干细胞基础知识课件

干细胞研究及其应用1

InearlyOctober,aColoradocouplehasababynamedAdam,whoseumbilicalcordstemcellscouldcurehissix-year-oldsisterMolly'sFanconianemia.2000年十月发生在美国Colorado的一个故事23TwoseparatedblastomeressubjectedtoFISHanalysistocheckthechromosomes5一、干细胞的概念干细胞是一类具有自我更新和分化潜能的细胞。6干细胞研究成为继人类基因组大规模测序之后最具活力、最有影响和最有应用前景的生命学科研究领域，1999年干细胞研究被美国《科学》杂志评为1999年度世界十大科学之冠，2000年干细胞研究再次被《科学》杂志评为该年度世界十大科学成就之一。

组织工程是以干细胞研究为基础发展起来，它有望解决临床上急需的人工组织与器官问题，进展极为迅速，已经成为干细胞应用的主要方向。79101113二、干细胞的分类按分化潜能大小来分类:全能干细胞（Totipotentstemcell

）：它具有形成完整个体的分化潜能。如受精卵，胚胎干细胞。在生物发育学里，当精子和卵子结合成为受精卵后，一个受精卵分裂成为二个完全相同的细胞，二个细胞分裂成为四个细胞、八个细胞，在此时期此八个细胞中任何一个细胞单独放入成熟女性子宫中均可发育成为单独且完整之个体，此种细胞即称为totipotentstemcells。14事实上，所谓同卵双胞胎、三胞胎、四胞胎，即为受精卵分裂成二个或四个totipotentstemcells后，每个细胞单独分开发育，故成为双胞胎或四胞胎，至于三胞胎则为四个totipotentstemcells中的一个在发育过程中不幸未能成熟之故。Totipotentstemcells时期大约仅维持四天，即进入下一阶段之发育，形成特殊分化细胞，称为原始胚囊体（blastocyst）。15Pluripotentstemcells可分化成为特定组织的干细胞，如血液干细胞（heamatopoitentstemcells）、神经干细胞（neuralstemcells）、皮肤干细胞（skinstemcells）等等。这些特定之干细胞仅能发育成为特定组织之分化细胞（end-differentiationcellterminalcells），例如血液干细胞除可不断分裂成为相同之血液干细胞外，亦可接受不同刺激分化成为骨髓细胞和淋巴细胞；骨髓细胞则可进一步分化成为红血球、血小板、嗜中性粒细胞等。1718专能干细胞（multipotentstemcell

），这类干细胞只能向一种类型或密切相关的两种类型的细胞分化，如上皮组织、基底层干细胞、肌肉中的成肌细胞等。19根据干细胞组织发生的名称进行分类:胎胎干细胞造血干细胞骨髓间质干细胞肌肉干细胞成骨干细胞内胚层干细胞视网膜干细胞胰腺干细胞21三、胚胎干细胞221998年美国有两个小组分别培养出了人多能(pluripotent)干细胞：JamesA.Thomson在Wisconsin大学领导一个研究小组从人胚胎组织中培养出了干细胞株。他们使用的方法是：人卵体外受精后，将胚胎培育到囊胚阶段，提取innercellmass细胞，建立细胞株。经测试这些细胞株的细胞表面marker和酶活性，证实它们就是胚胎干细胞。用这种方法，每个胚胎可取得15－20个细胞用于培养。JohnD.Gearhart在JohnsHopkins大学领导另一个研究小组也从人胚胎组织中建立了干细胞株。他们的方法是：从受精后5－9周人工流产的胚胎中提取生殖母细胞(primordialgermcell)。由此培养的细胞株，证实具有多能干细胞的特征。

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InduceddifferentiationofhumanES-derivedcellsinculture.31Pluripotentmurineembryonicgermcellsidentifiedbyredstaining32Aculturedishcontaininghundredsofcoloniesofmurineembryonicgermcells.Eachred-stainedspotrepresentsanindividualcolonycomprisedofhundredsorthousandsofstemcells.331.ES细胞的全能性主要体现在以下几方面：①形成畸胎瘤。将ES细胞注入同源动物皮下可形成畸胎瘤，包括三个胚层细胞；②形成类胚体。培养ES细胞在非粘附底物中悬浮生长，或控制增殖细胞数目。能够使之生成类胚体，它是一个与畸胎瘤相似的多种系混杂的集合体、具有三个胚层组织；③直系分化。通过控制ES细胞生长环境，或遗传操纵特定基因表达，ES细胞可直接分化成某特定种系细胞，例如将神经决定基因NeuroD2和NeuroD3转人ES细胞，可使之分化为神经细胞；④形成嵌合体。将ES细胞注射到同种动物囊胚腔中后，可以形成嵌合体（chimera），ES细胞可以参与嵌合体各个器官包括生殖腺的发育。这是检验一个细胞系是否为ES细胞的标准。342.ES细胞生物学特性细胞形态结构及核型细胞的高度分化潜能碱性磷酸酶的表达胚胎阶段特异性细胞表面抗原的表达35

