其中一个-helix位于“罐头”内大约长420nm,宽240nm荧光基团位于核心的-helixGFP结构由α螺旋含有发光基团由第65、66、67位丝氨酸、酪氨酸、甘氨酸形成生色团构成。翻译出的蛋白质折叠环化之后,在O2存在下,分子内第67位甘氨酸的酰胺对第65位丝氨酸的羧基的亲核攻击形成第5位碳原子咪唑基,第66位酪氨酸的α2β键脱氢反应之后,导致芳香团与咪唑基结合。这样,GFP分子中形成对羟基苯甲酸咪唑环酮生色团,该过程可以自动催化完成。1.两个野生型GFP吸收紫外光和蓝光，发射绿光，在395nm出现一个最大吸收峰,在470nm出现一个小的吸收。出现两个吸收峰的原因可能是由于存在阴性和中性两个不同化学结构的生色团。由于存在两个吸收峰,野生型GFP可以被标准的长波紫外源和异硫氰酸荧光素(fluoresceinisothiocyanate,FITC)所激发。GFP性质2.能够在单独或者与其它蛋白融合时产生荧光。而其最显著的特点是除了氧气之外，不需要其他辅酶，不需底物。3.Baird等研究人员发现，虽然GFP有紧密的桶状结构和形成发光基团所必需的复杂的翻译后修饰，当对GFP的N端和C端部分交换重排并以一段间隔重新连接时，GFP仍然具有荧光。并且，GFP的某些位点可以耐受整段蛋白的插入，在结合金属离子的黄色荧光蛋白（YellowFluorescentProtein,YFP，GFP的突变体）中145位插入锌指结构能使荧光强度多倍提高。4.GFP作为报告分子具有很多优点，如实现了活细胞内基因表达和定位、荧光为蛋白的内在属性、荧光发射无种属依赖性、荧光信号对光漂白具有高抗性、检测时不需要附加辅助因子、在细菌和真核细胞中表达无明显毒性、具有高度稳定性。另外，细胞内GFP的检测也比较简单，如利用紫外灯、荧光显微镜、荧光激活细胞分选仪等，现有报道利用实时定量PCR进行GFP荧光定量测定的方法。荧光互补不仅仅在蛋白质相互作用中有所应用，Jeong等研究人员以与底物结合时会有典型的构象变化麦芽糖结合蛋白（MBP）为模型，将MBPC端和N端分别与GFP片断融合。结果证明加入底物的一组显示出比对照组更强的荧光，由此提出split-GFP在观察蛋白构型变化中的应用。另外，一种重要的荧光成像技术—荧光共振能量转移（fluorescenceresonanceenergytransfer,FRET）也被广泛应用。它能够利用GFP及其突变体青色荧光蛋白（CFP）、黄色荧光蛋白（YFP）等，定时、定量、定位、无损伤地在活细胞内检测大分子构象变化、蛋白之间相互作用、信号传递途径。2.GFP在信号转导中的应用研究发现,某些突变的GFP能够发生荧光共振能量转移（FRET），FRET对于两个荧光分子相互间的定位和距离高度敏感(在纳米范围内)。两个分子间微小的线性或空间定位关系的破坏可以强烈地改变能量转移的效率。通过计算供应分子对于接受分子荧光释放的比率来观测细胞动态变化的指标。它消除了GFP分子在绝对浓度、细胞的厚度、激发源的能量度以及检测的绝对效率等的影响。利用FRET可以作成GFP依赖的生物探针,现已有研究人员设计大分子或分子配对物来改变GFP之间原有生理信号反应的FRET。在上述实验基础上,研究人员设计了FRET依赖的Ca2+敏感指示剂,该实验发现,通过改变两个GFP之间的距离,可增加FRET。另有一些研究人员,并没有把两个GFP融合在一个单一结构中,而是把一个GFP融合到CaM上,另一个GFP融合到CaM结合区域。结果发现,当Ca2+结合到CaM上,出现分子间异源二聚体,两个GFP足够接近而产生FRET。这个实验提示了FRET不仅可以在分子内发生,而且还可在分子间发生。GFP的结构虽然具有高度完整性,但是实验中发现,在GFP中某些确定的位置,插入外源基因,完全没有丧失其荧光性。当把CaM插入黄色荧光GFP突变体中,得到Ca2+传感器,当Ca2+结合到CaM上,导致生色团去质子化,使荧光强度增加7倍。当在黄色荧光GFP中插入一个Zif268锌指结构,可以得到传导Zn2+的GFP,结果发现荧光少量增加,为改变前的1.7倍,Kd值约0.4mmol。插入外源基因致使GFP荧光敏感性增强的现象,提供了一个获取永久编码传感器去监测细胞信号转导的新路径。改进GFP的应用前景

蓝色荧光蛋白、青色荧光蛋白，绿色荧光蛋白，黄色荧光蛋白，褐色。。。。。。1.提高了GFP的光谱性质，2.提高荧光强度3.提高光稳定性4.颜色突变5.pH敏感的突变体

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