酵母单杂交 试验步骤总结

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总体积5.0?l

注：步骤⑤中的试剂可在步骤②之前加好置于冰上。此步是cDNA合成的起始关键步骤，变性后的RNA/引物mix冰上放置的时间不应超过2min。

⑥假使用的是CDSIII/6随机引物，25-30?C保温10min。假使用的是CDSIII引物，省略此步，进行步骤⑦。

⑦42?C保温10min。

⑧参与1?lSMARTIIIoligo，充分混合，42?C保温1h。

⑨75?C保温10min终止第一链的合成。

⑩降至室温，参与1?lRNaseH（2U）。

1137?C保温20min。

12cDNA第一链合成产物应于-20?C保存，可用3个月。

（2）longdistancePCR（LD-PCR）合成cDNA其次链

根据合成cDNA第一链时使用的RNA量，下表给出了进行LD-PCR时最正确的热循环数。使用的热循环数越少，非特异性PCR产物越少。

表2RNA量与最正确热循环数

总RNA/?g1.0-2.00.5-1.00.25-0.50.05-0.25

PolyA+RNA/?g

0.5-1.00.25-0.50.125-0.250.025-0.125

循环数15-2020-2222-2424-26

⑴LD-PCR反应混合物中参与如下物质（每个样品做2个100?l体系，对照做1个100?l体系）：

First-strandcDNA（fromprotocolA）2?lDeionizedH2O70?l10×advantage2PCRbuffer10?l50×dNTPmix2?l5’RACE引物2?l3’RACE引物2?lMeltingsolution10?l50×advantage2polymerasemix2?l总体积100?l

⑵依照以下程序进行PCR反应：1个循环95?C30sX个循环95?C10s68?C6min1个循环68?C5min

⑶取7?lPCR产物用1.2%的琼脂糖凝胶检测，检测时使用1kbDNAladder。

（2）使用CHROMASPIN+TE-400柱纯化dscDNA

⑴为每一个要纯化的cDNA样品准备一个CHROMASPIN+TE-400柱。

⑵将纯化柱翻转几次，充分悬浮gelmatrix。

⑶移去柱的顶盖和底盖，将柱放入2ml收集管中。

⑷将柱放入离心机，700g离心5min以消除平衡缓冲液，弃掉收集管中的液体。

⑸将柱放入新的收集管中，把cDNA加到gelmatrix的中央，切勿使样品沿柱的内壁流下。

注：加到边上易使样品沿柱内壁流下，易混有小片段cDNA。

⑹700g离心5min，纯化的cDNA收集到管中。

⑺将两个纯化的cDNA样品合并到一管，测量体积。

⑻参与1/10体积3mol/L醋酸钠（pH5.3），混匀。

⑼参与2.5倍体积无水乙醇。

⑽-20?C冰冻1h。

⑾室温，14000r/min离心20min。

⑿防备弃去上清液，切勿碰见沉淀。

⒀14000r/min瞬时离心，去除残留上清液。

⒁沉淀于空气中枯燥10min。

注：一般枯燥至无乙醇味，不可过度枯燥，否则很难溶解。

⒂用20?l灭菌去离子水溶解沉淀，此cDNA可用来进行同源重组构建文库。纯化后的cDNA用1%的琼脂糖电泳检测。

5构建并筛选酵母单杂交文库（cDNA融合表达文库的构建及筛选）（1）构建并在SD/-Leu/AbA培养基上检测Y1HGold[Bait/AbAi]菌株。

注：AbA的浓度根据构建诱饵载体时转入酵母抑制本底表达时的浓度而定。

（2）按SMARTtechnology步骤合成dscDNA，其浓度为2-5?g/20?L。（3）用YeastTransformationSystem2的方法转化酵母，在转化体系中参与如下

物质：

①cDNA文库转化Y1HGold[Bait/AbAi]菌株20?lSMART-amplifieddscDNA（2-5?g）6?lpGADT7-Rec，（SmaI-linearized）（3?g）②Y1HGold[53/AbAi]的转化5?lp53fragment（125?g）

2?lpGADT7-Rec，（SmaI-linearized）（1?g）

将转化体系分别稀释至1/10、1/100、1/1000、1/10000后，各取100?l涂100mm平板。

文库转化涂SD/-Leu和SD/-Leu/AbA平板，对照p53转化涂SD/-Leu和SD/-Leu/AbA200平板。

（4）将剩余的所有文库转化混合物（约15ml）涂在150mmSD/-Leu/AbA平

板上，每板涂150?l。（5）倒置培养3-5d。

（6）3-5d后，通过统计SD/-Leu100mm平板上的克隆数目来计算筛选的克隆

数。

注：所筛选的克隆数至少应当达到1百万，否则会降低筛选到目的产物的可能性。

筛选的克隆数=[cfu/mlonSD/-Leu]×[dilutionfactor]×[resuspensionvolume（15ml）]