ES细胞形态结构及核型

(1)各种动物的ES细胞具有与早期胚胎细胞相似的形态结构，胞体体积小，核大，有一个或几个核仁。(2)ES细胞与卵圆柱期（eggcylinderstage）胚胎外胚层和胎儿生殖脊的原始生殖细胞类似。

(3)细胞中多为常染色质，胞质结构简单，散布着大量核糖体和线粒体，核型正常，保留了整倍体性质。正常ES细胞染色体正常，如发生异常则其很难发育分化形成动物个体。

36(4)ES细胞在体外分化抑制培养中，呈克隆状生长，细胞紧密地聚集在一起，形似鸟巢，细胞界限不清，克隆周围有时可见单个ES细胞和分化的扁平状上皮细胞。(5)ES细胞增殖迅速，每18—24h分裂增殖1次。(6)此外，其还可以在体外进行选择、操作、冻存。冻存的细胞可在需要时随时解冻，继续培养不失其原有特性，并且来自一个克隆的细胞具有同样的特征。37

ES细胞的高度分化潜能

ES细胞的全能性是其区别于成纤维细胞等体细胞的显著特点(1)ES细胞在体外需在饲养层细胞上培养才能维持其未分化状态，一旦脱离饲养层就自发地进行分化。(2)在单层培养时细胞自发分化成多种细胞，悬浮培养中：“简单类胚体”“囊状胚体”细胞分化物。38(3)ES细胞可进行诱导分化*用RA（维甲酸）作诱导90％以上的ES细胞分化为神经胶质细胞，*聚集培养的ES细胞诱导分化则可分化为有节律性收缩的心肌细胞。*将ES细胞注射到同源动物皮下，可形成组织瘤，其细胞组成可代表3个胚层细胞。*用ES细胞作核供体进行细胞核移植，可以得到可发育重构胚和动物个体。39

碱性磷酸酶的表达

许多资料表明，小鼠、大鼠的桑椹胚细胞和囊胚细胞均有碱性磷酸酶（AKP）表达，小鼠的EC细胞和ES细胞中均含有丰富的AKP。而在已分化的EC细胞和ES细胞中AKP呈弱阳性或阴性。猪、兔的桑椹胚和早期囊胚AKP呈阳性。因此，AKP常用来作为鉴定EC细胞或ES细胞分化与否的标志之一。40胚胎阶段特异性细胞表面抗原的表达

早期胚胎细胞表面均表达胚胎阶段特异性表面抗原（SSEA－1）。在胚胎的原始外胚层细胞、ES细胞、EC细胞和原始生殖细胞的表面均可检测到SSEA－1的表达。小鼠SSEA－1的表达自8细胞期开始，直到原始外胚层形成期。早期囊胚ICM细胞全部呈强阳性，晚期囊胚中部分ICM呈强阳性，部分呈弱阳性，少部分为阴性。因此，SSEA也常作为ES细胞鉴定的一个标志。413.ES细胞的鉴定--细胞的形态结构--核型分析--碱性磷酸酶（AKP）染色--SSEA-I免疫荧光标记--分化能力检测体外分化试验体内分化试验嵌合体形成试验核移植试验42

ES细胞形态学鉴定

依ES细胞的形态结构（胞体体积小，核大、有一个或几个核仁）和生长特性（呈克隆状生长，细胞紧密聚集，形似鸟巢，界限不清）对ES细胞进行初步鉴定。43核型分析

ES细胞具有正常二倍体核型，可用核型分析进行检验44

碱性磷酸酶（AKP）染色

*常用快绿（FastGreenStaining)染色法，

*对照以已建系ES细胞（或小鼠的桑椹胚或囊胚）作为阳性对照，

*作用液中不含α-萘酚磷酸钠为阴性对照。

*结果判定阳性对照ES细胞染成棕色，阴性对照无色。小鼠3．5日龄胚胎ICM为强阳性。

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SSEA-I免疫荧光标记

第1抗体，SSEA－1（鼠抗ES细胞单克隆抗体），1:100稀释；第2抗体，羊抗鼠1：10稀释;封闭液，羊抗兔lgG。步骤①杜氏PBS洗3次,2％Triton作用20min；②再以杜氏PBS洗3次,封闭液中置20min；③以杜氏PBS洗3次，加第1抗体于4℃过液；④以杜氏PBS洗3次，加第2抗体于30℃温箱置30min；⑤再以杜氏PBS洗3次后用甘油PBS封片。样本在激光共聚焦图像系统下观察,结果依细胞是否出现荧光作出判断。46