例如：resuspensionvolume=15mlPlatingvolume=100?l

250coloniesgrewonthe1/100dilutiononSD/-Leuplates

Thenumberofclonesscreened=250cfu/0.1ml×100×15ml=3.75million

（7）预期结果

阳性对照试验：SD/-Leu和SD/-Leu/AbA200培养基上的克隆数相近。文库筛选试验：根据SD/-Leu平板上的克隆数计算所筛选的克隆数，其结果应大于1百万且SD/-Leu/AbA平板上的克隆数远远少于1百万，阳性克隆数目取决于诱饵序列。

6阳性克隆的鉴定及cDNA质粒的分开（1）阳性克隆重新划线培养，进行表型确认

①将阳性克隆在SD/-Leu/AbA培养基上重新划线，产生新的单克隆。

②2-4d后，选择能够正常生长的克隆进行后续分析。

（2）酵母克隆PCR消除重复克隆

①用MatchmakerInsertCheckPCRMix2（Cat.No.630497）进行PCR，对插入到pGADT7载体中的cDNA片段进行扩增。PCR管中参与以下反应物：MatchmakerInsertCheckPCRMix25?lH2O/Yeast25?l总体积50?l

②按下述程序进行PCR反应：

94?C1min98?C10s68?C3min

③PCR产物在1%的琼脂糖凝胶上进行电泳分析。产物不是单一的条带很正常，这说明在同一酵母细胞不存在一种捕获载体

注：为了确认大小相近的条带是否是同一种插入片段，用AluI或HaeIII或者其它常用的限制性内切酶消化PCR产物，产物用2%的琼脂糖凝胶进行电泳分析。

④假使大量的克隆含有同一插入片段，则另取50个克隆进行PCR分析。

⑤为了快速验证克隆，PCR产物可经过纯化后用T7引物测序。

（3）阳性cDNA质粒的分开获取①酵母中文库质粒的分开。

与转化的大肠杆菌不同，转化的酵母细胞可以含多种相关质粒，这就意味着阳性克隆里不只含有能激活AbAr报告基因的质粒，还可能含有一种或多种不表达相互作用蛋白的cDNA质粒。假使不事先将非互作质粒分开出去而直接通过转化大肠杆菌获取质粒，那么很有可能获取到非相互作用的质粒。为了增加获取阳性克隆捕获质粒的几率，可以将阳性克隆在SD/-Leu/AbA培养基上重复涂布2-3次，每次都挑取单一的克隆进行下一步涂布。

②从酵母中获取阳性cDNA质粒

为了鉴定阳性互作相关的基因，用EasyYeastPlasmidIsolationKit（Cat.No.630467）从酵母中获取阳性质粒。

③转化Ecoli并分开阳性cDNA质粒

用常用的克隆菌株对阳性cDNA质粒进行克隆，用LB加100g/mlampicillin进行选择。

（4）鉴别阳性和假阳性互作

酵母单杂交筛选可能会检测到假阳性，用以下标准可以区分阳性和假阳性阳性：正确的诱饵序列和捕获物都是激活AbAr报告基因所必需的。假阳性：在诱饵序列突变的状况下，诱饵仍可以激活AbAr报告基因。用下述程序在选择培养基上对阳性和假阳性相互作用进行确认：①用YeastmakerTransformationSystem2的试剂和small-scale转化程序将100ng获取的捕获质粒转化到Y1HGold[Bait/AbAi]和Y1HGold[Mutant/AbAi]菌株中。注：阳性对照和阴性对照试验应当一起进行。

②在SD/-Leu和SD/-Leu/AbA培养基上涂100?l转化混合物1/10和1/100的稀释物。

③30?C恒温培养3-5d后，预期结果如表所示。

表3阳性和假阳性相互作用验证结果

A阳性

样品酵母菌

Y1HGold[诱饵/AbAi]+靶

酵母菌

Y1HGold[突变/AbAi]+靶

B假阳性

样品酵母菌

Y1HGold[诱饵/AbAi]+靶

选择培养基SD/-LeuSD/-Leu/AbA

2mm明了的克隆

有有

选择培养基SD/-LeuSD