分化能力检测体外分化试验体内分化试验嵌合体形成核移植474.胚胎干细胞的制备(1)直接由动物体内获取囊胚再分离ICM的方法，这样得到的囊胚数量少，质量也可能不高，由此会影响分离ES细胞的效率。(2)

卵细胞去核培养、转入体细胞核，体外培养，获得高质量的去透明带囊胚，由此囊胚进一步分离得到胚胎干细胞。484950目前已证明，小鼠、兔、羊。猪、牛等多种动物的桑椹胚以前以及囊胚的ICM细胞具有发育的全能性，因此桑胚胚或囊胚成为分离ES细胞的常用材料。ES细胞的分离早期胚胎的获取及处理方法原始生殖细胞的获取分化抑制物的选择,包括：饲养层（feederlopr），条件培养基（conditionedmedium，CM）和分化抑制因子（differentiationinhibitoryactivity，DIA）基础培养基的选择添加物的选用51胚胎干细胞（embryonicstemcell，ES细胞）也可被称为多能干细胞（pluripotentstemcell，PSC），是胚胎或原始生殖细胞经体外抑制分化培养后筛选出的具有发育全能性的细胞。其可以定向诱导分化为几乎所有种类的细胞，甚至形成复杂的组织和器官，其建系、体外扩增、定向诱导分化、调控机制、细胞性能、组织重构等方面的研究将在未来的人体发育、基因功能、药物开发、细胞治疗和组织器官替代治疗中发挥重要作用，并成为组织器官移植的新资源5.目前胚胎干细胞的研究52四、成体干细胞53

目前研究的成体干细胞（AdultStemCells）BoneMarrowHeamatopoieticStemCells(HSC)PeripheralBloodStemCells(PBSC)FetalLiverStemCellsUmbilicalCordBloodStemCellsNeuralStemCells

“StudiessuggestthatstemcellsindifferentadulttissuesmaybemoresimilarthanpreviouslythoughtandperhapsinsomecaseshaveadevelopmentalrepertoireclosetothatofEScells.”

Science,Volume288,Number5471,Issueof2Jun2000,pp.1660-166354造血干细胞HematopoieticStemCells，HSC，55造血干细胞作为干细胞研究与应用的突破口1.造血细胞是细胞增殖分化的最佳模型。2.造血干／祖细胞及各系血细胞的表面标志较为清楚，细胞表型特征可进行定量分析，且可分选。3.造血干细胞增殖及向各系分化的重要诱导因子、受体、信号转导、微环境等因素较为清楚。4.造血细胞发挥功能可相对游离，不需“生物支架”、神经、血管、外科移植等复杂的“下游”工艺，因此便于直接应用于临床。56IsolationofPrimaryandImmortalizedCD34–HematopoieticandMesenchymalStemCellsfromVariousSources

StemCells,Vol.18,No.1,1-9,January200057Previousworkwithmiceandhumanhadshownthatadultbonemarrowstemcellscouldformliver,aswellasbone,cartilage,tendon,nerveandothertissues.1,NeilTheiseetal.;"LiverfromBoneMarrowinHumans";Hepatology32,11-16,July,2000.2,MalcolmAlisonetal.;"CellDifferentiation:HepatocytesfromNon-HepaticAdultStemCells";Nature406,257,July20,2000.3,SusanOkie,"BoneMarrowStemCellsOfferHopeforLiverTherapies;StudyofTransplantsShowsaTransformation";WashingtonPost,June27,2000.4,Dr.DavidWhitehouse,"Stemcellspromiseliverrepair";BBC,July19,2000.5,NeilTheiseetal.;"Derivationofhepatocytesfrombonemarrowcellsinmiceafterradiation-inducedmyeloablation";Hepatology31,235-240,January,2000.6,BryonPetersenetal.;"Bonemarrowasapotentialsourceofhepaticovalcells";Science284,1168-1170;May14,1999.58五、人类干细胞研究的应用

1.ES系统已经成为基因功能研究的有效手段2.ES细胞系建立后，可从最根本上揭示人及动物发育过程中的决定基因3.ES细胞可作为评价新药及化学产品的毒性及效能的检测系统4.ES细胞有可能成为今后细胞替代疗法和组织器官移植的最佳来源59人类干细胞的分离和体外培养成功，包括胚胎干细胞和特定组织或血液之干细胞，不仅代表人类生命科学的一项里程碑，在医学技术和层次以及生物技术产业上的发展，更是一项深具潜力和无限商机的发现。干细胞之应用，可分成三大类：一、产生特定细胞或组织，作为细胞再生或组织移植和部份更新；二、对药物开发和研究产生新的理念，药物的安全性和有效性可以特定干细胞进行分析和筛选；三、基因表现、人类发育、疾病发生、癌症研究等。60一、产生特定细胞或组织，作为细胞再生或组织移植和部份更新：许多疾病的发生，与细胞功能的丧失或组织的坏死有关，例如糖尿病、Parkinson‘s和